专利名称：一种可同时识别OdDHL和BHL的核酸适体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用分子生物学技术筛选到一种可同时识别 N- (3-氧化十二烧酸基)-L-同型丝氛酸内酷[N- (3-oxododecanoyI) -L-homoserinelactone, OdDHL]和 N- 丁酸高丝氨酸内酯(N-butanoyl-L-homoserine lactone, BHL)的核酸适体及其应用，即一种可同时识别OdDHL和BHL的核酸适体及其应用。
背景技术：
:铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa, PA)是临床上最常见的一种非发酵革兰氏阴性致病菌。它对临床上应用的大部分抗生素都具有较强的耐药性，而且其耐药性的发展速度非常快，极易对新型抗生素产生耐药性，这极大地影响了其感染的治疗。研究表明，铜绿假单胞菌产生的各种严重感染与其毒力因子的释放密切相关，而铜绿假单胞菌的绝大部分毒力因子的表达都受其群体效应系统(quorum sensing，QS)的正性调控。N-(3_氧化十二烧酰基)-L_同型丝氨酸内酯(N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone, OdDHL)和 N-丁酸高丝氨酸内酯(N-butanoyl-L-homoserine lactone, BHL)分别是铜绿假单胞菌群体效应系统的Ias和rhl信号途径的信号分子。铜绿假单胞菌在生长过程中，不断向细胞外分泌这两种信号分子。当细菌周围环境中的信号分子浓度达到阈值时，便可激活这两个信号途径，从而启动铜绿假单胞菌毒力基因的表达，增强铜绿假单胞菌的致病性。研究发现，干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统可以抑制细菌毒力，降低其致病性，具有治疗感染的作用。目前，国外已经报道了一类可以与OdDHL结合的鼠源性单克隆抗体，亲和力在5nM 150nM之间。这类抗体在体外实验中可结合OdDHL分子，干扰铜绿假单胞菌的QS系统的信号转导，从而可抑制细菌毒力的表达。然而，这类抗体虽然具有治疗铜绿假单胞菌感染的潜在价值，但是这种抗体只能结合OdDHL和BHL两种分子中的一种，不能完全阻断PA的QS系统的激活，因而阻断PA毒力的表达的效果有限。此外，由于鼠源性抗体对人类来说是一种异种蛋白，如果直接将OdDHL的鼠源性单克隆抗体应用于人体的治疗，人体可产生针对鼠抗的抗体(人抗鼠反应)，从而与抗体结合并清除鼠抗，降低其的疗效。而且，直接应用鼠源性抗体还可能会诱发过敏反应，对患者造成损伤。由此，鼠源性抗体需要通过人源化改造后才能应用于人体，但是，鼠源性抗体的人源化改造是一个复杂、费时的过程，对技术要求相当高，而且在改造过程中容易导致抗体亲和力降低，甚至完全丧失，这导致鼠源性抗体应用于治疗的开发逐渐被放弃。与抗体相比，核酸适体是通过体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)从DNA/RNA文库中筛选出来的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸片段(ssDNA或ssRNA)，它具有高特异性和亲和力识别其靶标分子，一些与疾病密切相关的生长因子、酶、受体等物质均能成为核酸适体的靶标，而且其化学性质稳定，因此，亟需要研究和发展能够特异性抑制铜绿假单胞菌毒性的核酸适体，从而为疾病治疗的临床应用奠定基础。
发明内容:本发明的目的在于提供一种可同时识别OdDHL和BHL的核酸适体及其应用，它能够解决现有技术的不足，提供一种易于制备、节约成本、安全性好的能够与OdDHL和BHL均发生高亲和力和高特异性结合的核酸适体，以及上述核酸适体在制备抑制铜绿假单胞菌毒性的试剂中的应用。本发明的技术方案:一种可同时识别OdDHL和BHL的核酸适体，其特征在于:所述核酸适体的核苷酸序列为 GCAATGGTACGGTACTTCCTGTGGGTTAGTTTGACTCAAGGCTGGGCTTATACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA。所述核酸适体的应用，其特征在于:用于干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统的Ias和rhl信号途径，抑制群体效应系统调控的毒素分泌以及生物膜的形成，抗铜绿假单胞菌感染。 所述核酸适体的筛选方法，其特征在于它由以下步骤构成:1、OdDHL类似物与载体的偶联:OdDHL类似物与EDC分别溶于预冷的MES缓冲液中，配制成浓度均为20mg/ml的溶液。用MES缓冲液充分洗涤氨基化纳米磁颗粒，然后加入等体积的上述两种溶液，20°C反应2h。在此条件下，OdDHL类似物通过其分子中的羧基与氨基化纳米磁颗粒表面的氨基发生缩合反应，使分子偶联到氨基化纳米磁颗粒的表面；偶联结束后，用Tris-HCl缓冲液充分洗涤去除EDC及未偶联的OdDHL类似物后，获得的偶联有OdDHL类似物的氨基化纳米磁颗粒备用；2、随机单链DNA文库的设计:随机单链DNA文库是两端为固定的引物序列、中间为35个碱基的随机序列:5 ’ -GCAATGGTACGGTACTTCC- (N35) -CAAAGTGCACGCTACTTCGTAA -3 ’，其中，N35 表示 35 个随机核苷酸；3、核酸适体的筛选:3.1核酸适体与OdDHL类似物结合:3.1.1随机单链DNA文库的预处理:将步骤2设计的随机单链DNA文库于95°C变性5min后立即置于冰中lOmin，然后用选择缓冲液稀释至所需体积；3.1.2随机单链DNA文库中单链DNA与OdDHL类似物的结合:将经过预处理后的随机单链DNA文库与选择缓冲液(含pH7.4的50 mmol/LTris-HCl 含 1% BSA、0.01% 鲑鱼精 DNA、100 mmol/L NaClU mmol/L MgCl2,5 mmol/L KCl和0.05% Tween 20 )混合后，加入到步骤I获得的偶联有OdDHL类似物的氨基化纳米磁颗粒中，并于37°C缓慢颠倒混合温育45min,在磁力架上静置5min,再用洗漆缓冲液连续洗涤10次，去除未与靶分子结合及结合不牢固的单链DNA ；3.2 OdDHL 竞争筛选:向结合有核酸适体的纳米磁性颗粒中加入20mg/ml的OdDHL溶液，使OdDHL与OdDHL类似物竞争性结合核酸适体，与OdDHL结合的核酸适体即进入溶液中；3.3单链DNA的制备:取步骤3.2所得的溶液作为PCR模版，用第一引物和生物素标记的第二引物进行PCR扩增，扩增产物用PCR产物纯化试剂盒进行回收，然后加入到链亲和素磁纳米磁颗粒中，室温下温育30min后，上磁力架，去掉上清，向链亲和素纳米磁颗粒中加入200mol/L的氢氧化钠溶液，使目的单链DNA脱离纳米磁颗粒；然后在磁力架上静置后，取上清，用200mmol/L的盐酸调节pH值至6.8-7.2，所获得的单链DNA即可用于下一轮筛选；3.4核酸适体与OdDHL类似物结合:将步骤3.3所获得的核酸适体按照步骤3.1.2中所述方法与OdDHL类似物结合，并进行洗涤；3.5 BHL 竞争筛选:3.5.1向步骤3.4中结合有核酸适体的纳米磁性颗粒中加入20mg/ml的BHL溶液，使BHL与OdDHL类似物竞争性结合核酸适体，与BHL结合的核酸适体即进入溶液中；3.5.2单链DNA的制备方法同3.3:3.5.3将所得ssDNA按照步骤3.1-3.3进行下一轮筛选；3.6反向筛选:为了除去文库中可能存在的与氨基化磁珠本身结合的核酸适体，在每两轮正向筛选之间，进行一次反向筛选:将经过筛选后获得的单链DNA加入到未与OdDHL类似物偶联的氨基化纳米磁颗粒中，于37°C缓慢颠倒混合温育45min,使氨基化纳米磁颗粒与核酸适体充分结合，然后在磁力架上静置后，取上清，用上清进行下一轮筛选；3.7克隆测序:经过上述多轮筛选后，将筛选所获的PCR产物，克隆入T-A克隆载体，转化大肠杆菌DH5 α，取阳性克隆进行测序，制备核酸适体单链DNA并检测亲和力，最终获得核酸适体。本发明的优点和有益效果:1、本发明采用SELEX技术筛选到一种能够与OdDHL和BHL高亲和力结合的核酸适体，该核酸适体能同时结合OdDHL和BHL，因而具有高效干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统，抑制铜绿假单胞菌毒力基因的表达的作用。由于干扰细菌群体效应系统并不具有杀菌或者抑菌的作用，不对细菌的生长产生选择压力，因此，本发明的核酸适体既具有抗铜绿假单胞菌感染的潜力，又不存在诱发耐药性的风险。2、核酸适体仅需要通过简单的PCR技术即可大量制备，与抗体相比，核酸适体的生产过程更加简单，成本更低，无明显的毒性及过敏源性，而且核酸适体是一种DNA分子或者经过修饰后的RNA，其理化性质相当稳定，无需特殊条件即可以稳定保存。另一方面，单克隆抗体的分子量为160KD,而核酸适体的分子量介于4.95KD-29KD之间，在相同质量的情况下，核酸适体捕获的靶分子较抗体多，治疗效果可能会更好，到目前为止，尚未发现核酸适体具有明显的毒性或过敏源性，因而，本发明的核酸适体完全可以替代抗体，可用于制备抑制铜绿假单胞菌毒性的试剂，其具有极佳的临床治疗应用前景。
:图1为OdDHLS的核磁共振氢谱图。图2为OdDHLS的核磁共振碳谱图。图3为OdDHLS在MES缓冲液(ρΗ5.0)中的稳定性。
图4为OdDHLS在Tris-HCl缓冲液(ρΗ7.4)中的稳定性。
图5为SPR检测核酸适体与OdDHLS的亲和力。图6为荧光竞争法检测核酸适体对OdDHL (A)和BHL (B)亲和力。图7为核酸适体抑制LasB毒素分泌的作用。
具体实施方式
:以下通过实施例对本发明进行进一步描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例:一种可同时识别N-(3_氧化十二烷酰基)-L-同型丝氨酸内酯(N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone, OdDHL)和 N- 丁酸高丝氨酸内酯(N-butanoyl-L-homoserine lactone, BHL)的核酸适体的核苷酸序列为:GCAATGGTACGGTACTTCCTGTGGGTTAGTTTGACTCAAGGCTGGGCTTATACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA (SEQ ID NO:1)。所述核酸适体的筛选方法:1.主要试剂及缓冲液:1.1 OdDHL 类似物(OdDHL surrogates, OdDHLS)本发明选用的OdDHLS 为:7-oxo_7-[[(3S)-2-oxo-3-pyrrolidinyl]amino]-Heptanoic acid，是由上海科胜药物研发有限公司合成。OdDHL和BHL购自sigma-aIdrich。OdDHLS 的化学式如下:
权利要求
1.一种可同时识别OdDHL和BHL的核酸适体，其特征在于:所述核酸适体的核苷酸序列为 GCAATGGTACGGTACTTCCTGTGGGTTAGTTTGACTCAAGGCTGGGCTTATACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA。
2.—种权利要求1所述可同时识别OdDHL和BHL的核酸适体，其特征在于:它用于干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统的Ias和rhl信号途径，抑制群体效应系统调控的毒素分泌以及生物膜 的形成，抗铜绿假单胞菌感染。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种可同时识别OdDHL和BHL的核酸适体及其应用。OdDHL和BHL分别是铜绿假单胞菌群体效应系统的las和rhl信号途径的信号分子，这两个信号途径的激活可启动铜绿假单胞菌毒力基因的表达。本发明采用竞争法筛选出一种可高亲和力结合OdDHL和 BHL的核酸适体。该核酸适体具有干扰铜绿假单胞菌的群体效应系统，抑制铜绿假单胞菌毒力基因的表达的潜力。本发明的核酸适体与OdDHL和BHL结合的亲和力与抗体相当，而且制备过程更加简单、更易于操作，且成本更低。
文档编号C12N15/115GK103173452SQ20131002497
公开日2013年6月26日 申请日期2013年1月23日 优先权日2013年1月23日
发明者赵祖国, 吴淑庆, 杨在明 申请人:国家纳米技术与工程研究院