头孢菌素类抗生素原料物质（7-aca）生产用变异酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及头孢菌素类抗生素（cephalosporin?antibiotics）原料物质7-ACA生产用变异酶，尤其涉及一种通过点突变（Point?mutation）制造头孢菌素（Cephalosporin）C活性增加的变异头孢菌素C酰基转移酶（acylase）及利用此制造7-ACA的制造方法。本发明的变异CPC酰基转移酶（acylase）与野生型CPC酰基转移酶（acylase）相比，对CPC基质的活性增加5倍至26倍，只通过1个阶段以CPC直接制造7-ACA的效果尤为显著。
【专利说明】头孢菌素类抗生素原料物质(7-ACA)生产用变异酶
【技术领域】
[0001]本发明涉及头孢菌素类抗生素(cephalosporin antibiotics)原料物质7-ACA生产用变异酶，尤其涉及一种通过点突变(Point mutation)制造头孢菌素(Cephalosporin)C活性增加的变异头孢菌素C酰基转移酶(acylase)及利用此制造7-ACA的制造方法。
【背景技术】
[0002]头孢菌素C (Cephalosporin C,下面简称为 “CPC”)是 β -内酰胺(β-lactam)类抗生物质，由丝状菌(Filamentous fungus)霉菌(mold)产黄头抱霉(Acremoniumchrysogenum)等一些微生物生产，对革兰氏阴性(Gram negative)细菌通过阻碍细胞壁合成表现出抗生活性，但其程度非常微弱。因此其主要应用于制造半合成头孢菌素类抗生素(sem1-synthetic cephalosporin antibiotics)的原料物质。特别是，从CPC去除氨基己二酰侧链(D—amino adipoyl side chain)而得到的7_氨基头孢烧酸(7-aminocephalosporanic acid,下面简称为“7-ACA”)正作为占全球抗生素市场40%以上的大部分头孢菌素类抗生素(cephalosporin antibiotics)的原料物质使用。
[0003]利用CPC制造7-ACA的现有工艺有化学工艺和酶工艺。化学工艺的反应条件复杂、环境处理费用高，因此现在大部分企业都以环保形酶工艺生产7ACA。
[0004]目前，企业以商用层面使用的酶工艺通常由两个阶段构成。第I阶段中利用D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,下面简称为“DA0”)的酶反应，把CPC转化成戍二酸-7-氨基头抱烧酸(Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid,下面简称为“G1-7-ACA”)，第2阶段中通过G1-7-ACA酰基转移酶(acylase)的酶反应，把G1-7ACA转化成7ACA (参考图1)。
[0005]但第2阶段酶工艺的生产收率低。其原因在于第I阶段的酶反应所生成的过氧化氢对基质(CPC)、反应生成物(G1-7-ACA)及DAO进行攻击。从而有必要开发一种酶工艺，在第I阶段，通过头孢菌素C酰基转移酶(Cephalosporin C acylase,下面简称为‘CPC酰基转移酶(acylase)’)，从CPC直接制造7ACA。
[0006]由于CPC酰基转移酶(acylase)不存在于自然界，因此同归改良存在于自然界的各种G1-7-ACA酰基转移酶(也称作戊二酰酰胺酶(Glutaryl amidase:GA))制造CPC酰基转移酶(acylase)。G1_7_ACA酰基转移酶(acylase)对CPC的活性非常弱，需要提高其活性。
[0007]用于第2阶段酶工艺的G1-7-ACA酰基转移酶(acylase)多见于各种土壤微生物，索纳韦恩(Sonawane)以如下【表1】的方式把G1-7-ACA分为5个群组(Sonawane, Crit.Rev.Biotech.26:95-120, 2006)。属于同一群组内的，蛋白质大小、氨基酸序列、基质特征、反应特征等非常相似，但 不同群组的差别比较大。
[0008]【表1】
[0009]Gl-T7-ACA酰基转移酶(acylase)的分类
[0010]
【权利要求】
1.一种变异CPC酰基转移酶(acylase)，其特征在于:由序列号3所示氨基酸序列的α亚基(a-subunit)与序列号4所示氨基酸序列的β亚基构成的野生型CPC(CephalosporinC)酰基转移酶(acylase)序列中，F58氨基酸被纟颜氨酸(Valine)置换。
2.根据权利要求1所述的变异CPC酰基转移酶(acylase)，其特征在于: 所述变异CPC酰基转移酶(acylase)追加包括从由Y153T、F177L及Y153T+F177L构成的群中选择的突变。
3.根据权利要求2所述的变异CPC酰基转移酶(acylase)，其特征在于: 所述变异CPC酰基转移酶(acylase)追加包括145或V382氨基酸被其他氨基酸置换的突变。
4.根据权利要求3所述的变异CPC酰基转移酶(acylase),其特征在于: 所述突变中，145被蛋氨酸(Methionine)、缴氨酸Valine)、丙氨酸(Alanine)、半胱氨酸(Cysteine)、亮氨酸(Leucine)中的某一种氨基酸置换，V382被亮氨酸(Leucine)或异亮氨酸(Isoleucine)置换。
5.根据权利要求4所述的变异CPC酰基转移酶(acylase),其特征在于: 所述变异CPC酰基 转移酶(acylase)由序列号6所示氨基酸序列的α亚基(a -subunit)与序列号7所示氨基酸序列的β亚基构成。
6.一种基因，其特征在于:对从权利要求1至5中选择的某一项变异CPC酰基转移酶(acylase)进行加密。
7.根据权利要求6所述的基因，其特征在于: 所述基因以序列号5所不喊基序列表不。
8.一种重组表达载体(expression vector),其特征在于: 包括第6项基因。
9.根据权利要求8所述重组表达载体(expressionvector),其特征在于: 包括第7项基因。
10.一种宿主细胞，其特征在于: 通过第8项的表达载体(expression vector)被形质转换(transformation)。
11.一种微生物,其特征在于: 通过第8项的表达载体(expression vector)被形质转换(transformation)。
12.根据权利要求11所述的微生物，其特征在于: 所述微生物是通过第9项的重组表达载体(expression vector)被形质转换(transformation)的大肠埃希氏菌(Escherichia coli ) MC1061/pBC-PM2 (登记号:KCTC12344BP)。
13.一种 7-ACA (7-Aminocephalosporanic acid)制造用合成物，其特征在于: 包括从第I项至第5项中选择的某一项所述变异CPC酰基转移酶(acylase)。
14.一种制造如下化学式2的方法，其特征在于: 让从第I项至第5项中选择的某一项所述变异CPC酰基转移酶(acylase)与如下化学式I的化合物或其盐反应，进行制造。 化学式I
【文档编号】C12N1/21GK103937764SQ201310049908
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年2月7日 优先权日:2013年1月21日
【发明者】慎镛喆, 朴哲, 王垠善, 郑景化 申请人:爱美科生物株式公司