专利名称：鼠肝炎冠状病毒的gfp示踪系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鼠肝炎冠状病毒的GFP示踪系统及其应用，特别涉及一种在野生型鼠肝炎冠状病毒A59株基因组中插入GFP后得到的重组鼠肝炎冠状病毒。
背景技术：
冠状病毒是目前已知的基因组最大的单股正链RNA病毒，主要引起呼吸道和消化道的疾病，是多种经济动物传染性疾病的病原体，常常导致巨大的社会经济损失。自2003年一种新的SARS-CoV被确定为烈性传染病SARS的病原体以来，冠状病毒(Coronavirus)便成为全球生命科学研究的热点之一。绿色突光蛋白(greenfluorescent protein, GFP)是来源于发光水母(aequoreavictoria)的一种功能独特的蛋白质，分子量为27kD，由238个氨基酸组成。自1992年Prasher等克隆到GFP的cDNA以来,GFP示踪技术已广泛应用于分子生物学研究领域。结合GFP荧光示踪的技术手段，可分别在细胞和动物水平，对标记分子或物质进行荧光示踪监测和定量检测。目前尚未有对鼠肝炎冠状病毒进行GFP示踪的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种鼠肝炎冠状病毒的GFP示踪系统及其应用。所述鼠肝炎冠状病毒的GFP示踪系统即为一种表达绿色荧光蛋白的重组鼠肝炎冠状病毒。
本发明所提供的重组鼠肝炎冠状病毒，是将野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA进行替换或插入得到的重组病毒；所述替换为:将所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的片段a中的任一片段(可由I个、2个或更多个核糖核苷酸组成)替换为片段b ；所述插入为:在所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b;所述片段a为序列表中序列I编码的RNA ;所述片段b为含有绿色荧光蛋白编码基因的DNA片段编码的RNA。所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。在本发明中，所述绿色荧光蛋白的编码基因的序列为序列表中序列3的第142-861 位。进一步，所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3。在本发明的一个实施例中，所述野生型鼠肝炎冠状病毒具体为鼠肝炎冠状病毒A59 株。在本发明的一个实施例中，所述重组鼠肝炎冠状病毒是将野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA进行替换得到的重组病毒；具体的，所述替换中，所述“片段a中的任一片段”为所述片段a中的序列I的第468-765位核苷酸对应的RNA片段。由于所述野生型鼠肝炎冠状病毒A59株的基因组RNA经反转录后得到的cDNA序列为GenBank号为NC_001846.1的序列(Up date:2012_8_23)，相应的，所述重组鼠肝炎冠状病毒的基因组RNA经反转录后得到的cDNA序列为GenBank号为NC_001846.1的序列(Update:2012-8-23)的第27967-28264位(对应序列I的第468-765位)替换为序列表中序列3，得到的核苷酸序列。本发明的另一个目的是提供一种制备所述重组鼠肝炎冠状病毒的方法。本发明所提供的制备所述重组鼠肝炎冠状病毒的方法具体可包括如下步骤:(a)将所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列I中；(b)用含所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列的痘苗病毒载体甲感染CV-1细胞后，用步骤(a)获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述痘苗病毒载体甲与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述痘苗病毒载体甲中的所述待取代核苷酸序列，或在所述痘苗病毒载体甲中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙；(c)将步骤(b)中的所述重组痘苗病毒载体乙中的所述gpt基因替换为所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段，得到重组质粒乙；(d)用步骤(b)得到的重组痘苗病毒载体乙感染新的CV-1细胞后，用步骤(C)获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体乙与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段替代所述重组痘苗病毒载体乙中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体丙；(e)提取步骤(d)得到的重组痘苗病毒载体丙的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体丙的基因组的全长RNA ;将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述重组鼠肝炎冠状病毒。在上述方法中，步骤(a)中所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为 GenBank 号为 NC_001846.1 的序列(Up date:2012-8-23)的第 27500-27966位(对应序列I的第1-467位)和第28265-28700位(对应序列I的第766-1201位)。在本发明的一个实施例中，制备所述重组鼠肝炎冠状病毒的方法具体包括如下步骤:(a)将GenBank号为NC_001846.1的野生型鼠肝炎冠状病毒A59株的基因组cDNA序列(Up date:2012-8-23)的第27500-27966位(对应序列I的第1-467位，命名为上游同源臂)和第28265-28700位(对应序列I的第766-1201位，命名为下游同源臂)分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游(如酶切位点Not I和Sal I之间)和下游(如酶切位点Pst I和BamH I之间)，得到重组质粒，将其命名为pGPT-1N_0RF4 ；(b) 用含鼠肝炎冠状病毒(MHV)A59株基因组cDNA的痘苗病毒载体vacciniavirus inf-1 (v.v.-1nf-1)感染CV-1细胞后,用步骤(a)获得的重组质粒pGPT_IN_0RF4转染所述CV-1细胞，所述痘苗病毒载体甲与所述重组质粒PGPT-1N-0RF4通过所述上游同源臂和所述下游同源臂发生同源重组，以所述gpt基因作为阳性筛选标记，获得以所述gpt基因替代所述V.V.-1nf-Ι中的位于GenBank号为NC_001846.1的野生型鼠肝炎冠状病毒A59株的基因组cDNA序列(Up date:2012_8_23)的第27967-28264位核苷酸序列的重组痘苗病毒载体，将其命名为V.V-1nf-gpt-1n ；(c)将步骤(a)中的所述重组质粒pGPT-1N-0RF4中的所述gpt基因替换为所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段(序列3)，得到重组质粒，将其命名为pGPT-OUT-GFP ；(d)用步骤(b)得到的重组痘苗病毒载体乙V.V-1nf-gpt-1n感染新的CV-1细胞后，用步骤(c)获得的重组质粒pGPT-OUT-GFP转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体V.V-1nf-gpt-1n与所述重组质粒pGPT-OUT-GFP通过所述上游同源臂和所述下游同源臂发生同源重组，以所述gpt基因作为阴性筛选标记，获得以所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段(序列3)替代所述重组痘苗病毒载体V.V-1nf-gpt-1n中所述gpt基因的重组豆苗病毒载体，将其命名为V.V.-1nf-GFP-GPT-OUT ；(e )提取步骤(d)得到的重组痘苗病毒载体V.V.-1nf-GFP-GPT-OUT的基因组DNA,通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体V.V.-1nf-GFP-GPT-OUT的基因组的全长RNA ;将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述重组鼠肝炎冠状病毒(MHV-GFP)0在上述方法的步骤(e)中，所述培养转染后的细胞，具体为将所述转染后的细胞(BHK-21)与17CL-1细胞按照1:4的比例混合培养。之后，待细胞出现病变后，收集细胞培养物，感染新的17CL-1细胞，进而获得所述重组鼠肝炎冠状病毒(MHV-GFP)。所述重组鼠肝炎冠状病毒在如下(al)或(a2)中的应用也属于本发明的保护范围:(al)制备研究鼠肝炎冠状病毒感染机制的产品；(a2)制备筛选抗鼠肝炎冠状病毒药物的细胞模型。本发明的又一个目的是提供如下(bl)或(b2)的生物材料:(bl)含有所述重组鼠肝炎冠状病毒的离体动物细胞或重组菌；(b2)含有所述重组鼠肝炎冠状病毒的基因组RNA或cDNA的载体。在本发明的一个实施例中，所述动物细胞具体为BHK-21细胞。本发明选择绿色荧光蛋白(GFP)作为示踪蛋白具有以下优点:1、对细胞既无毒性，也无种属、组织和位置特异性；2、不需要任何反应底物及其他辅助因子，只需要激发光源的激发即可发光；3、荧光品质稳定，能够克服穿透、毒素、光漂白，高温等不利因素。本发明选择基于痘苗病毒为载体的冠状病毒反向遗传学系统，与其他反向遗传学系统相比，痘苗病毒载体具有其他载体所没有的优势。首先，痘苗病毒载体的载容量比较大， 可容纳至少26Kb外源序列。其次，插入片段在痘苗病毒中比较稳定，随着重组痘苗病毒的增殖，可以获得高拷贝的外源基因。
第三，痘苗病毒载体可介导高频率的同源重组，便于对基因进行修饰改造。实验证明，对本发明建立的MHV绿色荧光示踪系统一重组鼠肝炎冠状病毒(MHV-GFP)感染小鼠肝脏后进行病毒滴度的测定以及肝损伤的分析(谷丙转氨酶氨酶(ALT)的测定和肝脏病理切片的观察)结果显示，MHV-WT和MHV-GFP病毒感染小鼠后复制能力和致病力均无显著差异，说明重组病毒MHV-GFP可与野生型病毒平行应用于MHV的相关研究。另外，本发明所提供的重组病毒MHV-GFP由于绿色荧光蛋白的信号放大效应，可以极大的提高病毒监测的灵敏度，能够对病毒在小鼠脏器中的存在与否和病毒的增值情况进行直观初步的观测，设备要求简单。因此，利用动物模型开展MHV的感染和抗病毒治疗研究时，MHV示踪系统可以对传统的病毒学研究方法起到很好的辅助和补充作用，不仅极大地扩展了经典模型系统在细胞水平和动物水平的应用，同时，也为建立新型低剂量病毒亚临床感染动物模型提供了一个新思路。再则，本发明为抗冠状病毒药物的筛选等应用研究也提供新的技术平台。
图1为重组痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n的PCR鉴定结果。其中，泳道Ml为DNA分子量标准Markerl5000 ;泳道M2为DNA分子量标准Marker2000 ;泳道I和4为用引物对PSC40/PSC 55进行扩增的结果；泳道2和5为用引物对GPT L-F/PSC 55进行扩增的结果；泳道3和6为用引物对GPTR-F/PSC 55进行扩增的结果。图2为重组痘苗病毒V.V.-1nf-GFP-GPT-OUT的PCR鉴定结果。其中，泳道Ml为DNA分子量标准Marker2000 ;泳道M2为DNA分子量标准Markerl5000 ;泳道I和5为用引物对GPT L-F/PSC54进行扩增的结果；泳道2和6为用引物对GPT R-F/PSC54进行扩增的结果；泳道3和7为用引物对GFP UP L/PSC 54进行扩增的结果；泳道4和8为用引物对GFP UP R/PSC 54进行扩增的结果。图3为重组病 毒MHV-GFP测序鉴定结果示意图。图4为重组病毒MHV-GFP的一步生长曲线。其中，WT表示野生型MHV A59株；GFP表示重组病毒MHV-GFP。图5为重组病毒MHV-GFP感染细胞后的绿色荧光图。图6为腹腔感染病毒后小鼠体重变化情况，剂量为3 X IO6PFU/只。图7为各组小鼠血清ALT浓度测定结果，剂量为3 X IO6PFU/只。其中，WT表示野生型MHV A59株；GFP表示重组病毒MHV-GFP。图8为各组小鼠肝脏病毒滴度测定结果，剂量为3 X IO5PFU/只。其中，*表示未检测到病毒；WT表示野生型MHV A59株；GFP表示重组病毒MHV-GFP。图9为各组小鼠肝脏病理切片(200X)，剂量为3X IO5PFU/只，感染时间为5天。其中，A为PBS组小鼠；B为MHV-WT感染小鼠；C为MHV - GFP感染小鼠。图10为重组病毒MHV-GFP感染小鼠肝脏的绿色荧光图，剂量为3X105PFU/只。其中，A为PBS组小鼠肝脏；B为MHV-GFP感染小鼠Ilh肝脏荧光；C为MHV-GFP感染小鼠16h肝脏荧光；D为MHV-GFP感染小鼠24h肝脏荧光。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。毒株、细胞与小鼠:含鼠肝炎冠状病毒(mouse hepatitis virus, MHV) A59株基因组全长cDNA的痘苗病毒载体(vaccinia virus inf-1,简称v.v.-1nf_l)由英国布里斯托大学StuartG.Siddell教授惠赠，记载在“林磊，吴晓燕，常国辉，祝庆余.鼠肝炎冠状病毒非结构蛋白I内保守序列LLRKxGxKG的功能研究.解放军医学杂志.2010，35 (5):508-512.”一文中，公众可从中国人民解放军疾病预防控制所获得。质粒pSV2-gpt (购自ATCC公司，产品目录号=37145 ),质粒phMGFP (购自Promega公司，产品目录号:E6421)、CV-1细胞(购自ATCC，产品目录号:CCL_70)和BHK-21细胞(购自ATCC公司，产品目录号:CCL-10) ；17Clone-l (17CL-1)细胞(参见文献:Sturman，L S.，and K.K.Takemot0.1972.Enhanced growth of a murine coronavirus intransformed mouse cells.1nfect.1mmun.6:501 - 507.)、D980R 细胞(参见文献:Kerr, S.M., and G.L.Smith.1991.Vaccinia virus DNA ligase is nonessential for virusrepIication:recovery of plasmids from virus-1nfected cells.Virology,180:625 -632.)015-18g，6_8周龄的雌性Balb/c小鼠购自维通利华实验动物技术有限公司。主要试剂和材料:DMEM 培养基，胎牛血清，Platinum Pfx DNA Polymerase, Suoerscript III 反转录酶，脂质体(Lipofectamine 2000)转染试剂等均购自Invitrogen公司；RiboMAX LargeScale RNA Production System T7, Ribo m7G Cap Analog购自 Promega公司；Mycophenolicacid (MPA), Hypoxanthine, Xanthine, 6-Thioguanine (6-TG), Gelrite Gellan Gum 等均购自sigma公司；Doxycycline hyclate购自BioChemika ；Eag I限制性内切酶购自NEB公司；RNeasy Mini Kit 购自 QIAGEN。实施例1、GFP标记的重组鼠肝炎冠状病毒的构建一、同源重组质粒的构建1、重组质粒pGPT-1N-0RF4的构建及鉴定将野生型鼠肝炎冠状病毒A59株的基因组cDNA序列(GenBank号:NC_001846.1，Up date:2012-8-23)的第27500-27966位(对应序列I的第1-467位，命名为上游同源臂)和第28265-28700位(对应序列I的第766-1201位，命名为下游同源臂)分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒pGPT-1N-0RF4。具体操作如下:(I)痘苗病毒载体vaccinia virus inf_l基因组DNA的提取由于痘苗病毒载体vaccinia virus inf-1 (简称v.v.-1nf_l)含野生型鼠肝炎冠状病毒(mouse hepatitis virus，MHV) A59株基因组全长cDNA，所以提取其基因组DNA作为模板，用于扩增所述上游同源臂和所述下游同源臂。具体操作如下:
将痘苗病毒载体vaccinia virus inf_l用DMEM完全培养基进行适当的稀释后，加入到培养至单层的BHK-21细胞中(M0I=1)，于37°C培养，每日观察细胞病变。待细胞病变达到+++ (约3d)时，用细胞刮刮取病变细胞，2000rpm离心8min后，取细胞沉淀，用于提取痘苗病毒DNA或_70°C冻存备用。
病毒DNA提取步骤如下:I)取细胞沉淀，加入一定体积的 Buffer A (IOmM Tris-Cl pH9.0, ImM EDTA)充分悬浮，冻融3次，并超声波处理3分钟，充分裂解细胞释放病毒。2)加 1/10 体积 0.5% (0.5g/100ml)的胰蛋白酶，37°C水浴，消化 20min。3)将上述反应液加入到含有蔗糖垫(用ImM的pH9.0的Tris配制)的超速离心管中，16000rpm,4°C,90min离心。弃上清,用400μ1 Buffer A重悬沉淀,储存于4°C冰箱。4)加适量RNase-free DNase (具体用量参照产品说明书)到病毒重悬液，37°C，20min,以消化病毒外的细胞DNA。然后加入终浓度IOmM的EDTA，65 V，IOmin终止消化。5)向上述反应液中加入I倍体积的2XProteinase K Digestion Buffer和适量Proteinase K (终浓度 50 μ g/ml), 50°C温育 2h。6)加I倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)，轻轻颠倒混合均匀，13，OOOrpm离心5min。将上层水相转入新管(注意不要吸到中间蛋白质层)。7)向新管中加I倍体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)，轻轻颠倒混合均匀，14, OOOrpm离心5min。将上层水相转入新管。8)加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,轻轻颠倒混合均勻，14, OOOrpm离心15min。9)弃掉上清，加0.5ml70%乙醇漂洗DNA片层，14，OOOrpm离心lOmin。用移液器完全移除液体，加40-100 μ I无RNase水溶解DNA。10)提取完 成后，于260nm处测定其OD值，以判断DNA浓度和纯度，并_70°C冻存备用。(2)引物的设计与合成根据野生型鼠肝炎冠状病毒A59株的基因组cDNA序列(GenBank:NC_001846.1，Up date:2012-8-23)设计并合成如下两个引物对:扩增上游同源臂的引物对:L-UP:5，-GCGGCCGCCTTCAATACCTAATCCACCCGAC-3，(下划线部分为酶切位点 Not I的识别序列，其后的序列为GenBank:NC_001846.1的第27500-27522位，即序列I的第1_23位)L-down:5’-GTCGACGGTAGCAATGAGAATGCTATAAATTG_3’(下划线部分为酶切位点 SalI的识别序列，其后的序列为GenBank:NC_001846.1的第27941-27966位的反向互补序列，即序列I的第442-467位的反向互补序列)扩增下游同源臂的引物对:R-up:5，-CTGCAGAGAGGTTTTGATTATAGTAC-3，(下划线部分为酶切位点 PstI 的识别序列，其后的序列为GenBank:NC_001846.1的第28265-28284位，序列I的第766-785位)R-down:5’ ~GGATCCTCGAGCTGCGTGGCCCTAAAAAG~3 (下划线部分为酶切位点 BamHI的识别序列,其后的序列为GenBank:NC_001846.1的第28678-28700位的反向互补序列，序列I的第1179-1201位的反向互补序列)(3)重组质粒pGPT-1N-0RF4的构建及鉴定以步骤(I)获得的痘苗病毒载体vaccinia virus inf_l基因组DNA为模板，以步骤(2)设计合成的两个引物对分别进行PCR扩增，得到带有相应酶切位点的上游同源臂和下游同源臂。首先用限制性内切酶Not I和Sal I双酶切所述上游同源臂，将其与经过同样双酶切的pSV2-gpt质粒大片段相连，获得中间质粒；接着用限制性内切酶Pst I和BamHI双酶切所述下游同源臂，将其与经过同样双酶切的所述中间质粒大片段相连，获得重组质粒，经测序鉴定在pSV2-gpt质粒的酶切位点Not I和Sal I之间插入了 GenBank号为NC_001846.1 (Up date:2012-8-23)的序列的第27500-27966位核苷酸，同时在酶切位点Pst I 和 BamH I 之间插入了 GenBank 号为 NC_001846.1 (Update:2012-8-23)的序列的第28265-28700位核苷酸的重组质粒为阳性，将其命名为pGPT-1N_0RF4。2、重组质粒pGPT-OUT-GFP的构建及鉴定(I) GFP基因片段的获得从质粒phMGFP中获得本发明所需的绿色荧光蛋白的编码基因，并在其两端添加上构建重组质粒所需的酶切位点。具体操作如下:利用GFP特异引物GFP up和GFP down从质粒phMGFP中获得带有相应酶切位点的GFP基因片段。GFP up: 5’ -GTCGACATGGACTACCAAGACGATGACG-3，(下划线部分为酶切位点 Sal I的识别序列，整个序列为序列3的第1-28位的序列)GFP down: 5，-CTGCAGGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’(下划线部分为酶切位点Pst I的识别序列，整个序列为序列3的第843-873位反向互补序列)PCR扩增产物的序列为序列表中的序列3。(2)重组质粒pGPT-OUT-GFP的构建及鉴定用限制性内切酶Sal I和Pst I双酶切步骤(I)获得的GFP基因片段，与将其与经过同样双酶切的步骤I构建的重组质粒PGPT-1N-0RF4的载体大片段相连，获得重组质粒，经测序鉴定将重组质粒PGPT-1N-0RF4的酶切位点Sal I和Pst I之间的gpt基因取代为序列表中序列3的第7-867位核苷酸的重组质粒为阳性，将其命名为pGPT-OUT-GFP。序列表中序列3的第142-861位为绿色荧光蛋白的编码基因。二、重组痘苗病毒的构建1、重组痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n的构建及鉴定利用冠状病毒的痘苗病毒载体反向遗传学系统，通过感染-转染CV-1细胞，使痘苗病毒载体vaccinia virus inf-1与重组质粒pGPT_IN_0RF4通过上游同源臂和下游同源臂发生同源重组，以E.Coli gpt基因作为阳性筛选标记，利用蚀斑纯化，获得以所述gpt基因替代所述vaccinia virus inf-1中的位于GenBank号为NC_001846.1的野生型鼠肝炎冠状病毒A59株的基因组cDNA序列(Up date =2012-8-23)的第27968-28264位核苷酸序列的重组痘苗病毒载体V.V-1nf-gpt-1n。具体操作如下:(I) GPT-1N同源重组细胞培养物的获得将CV-1细胞按照1:2的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，继续培养至80_90%，感染痘苗病毒载体vaccinia virus inf-1 (MOI=I )，37 °C吸附lh，然后吸除病毒液，获得感染后的CV-1细胞；按照脂质体2000转染试剂的说明书，将步骤一获得的重组质粒PGPT-1N-0RF4转染所述感染后的CV-1细胞，继续培养2_3d，直至细胞病变完全，反复冻融后收集细胞培养物，得到GPT-1N同源重组细胞培养物，于_70°C保存备用。
(2) GPT阳性筛选GPT阳性的DMEM培养基(pH7.0):由霉酚酸、次黄嘌呤、黄嘌呤和DMEM培养基组成；所述霉酚酸在GPT阳性的DMEM培养基中的终浓度为25 μ g/ml，所述次黄嘌呤在GPT阳性的DMEM培养基中的终浓度为15 μ g/ml，所述黄嘌呤在GPT阳性的DMEM培养基中的终浓度为 250 μ g/ml ο2XMEM 培养基(ρΗ7.0):将 100mll0XMEM、10mll00XMEM 非必需氨基酸和 IOOml
胎牛血清混合后，用水定容至500ml。将CV-1细胞按照1:2的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，于37°C 5%C02的条件下培养，至80%汇合度时，换成GPT阳性的DMEM培养基继续培养24h。取上述步骤(I)获得的GPT-1N同源重组细胞培养物，反复冻融3次后，用GPT阳性的DMEM培养基稀释IO倍，感染上述在GPT阳性的DMEM培养基中培养的CV-1细胞(MOI=I)，37°C吸附lh。其间，将0.25%Gelrite (固化剂，质量百分含量)和2XMEM培养基预热至56°C，且在2 XMEM培养基中加入GPT阳性筛选药物(霉酚酸、次黄嘌呤和黄嘌呤，所述霉酚酸在2XMEM培养基中的终浓度为25 μ g/ml，所述次黄嘌呤在2XMEM培养基中的终浓度为15 μ g/ml，所述黄嘌呤在2XMEM培养基中的终浓度为250 μ g/ml)。待病毒吸附完成后，吸除病毒液，将适量0.25%Gelrite和加入了 GPT阳性筛选药物的2 XMEM培养基等体积混匀，按3ml/孔加入各孔；室温防治3-5min，待其凝固后，置于37°C继续培养，直至观察到明显的细胞病变，挑取单个蚀斑，获得已纯化的重组痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n,于_70°C保存备用。(3)重组痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n的鉴定A.引物设计根据鼠肝炎冠状病毒A59 株(Mouse Hepatitis Virus strain A59)的 mRNA 序列(GenBank:NC_001846.1)及GPT基因序列设计鉴定引物如表I。弓丨物由Invitrogen公司合成，用无核酸酶水配制成 浓度为10 μ M的工作液，-20°C保存备用。表I重组痘苗病毒V.V-1nf-gpt-1n PCR鉴定所用弓丨物
权利要求
1.重组鼠肝炎冠状病毒，是将野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA进行替换或插入得到的重组病毒； 所述替换为:将所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的片段a中的任一片段换为片段b; 所述插入为:在所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b; 所述片段a为序列表中序列I编码的RNA ;所述片段b为含有绿色荧光蛋白编码基因的DNA片段编码的RNA。
2.根据权利要求1所述的重组鼠肝炎冠状病毒，其特征在于:所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
3.根据权利要求2所述的重组鼠肝炎冠状病毒，其特征在于:所述绿色荧光蛋白的编码基因为序列表中序列3的第142-861位。
4.根据权利要求1-3中任一所述的重组鼠肝炎冠状病毒，其特征在于:所述含有绿色荧光蛋白编码基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3。
5.根据权利要求1-4中任一所述的重组鼠肝炎冠状病毒，其特征在于:所述野生型鼠肝炎冠状病毒为鼠肝炎冠状病毒A59株；或 所述替换中，所述片段a中的任一片段为所述片段a中的序列I的第468-765位核苷酸对应的RNA 片段。
6.根据权利要求5所述的重组鼠肝炎冠状病毒，其特征在于:所述重组鼠肝炎冠状病毒的基因组RNA反转录的cDNA序列为GenBank号为NC_001846.1的序列的第27967-28264位替换为序列表中序列3，得到的核苷酸序列。
7.制备权利要求1-6中任一所述重组鼠肝炎冠状病毒的方法，包括如下步骤: (a)将权利要求1-5任一中所述的野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲； 所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列I中； (b)用含权利要求1-5任一中所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列的痘苗病毒载体甲感染CV-1细胞后，用步骤(a)获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述痘苗病毒载体甲与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述痘苗病毒载体甲中的所述待取代核苷酸序列，或在所述痘苗病毒载体甲中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙； (c)将步骤(a)中的所述重组质粒甲中的所述gpt基因替换为权利要求1-4任一中所述的含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段，得到重组质粒乙； Cd)用步骤(b)得到的重组痘苗病毒载体乙感染新的CV-1细胞后，用步骤(c)获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体乙与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段替代所述重组痘苗病毒载体乙中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体丙；(e)提取步骤(d)得到的重组痘苗病毒载体丙的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体丙的基因组的全长RNA ;将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述重组鼠肝炎冠状病毒。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述方法的步骤(a)中，位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为GenBank号为NC_001846.1的序列的第27500-27966 位和第 28265-28700 位的序列。
9.权利要求1-6中任一所述重组鼠肝炎冠状病毒在如下(al)或(a2)中的应用: (al)制备研究鼠肝炎冠状病毒感染机制的产品； (a2)制备筛选抗鼠肝炎冠状病毒药物的细胞模型。
10.如下(bl)或(b2)的生物材料: (bl)含有权利要求1-6中任一所述重组鼠肝炎冠状病毒的离体动物细胞或重组菌； (b2)含有权利 要求1-6中任一所述重组鼠肝炎冠状病毒的基因组RNA或cDNA的载体。
全文摘要
本发明公开了一种鼠肝炎冠状病毒的GFP示踪系统及其应用。本发明所提供系统为重组鼠肝炎冠状病毒，是将野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA进行替换或插入得到的重组病毒；所述替换为将所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的片段a中的任一片段换为片段b；所述插入为在所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的所述片段a中的任一位点处插入所述片段b；所述片段a为序列表中序列1编码的RNA；所述片段b为含有绿色荧光蛋白编码基因的DNA片段编码的RNA。本发明的MHV-GFP可与野生型病毒平行用于研究。另外，由于GFP的信号放大效应，MHV-GFP可极大提高病毒监测灵敏度，为建立新型低剂量病毒亚临床感染动物模型提供新思路，为抗冠状病毒药物筛选等应用研究也提供新技术平台。
文档编号C12N1/21GK103146656SQ20131007239
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者刘京梅, 常国辉, 孙走南, 柳洪涛, 户义, 吴晓燕, 张雨, 杨益, 苏文莉, 何湘 申请人:中国人民解放军疾病预防控制所