专利名称：与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物，同时还涉及该标志物的应用，属于基因工程及肿瘤学领域。
背景技术：
食管癌(Esophageal carcinoma, EC)是常见的消化道恶性肿瘤，占消化系统各部位肿瘤死亡的第二位，全世界每年死于此病达30万人，其中中国每年平均死亡约15万人，是世界上食管癌发病率最高的国家。尽管近年来在食管癌的化疗、放疗以及同期放化疗等方面取得了较大进展，但至今外科手术仍是食管癌最主要的治疗手段。但治疗效果不理想，5年生存率仅为30%左右，死亡的主要原因为术后复发和转移，尤其是食管癌患者术后早期淋巴结转移。目前国内外报道其术后早期复发和转移率(术后I年内)可达约20-50%不等，这对患者及外科医师的信心均是沉重打击，部分患者甚至对外科手术疗效产生疑问。食管癌患者的自然病程或者称生存期约为6-12月，术后I年内出现早期复发和转移，意味着手术的失败，或者说对这些患者采取放化疗更有益。
影响食管癌预后的因素很多，目前判断食管癌预后的主要方法还是传统的TumorNodemetastasis(TNM)分期方法。食管癌的临床诊治过程中，经典的1'匪病理分期系统对于不同病理分期预后判断起着重要作用，但对于临床工作中遇到的病理分期相同而预后差异明显的情况无法解释，而且缺乏对术后出现早期复发的判断作用。目前，临床工作者正在进一步完善期系统以评估预后。与此同时，基础医务工作者也从肿瘤异质性方面不同来考虑，寻找新的判断预后的分子指标，作为TNM病理分期系统的有益补充。食管癌的发生、发展过程中涉及多个癌基因、抑癌基因的突变，产生各种酶学的改变，表现为多基因、多因素、多步骤的协同作用。对于食管癌诊断和预后有关的分子生物学标志物的研究已成为研究重点。
目前食管癌肿瘤分子标记物的研究和报告较多，除传统意义的肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)、鳞状上皮细胞癌相关抗原(SCC)、细胞角化素蛋白片段19 (CYFRA21 -1)、p53蛋白抗体(p53-Ab)等以外，目前研究中热点分子标记物EGFR (表皮生长因子受体)、CycIinDl(细胞周期蛋白Dl)、C0X-2 (环氧化酶2)、PCNA (增殖细胞核抗原)、VEGF (血管内皮细胞生长因子)等都对食管癌预后判断有一定的临床意义，但以上分子标记物主要集中于对不同肿瘤病理分期的研究，以及对淋巴结转移、肿瘤浸润深度等单个因素的影响，缺乏对相同病理分期、同一术者、相同术式、相同术后治疗方案而预后不同分子标记物的研究，缺乏对食管癌术后出现早期复发和转移的研究，缺少特异性和灵敏性高的分子标记物来预测食管癌的发生、发展和预后，而且食管癌变和发展过程是多基因改变的结果，其分子生物学变化并不完全相同，联合分子标记 物检测有助于提高判断预后的敏感性。
microRNAs (miRNAs)是一类长度为二十几个核苷酸的内源性非编码调控RNA，通过序列特异性翻译抑制或mRNA裂解来调控基因表达，参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物学进程。近期的研究发现，miRNA具有癌基因和抑癌基因的作用，在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。如能筛选出食管癌术后早期复发和预后特异或异常表达的miRNA作为生物标志物，并研制相应的疾病进展监测、辅助诊断试剂盒，对我们食管癌的诊治现状必将是一次有力的推动，尤其对一些患者避免不必要的外科手术有着重要的意义。此外，这些异常表达的miRNA对于食管癌细胞迁移、转移能力的影响等，还有助于发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物。
发明内容
本发明的目的是提供与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物。为了实现以上 目的，本发明所采用的技术方案是提供与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物，所述miRNA标志物为has-miR-382。所述miRNA 标志物的引物如 SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6 所示。本发明的目的还在于提供一种与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物在制备食管癌术后早期复发和预后辅助诊断试剂盒方面的应用。本发明所采用的技术方案还在于提供一种与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物在制备食管癌术后早期复发和预后辅助诊断试剂盒方面的应用。所述试剂盒包括has-miR-382的引物、聚合酶链反应试剂、U6snRNA内参引物及荧光染料 SYBR-Greenl。本发明的目的还在于提供一种与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物的引物在制备食管癌术后早期复发和预后辅助诊断试剂盒方面的应用。本发明所采用的技术方案还在于提供一种与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物的引物在制备食管癌术后早期复发和预后辅助诊断试剂盒方面的应用。本发明的目的还在于提供一种与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物的引物的食管癌术后早期复发和预后辅助诊断试剂盒。本发明所采用的技术方案还在于提供一种与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物的引物的食管癌术后早期复发和预后辅助诊断试剂盒。利用本试剂盒中提供的试剂，结合常用的RNA提取试剂和通用的miRNA逆转录试齐U，可以特异地检测组织中has-miR-382的表达量，有效地用于临床食管癌的辅助诊断。本发明has-miR-382的筛选方法，包括以下步骤:1、选择相同病理分期、同一术者、相同术式、相同术后治疗方案却有着截然不同预后结果的典型样本，同时选取病理分期相同距离肿瘤组织边缘8cm以外的正常食管粘膜作为对照品；2、提取样本和对照品的RNA ；3、对总RNA通过逆转录得到cDNA ； 4、cDNA进行预扩增；5、将预扩增产物进行实时荧光RT-PCR扩增，筛选表达存在明显差异的miRNA，进行miRNA的表达统计分析，筛选得到与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物。本发明选取食管癌术后复发时间和预后差异较大的肿瘤样本及其正常食管组织作为对照，通过提取RNA，逆转录、实时荧光定量RT-PCR筛选表达存在明显差异的miRNA，进RmiRNA的表达统计分析，筛选得到has-miR-382。本发明方法简单、操作方便，筛选得到的has-miR-382可辅助判断食管癌患者的预后或死亡风险，推动了食管癌诊治方面的发展。
采用本发明制备的miRNA试剂盒，不仅稳定，检测方便，且定量准确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，将此试剂盒投入实践，可以帮助诊断和更有效的个体化治疗。
图1为has-miR-382在病理分期相同而预后差异食管癌患者表达RT-PCR扩增曲线.
图2为has-miR-382表达量与食管癌预后的危险度评分方法分析图。
具体实施方式
实施例
1、样本的选择
选取新乡医学院第一附属医院2006-2007年收治的病理分期相同，预后生存明显差异的2例石蜡标本，这2例标本均为原发病灶的首次手术切除肿瘤样本制作的石蜡标本。同时分别选取距离此2例石蜡样本肿 瘤组织边缘8cm以外的正常食管粘膜作为对照。2例病例，术前经全身物理体格检查及影像学诊断无远处转移，术前未接受放射治疗或化学治疗等，均采用食管癌切除+胸腹二野淋巴结清扫术，颈部手工吻合，术后化疗2次，术后病理学检查提示食管中段高分化鳞癌，溃疡型，侵及外膜，无淋巴结转移，根据国际抗癌联盟(瓜0:)2002年第六版分期标准，2例均为13_10，临床分期为113期，但预后存在明显差异，一例术后5年仍健在，一例术后4个月颈部淋巴结转移，I年死亡。
2、提取 RNA
I)采用Trizol —步法提取石蜡包埋组织微切割肿瘤细胞中的总RNA，操作按照RNA提取试剂盒(Invitrogen, USA)说明进行。
2)回收总 RNA,操作按照 Recover All Total Nucleic Acid Isolation KitTRIZOL REAGENT (Ambion，USA)的说明书进行。
3)采用分管光度计分别测定波长230，260，280nm处的光吸收度值，确定总RNA的纯度和浓度。
4)甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA样品中28s和18s的比例，鉴定其纯度和完整性。
3、Megaplex 逆转录
a) Megaplex逆转录体系如表I所示。
表IMegaplex逆转录体系
权利要求
1.与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物，其特征在于，所述miRNA标志物为 has-miR-382。
2.根据权利要求1所述的与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物，其特征在于，所述miRNA标志物的引物如SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示。
3.—种如权利要求1所述的与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物在制备食管癌术后早期复发和预后辅助诊断试剂盒方面的应用。
4.根据权利要求3所述的与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物在制备食管癌术后早期复发和预后辅助诊断试剂盒方面的应用，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物、聚合酶链反应试剂、U6snRNA内参引物及荧光染料SYBR-Greenl。
5.一种如权利要求1所述的与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物的引物在制备食管癌术后早期复发和预后辅助诊断试剂盒方面的应用。
6.一种含权利要求1所述的与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物的引物的食管癌术后早期复发和预后辅助诊断试剂盒。
全文摘要
本发明公开了与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物及其应用，其中，miRNA标志物为has-miR-382。该miRNA标志物在制备食管癌术后早期复发和预后辅助诊断试剂盒方面的应用。一种与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物的引物在制备食管癌术后早期复发和预后辅助诊断试剂盒方面的应用。一种与食管癌术后早期复发和预后相关的miRNA标志物的引物的食管癌术后早期复发和预后辅助诊断试剂盒。本发明方法简单、操作方便，筛选得到的has-miR-382可辅助判断食管癌患者的预后或死亡风险，推动了食管癌诊治方面的发展。
文档编号C12N15/113GK103173449SQ20131007275
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者赵宝生, 秦秀广, 齐博, 刘尚国, 王天云, 李汉臣 申请人:新乡医学院第一附属医院