专利名称：一种提高诱导生成多能性干细胞效率的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高诱导生成多能性干细胞效率的方法。尤其涉及用修饰组蛋白基因jhdmla提高诱导生成多能性干细胞效率的方法。
背景技术：
我国是世界人口大国，每年因为创伤、疾病、衰老、以及遗传所导致的器官缺损、衰竭、功能障碍也居世界之首，以药物和手术治疗为基本支柱的经典医学治疗手段已不能满足临床医学的巨大需求，所以对干细胞与再生医学的研究受到了相当多科研单位以及社会各界的普遍重视。细胞移植治疗是再生医学研究的一个重要方向，特定类型的细胞移植可被用来治疗心脏损伤，神经系统退行性疾病，脊髓损伤，肾衰竭、血液系统疾病等等。然而，细胞移植治疗面临着异体排斥、细胞来源有限等很多难以解决的问题。干细胞是一类具有自我复制能力的细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类:全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称之为“万用细胞”。为了解决细胞移植治疗面临的问题，细胞命运的转化受到越来越多科学家的重视。虽然细胞分化和命运的决定一直认为是发育过程中不可逆转而且是稳定的过程，而在体外，越来越多的证据表 明，这一过程是可以被逆转的。对于细胞命运调节的研究还只是处于实验室研究状态，离临床实验还有很长的距离。这些通过转录因子过表达获得的转化的细胞还存在很多应用上的难题，比如说，病毒插入、潜在致瘤性、获得转分化细胞的纯度、在机体内能否弥补正常细胞发挥应有的功能等
坐寸ο诱导多能性干细胞(iPS, Induced pluripotent stem cell)是一种类似于胚胎干细胞、具有发育全能性的细胞，通过导入特定的基因诱导体细胞使其获得干细胞特性。2006年日本科学家Yamanaka将24个候选基因用逆转录病毒一起导入小鼠成纤维细胞，通过G418抗性筛选FBX15阳性细胞从而分离出类似胚胎干细胞的iPS克隆，最终鉴定出0ct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4这4个因子足以诱导小鼠FBX15_iPS细胞产生，这些细胞具有与胚胎干细胞相似的形态、增殖能力以及形成畸胎瘤的能力，但是在基因表达以及甲基化模式方面却与胚胎干细胞不同，也不能够得到活体的嵌合体小鼠；随后，该小组和其他两个小组改变筛选方法，他们以Nanog阳性细胞作为标准，得到了在多个方面均与胚胎干细胞相似的iPS，这种细胞能够产生嵌合体后代。最近，三个研究组应用四倍体互补试验分别独立证明了小鼠的iPS细胞能够发育成一个个体，具有发育全能性。
遵循诱导小鼠iPS试验的方法，2007年Yamanaka [8]和俞君英[9]两个小组分别成功地将人的体细胞重编程为iPS细胞，前者应用逆转录病毒将0ct3/4，Sox2, c-Myc, Klf4转导入人的表皮成纤维细胞，后者则是应用慢病毒将0ct3/4，Sox2, Nanog, Lin28导入包皮细胞。基因表达谱分析，0ct3/4，Nanog基因启动子区域甲基化分析都表明人的iPS细胞系与相应的胚胎干细胞系非常相似，将这些细胞注射到裸鼠体内，都能够发育成3个胚层组织。此外，能够成功诱导体细胞转变成iPS不仅限于小鼠和人，还有大鼠、猪和猴。能够成功重编程的细胞不仅限于成纤维细胞，很多其他类型的成体细胞也能够被诱导成为iPS细胞,包括胰腺beta细胞、成体神经干细胞、肝细胞、胃细胞、成熟B细胞、造血细胞、脑膜细胞、脂肪干细胞、脐带血细胞、外周血CD34阳性细胞、角质细胞。处于分化不同阶段的细胞，诱导其重编程为iPS的难易程度也不同，以小鼠的造血细胞为例:造血干细胞和造血祖细胞的重编程效率可以达到28%，是末端分化T细胞、B细胞的300倍。在诱导iPS过程中常借助于逆转录病毒、慢病毒将外源基因导入细胞，通过这种方式可以得到很高的基因转导效率，但是由于病毒序列整合到细胞的基因组中，会导致基因插入突变发生，甚至具有致癌性，所以这种具有潜在危险性的基因导入方法显然不利于iPS技术在再生医学领域的应用，因此不同的研究小组采用了非整合载体来诱导iPS并取得了成功,这些载体包括腺病毒载体、普通表达载体、转座子、附加体载体、小环DNA(minicircle DNA)载体。
Sox2, Klf4, 0ct3/4, c_Myc 和 Sox2, 0ct3/4, Nanog, Lin28 两种组合都能够成功诱导iPS产生，进一步的研究发现c-Myc不是重编程所必需的，仅有三个转录因子Sox2，Klf4，0ct3/4足以推动人和小鼠的体细胞重编程。神经干细胞内源表达高水平的Sox2、Klf4、c-Myc，因此只需要导入外源0ct3/4就足以成功诱导iPS。重编程所用的转录因子中，Sox2、Klf4和c-Myc都能够被同家族的其他成员所替代，例如Klf2和Klf5能够替代Klf4 ；Soxl和Sox3能够替代Sox2 ；N-Myc和L-Myc能够替代c_Myc ;但是Octl和0ct6并不能替代0ct4。Esrrb直接与0ct3/4蛋白相结合调控干细胞自我更新和全能性，在重编程过程中Esrrb能够替代Klf4，与Sox2、0ct3/4组合即能够诱导iPS ；0ct3/4是重编程过程中极为重要的一个转录因子，最近研究发现核受体LRH-1 (Nr5a2)和Nr5al能够替代0ct3/4，其与Klf4、Sox2组合即能够诱导小鼠成体细胞转变成iPS。但是，目前能够重编程的转录因子组合有0ct4, Klf4, Sox2, c-Myc; 0ct4, Nanog, Lin28, Sox2; Sox2, Klf4和Lrhl; 0ct4, bmil等几种不同的组合以及esrrb, tbx3等与重编程相关的基因，现有的重编程方法所需要的转录因子组合需要导入的转录因子多达三个或四个，而且诱导效率低下，如何减少转录因子并且保持较高的重编程效率对于减少重编程细胞突变的积累，提高重编程技术的可操作性具有重要的意义。而且，寻找替代常用转录因子的基因有利于重编程机理的研究和重编程技术的改进。
发明内容
本发明的目的是提供一减少转录因子并且保持较高的重编程效率对于减少重编程细胞突变的积累，提高重编程技术的可操作性的方法。为实现该目的，采用如下技术方案提供一种提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，包括如下步骤:
a、将转录因子与Jhdmlb转入哺乳动物的成体细胞，在诱导培养基中培养，，诱导获得多能性干细胞克隆，所述转录因子为单独的0ct4，或0ct4和Klf4和Sox2的组合，或0ct4、Klf4、c-Myc 和 Sox2 的组合；b、将诱导获得的多能性干细胞克隆在干细胞培养基中培养扩增。本发明的另一个技术方案为提供一种提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，包括如下步骤:a、将转录因子与Jhdmlb转入哺乳动物的成体细胞，在诱导培养基中培养，所述诱导培养基包含维生素C，诱导获得多能性干细胞克隆，所述转录因子为单独的0ct4，或0ct4和Sox2的组合，或0ct4、Klf4的组合， 或0ct4、Klf4和Sox2的组合，或0ct4和Klf4和Sox2和c-myc的组合；b、将诱导获得的多能性干细胞克隆在干细胞培养基中培养扩增，。优选的，以上步骤为:a、将转录因子与Jhdmlb转入哺乳动物的成体细胞，在诱导培养基中培养，诱导获得多能性干细胞克隆，所述转录因子为单独的0ct4,或0ct4和Sox2的组合,或0ct4和Klf4的组合，或0ct4和Klf4和Sox2的组合；b、将诱导获得的多能性干细胞克隆在干细胞培养基中培养扩增。优选的，所述转录因子和Jhdmlb为具有多能干细胞诱导功能的编码或非编码RNA、蛋白质或多肽。优选的，所述将Jhdmlb转入哺乳动物的成体细胞是以包含能够表达Jhdmlb的载体导入细胞中来实现的。优选的，所述载体为病毒载体、质粒载体、外随体载体、mRNA载体或直接化学合成。优选的，所述病毒载体为逆转录病毒，所述逆转录病毒为pMXs载体。优选的，所述Jhdmlb是进行去甲基化修饰的多肽，其功能性变体以及其功能性片段。优选的，所述哺乳动物的成体细胞为成纤维细胞、神经细胞、造血细胞和神经胶质细胞。优选的，所述哺乳动物的成体细胞为小鼠胚胎成纤维细胞。本发明还提供又一个技术方案为提供一种提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，包括如下步骤:a、将转录因子与Jhdmlb和Jhdmla转入哺乳动物的成体细胞，在诱导培养基中培养，诱导获得多能性干细胞克隆，所述转录因子为单独的0ct4，或0ct4和Sox2的组合，或0ct4和Klf4的组合，或0ct4和Klf4和Sox2的组合；b、将诱导获得的多能性干细胞克隆在干细胞培养基中培养扩增。优选的，上述方法包括如下步骤:a、将转录因子与Jhdmlb和Jhdmla转入哺乳动物的成体细胞，在诱导培养基中培养，所述诱导培养基包含维生素C，诱导获得多能性干细胞克隆，所述转录因子为0ct4 ；b、将诱导获得的多能性干细胞克隆在干细胞培养基中培养扩增，所述干细胞培养基包含维生素C。本发明还提供又一个技术方案为提供一种提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，包括如下步骤:a、将转录因子与Jhdmla转入哺乳动物的成体细胞，在诱导培养基中培养，诱导获得多能性干细胞克隆，所述哺乳动物的成体细胞为小鼠胚胎成纤维细胞，所述诱导培养基包括DMEM高糖培养基、15%的胎牛血清、0.1mM非必需氨基酸，2mML-谷氨酰胺，ImM丙酮酸钠，55μΜβ巯基乙醇，50U/mL青霉素，50 μ g/mL链霉素和1000U/ml白血病抑制因子，所述转录因子为0ct4、Klf4和Sox2的组合或0ct4、Klf4、Sox2和C-Myc的组合优选的，上述方法还包括步骤b:将诱导获得的多能性干细胞克隆在干细胞培养基中培养扩增，所述干细胞培养基为步骤a所述诱导培养基。优选的，上述方法中所述将Jhdmla转入哺乳动物的成体细胞是以包含能够表达Jhdmla的载体导入细胞中来实现的。优选的，上述方法中所述载体为病毒载体、质粒载体。优选的，上述方法中所述病毒载体为逆转录病毒，所述逆转录病毒为pMXs载体。本发明还提供又一个技术方案为提供一种提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，包括如下步骤:a、将转录因子与Jhdmla转入哺乳动物的成体细胞，在诱导培养基中培养，诱导获得多能性干细胞克隆，所述哺乳动物的成体细胞为小鼠胚胎成纤维细胞，所述诱导培养基包括DMEM高糖培养基、15%的胎牛血清、0.1mM非必需氨基酸，2mML-谷氨酰胺，ImM丙酮酸钠，55μΜβ巯基乙醇，5(^/11^青霉素，5(^8/1^链霉素，100(^/1111白血病抑制因子和50 μ g/mL维生素C,所述转录因子为单独的0ct4,或0ct4和Sox2的组合,或0ct4和Klf4的组合，或0ct4和Klf4和Sox2的组合，或0ct4、Klf4、Sox2和C-Myc的组合；优选的，上述方法还包括步骤b:将诱导获得的多能性干细胞克隆在干细胞培养基中培养扩增，所述干细胞培养基为步骤a所述诱导培养基。优选的，上述方法中所述将Jhdmla转入哺乳动物的成体细胞是以包含能够表达Jhdmla的载体导入细胞中来实现的。优选的，上述方法中所述载体为病毒载体、质粒载体。优选的，上述方法中所述病毒载体为逆转录病毒，所述逆转录病毒为pMXs载体。本发明的有益效果为利用对组蛋白进行修饰的多肽Jhdmlb、Jhdmla和干细胞诱导因子提高了诱导多能干细胞的效率，提高了诱导多能干细胞的质量。相比于现有的诱导多能干细胞的方法，本发明的方法用较少的干细胞诱导因子种类实现了更好的效果，优选地本发明的方法使用0ct4、Klf4和Sox2, 0ct4和Klf4，0ct4和Sox2,以及单独的0ct4。本发明的方法还包括将所述细胞暴露于维生素C，其相比于不使用维生素C进一步提高了诱导多能干细胞的效率。本发明的方法通过使用较少的干细胞诱导因子降低了潜在的致癌性，同时获得了较高的诱导效率，并可以得到高质量的具有生殖系传递能力的诱导多能干细胞。
图1显示了 Jhdmla或Jhdmlb提高SKO介导的诱导多能性干细胞效率的数据,其中对照是没有插入任何基因序列的pMXs- FLAG空载体；图2为Jhdmla或jhdmlb促进SKOM介导的重编程效率数据图3显示了在维生素C存在的条件下，jhdmla和jhdmlb共同作用能够在只有S0、KO以及0ct4的条件下进行重编程；图4中a, d为0ct4+jhdmlb (简写为0B)最终形成的诱导多能干细胞的显微照片；
b,e为OB最终形成的诱导多能干细胞注射囊胚后发育形成的嵌合体后代照片；c，f为OB最终形成的诱导多能干细胞注射囊胚后发育形成的嵌合体与野生型小鼠个体交配后产生的后代的照片；图5显示了对多能干细胞克隆的基因组DNA进行PCR扩增的结果表明OB诱导的多能干细胞克隆C4、C14、C15和C16基因组中只有0ct4和Jhdmlb整合，对照是感染Sox2、klf4.0ct4.cMyc和Jhdmlb的细胞提取的基因组DNA，MEF表示从小鼠胚胎成纤维细胞中提取的基因组DNA;
图6显示了定量PCR结果，表明OB诱导的多能性干细胞克隆C4、C14、C15和C16外源基因被沉默表达，其中OB D4对照是从感染0ct4和Jhdmlb并培养4天后的细胞中提取的mRNA反转录得到的cDNA模板，MEF是小鼠胚胎成纤维细胞；图7显示了实时定量PCR结果，其表明OB诱导的多能干细胞克隆C4、C14、C15和C16表达胚胎干细胞特异性基因，其中Rl是小鼠胚胎干细胞系，MEF是小鼠胚胎成纤维细胞；图8显示了免疫荧光的结果，其表明OB诱导的多能干细胞克隆C14表达胚胎干细胞特异性基因Rexl和胚胎干细胞特异性表面标记物SSEA-1，其中Marker表示干细胞特异性标记分子(即Rexl或SSEA-1)；图9显示了小鼠胚胎成纤维细胞和诱导的多能性干细胞的0ct4邻近启动子区域里CpGs甲基化实测程度分析结果；图10显示了小鼠胚胎成纤维细胞和诱导的多能性干细胞的Nanog邻近启动子区域里CpGs甲基化实测程度分析结果；图11显示了 0ct4和Jhdmlb诱导产生的多能干细胞的核型图；图12显示了 Jhdmlb的不同突变体诱导多能性干细胞的效率。Jmjc突变是将221位的组氨酸、222位的异亮氨酸、223位的天冬氨酸均突变为丙氨酸；CxxC突变是将586、589和592位的半胱氨酸突变为丙氨酸；图13显示了 pMXs-FLAG质粒图谱。
具体实施例方式本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员例如具体可参考Current Protocols in MolecularBiology, edited by Ausubel, et al, John Wiley&Sons, 2009。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或I字母代码。尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。本文中所使用的术语“多肽”、“蛋白质”可互换地表示通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基，其可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。特别地，本文所述多肽是人和/或小鼠来源的多肽。本文使用的术语“变体”、“多肽变体”或“类似物”表示通过一个或多个取代、缺失、插入、融合、截短或其任意组合在氨基酸序列上有所不同的多肽。变体多肽可以是完全功能性的或者可缺乏一种或多种活性的功能。本文使用的术语“功能性变体”表示含有例如仅仅保守性改变或非关键残基或非关键区域的改变，并且保留原始多肽的功能。功能性变体还可包含相似氨基酸的替换，其导致功能未改变或不显著的改变。可以通过本领域已知的方法鉴定对于功能来说重要的氨基酸，所述方法例如定点诱变或甘氨酸扫描诱变(Cunningham, B.Wells, J., Science, 244:1081-1085,1989)。可以例如通过结构分析如结晶、核磁共振或光亲和标记来确定对于多肽活性来说关键的位点(Smith, L.等，J.Mol.Biol.,224 =899-904,1992 ；de Vos, A.等，Science，255:306_312，1992)。在本发明的实施方案中，Jhdmla的变体选自:包含与SEQ ID NO:1所编码的氨基酸序列有至少70%同源性(优选80%、90%、95%、98%、99%)的氨基酸序列的多肽。在本发明的另一些实施方案中，Jhdmlb的变体选自:包含与SEQ ID NO:2所编码的氨基酸序列有至少70%同源性(优选80%、90%、95%、98%、99%)的氨基酸序列的多肽。所述Jhdmla编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:7o本文使用的术语“片段”指仅有全长序列一部分的分子。例如，Jhdmlb多肽片段是截短的Jhdmlb。片段可含有来自全长序列任一端的序列，或者它们可含有来自全长序列中间的序列。片段可以是“功能性片段”，例如保留全长多肽的一种或多种功能的片段。本文使用的术语“功能性片段”表示所述片段保留了全长多肽的功能，例如诱导多能性干细胞或者提高诱导多能性干细胞效率。除非另外指明，在本文中提到多肽、核酸或其它分子时，其含义包括了功能性变体和功能性片段。例如，Jhdmlb和Jhdmla还分别表示天然Jhdmlb和Jhdmla的功能性变体和功能性片段。本文使用的术语“Jhdmlb”可以表示含JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶(JmjC-domain-containing histone demethylase, JHDM)家族中一个进化上保守且普遍表达的成员，其也被称为FbxllO。特别地，所述多肽是人和/或小鼠来源的。本文使用的术语“Jhdmla”可以表示含JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶(JmjC-domain-containing histone demethylase, JHDM)家族中的另一个成员，其也被称为Fbxlll。特别地，所述多肽是人和/或小鼠来源的。本文使用的术语“诱导的多能干细胞”、“诱导的多能性干细胞”、“诱导性多能干细胞”、“诱导多能干细胞”或者“iPS” (induced pluropotent stem cells)可互换地使用，表示人工地将非多能性细胞(例如体细胞)诱导而成的多能性干细胞。所述诱导通常是通过强制(forced)表达特定基因来实现的，这一过程在本文中也称为“将细胞诱导成多能性干细胞”。本文使用的术语“干细胞诱导因子”表示能够单独地或与其他因子相组合地将细胞诱导成多能性干细胞的因子，例如蛋白质、多肽、编码或非编码RNA等。优选地，所述干细胞诱导因子是转录因子，包括0ct-3/4、Sox家族成员、Klf家族成员、Myc家族成员、Nanog、LIN28等。优选地, 所述干细胞诱导因子选自0ct4、Klf4、Sox2和c_myc中的一种或多种。更优选地，所述干细胞诱导因子至少包括0ct4。特别地，所述多肽是人和/或小鼠来源的。本文使用的术语“0ct4”表示八聚体转录因子家族(the family of octamertranscription factors)的一个成员，其在维持细胞的多能性上起到关键作用。在文献中，0ct4也曾被称为0ct3。本文使用的术语“Klf4”表示Kriippel样转录因子家族(Kriippel-like family oftranscription factors)的一个成员。本文使用的术语“Sox2”表示Sox转录因子家族的成员之一。本文使用的术语“c-myc”表示本领域技术人员熟知的一种转录因子，其调控许多基因的表达，募集组蛋白乙酰基转移酶，并且其突变与许多癌症有关。本文使用的术语“组蛋白修饰”表示多种对组蛋白的修饰，例如乙酰化、甲基化、去甲基化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等。特别地，所述组蛋白修饰包括组蛋白的去甲基化。本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如家养动物(如狗、猫等)，家畜(如牛、羊、猪、马等)或实验动物(如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。本文使用的术语“一致性”、“百分比一致性”、“同源性”或“同一性”指两个氨基酸序列之间或者核酸序列之间的序列同一性。可以通过比对两个序列来确定百分比一致性，百分比一致性指所比较的序列共有位置相同残基(即氨基酸或核苷酸)的数量。可使用本领域的标准算法(例如 Smith 和 Waterman, 1981, Adv.App1.Math.2:482;Needleman和 Wunsch, 1970，J.Mo1.Biol.48: 443 ; Pearson 和 Lipman, 1988，Proc.Natl.Acad.Sc1., USA, 85:2444)或者通过这些算法的计算机化版本(Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0, Genetics Computer Group, 575Science Drive, Madison, WI)进行序列比对和比较，所述计算机化版本公开可用为BLAST和FASTA。另外，通过美国国家卫生研究院(Bethesda MD)可用的ENTREZ可用于序列比较。当使用BLAST和缺口 BLAST程序时，可使用各个程序(例如BLASTN，在美国国家生物技术信息中心的因特网站点上可用)的缺省参数。在一个实施方案中，可使用缺口权重为I的GCG来确定两个序列的百分比同一性，使得每个氨基酸缺口给予权重如同它是两个序列间的单氨基酸不匹配。或者，可使用ALIGN程序(2.0版),其是GCG (Accelrys, San Diego, CA)序列比对软件包的一部分。本文中的术语“载体”以本领域技术人员熟知的意义使用，其可以是表达载体。所述载体可包括病毒(例如痘病毒、腺病毒、杆状病毒等)；酵母载体、噬菌体、染色体、人工染色体、质粒、粘粒、附加体载体、mRNA载体或直接化学合成。优选的，所述病毒载体为逆转录病毒和/或慢病毒载体。更优选地，所述逆转录病毒为PMXs载体。本文中使用的术语“过量的”表示显著地高于正常水平，特别地表示多肽的表达量统计学显著地高于正常细胞中的表达量。优选地，高出20%、50%、100%、200%或者甚至5倍、10倍或100倍。本文中使用的术语“过表达”表示表达水平显著地高于正常水平，特别地表示多肽的表达量统计学显著地高于正常细胞中的表达量。优选地，高出20%、50%、100%、200%或者甚至5倍、10倍或100倍。
本文使用的术语“导入”表示将外源物质(如核酸或蛋白质)引入细胞的过程，例如通过磷酸钙转染、病毒感染、脂质体转染、电穿孔或基因枪等方式进行。
在本文中，将外源的多肽递送进细胞可通过多种方式进行，例如通过运载体和/或转运因子进行，优选通过脂质体、细菌多肽片段等(可参见W02002/079417，其内容通过引用并入本文)。本发明方法可使用的细胞优选地是哺乳动物细胞，更优选人和小鼠细胞。特别地，所述细胞是体细胞，例如:上皮细胞、神经细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌细胞、造血细胞、免疫细胞、淋巴细胞等。更特别地，所述细胞是胰腺beta细胞、成体神经干细胞、肝细胞、胃细胞、成熟B细胞、造血细胞、脑膜细胞、脂肪干细胞、脐带血细胞、外周血⑶34阳性细胞、角质细胞等。实施例1: 1、包含Jhdmla和Jhdmlb编码区的载体的构建:a.克隆引物设计从http://www.ncb1.nlm.nih.gov/pubmed 获取 Jhdmla 和 Jhdmlb 的 cDNA 的序列信息。其中Jhdmla cDNA克隆区序列为SEQ ID NO:1, Jhdmlb cDNA克隆区序列为SEQ IDNO:2，通过设计特异性的引物扩增Jhdmla和Jhdmlb的编码序列。Jhdmla上游引物碱基序列如SEQ ID NO:3所示；Jhdmla下游引物碱基序列如SEQ ID NO:4所示；Jhdmlb上游引物碱基序列如SEQ ID NO:5所示；Jhdmlb下游引物碱基序列如SEQ ID NO:6所示。b.通过RT-PCR扩增编码序列从分离的ICR小鼠的胚胎成纤维细胞(MEF)和人Hl胚胎干细胞中按照下述方法提取总mRNA:去除培养盘中的培养基，以3-5毫升的生理盐水(PBS) (Gibco公司)清洗细胞并弃去漂洗液然后向培养盘中加入I毫升细胞裂解液Trizol (Takara公司),用移液枪吸取混合液并轻柔吹打细胞使其完全溶解在裂解液中，随后将其转移至干净的1.5毫升离心管中于负80°C保存或立即进行下面的提取步骤。接下来，加入200微升的三氯甲烷，颠倒混匀约30秒，然后于4°C 12000转离心5分钟。小心吸取上清转移至洁净的1.5毫升离心管中，随后加入等体积的异丙醇并混匀，室温放置5分钟后12000转4°C离心5分钟，管底可见白色小块沉淀；小心弃去上清,接着加入80%乙醇溶液500微升用于漂洗掉残余的异丙醇，12000转离心，去除乙醇溶液，室温放置30分钟使管底的白色总mRNA充分干燥。随后，向离心管中加入30-50微升的双蒸水于55°C孵育，30分钟后取出，用分光光度计测定总mRNA浓度。所提取的总mRNA于负80°C保存或直接用于反转录制备cDNA备用。反转录具体过程和方法如下所述。通常取I微克的总mRNA进行反转录，加入寡聚脱氧核糖脲卩密唳核苷酸(oligodT, takara公司)，dNTP (takara公司)，RTace (Toyobo公司)，RT buffer和RRI (RNAse抑制剂，takara公司)和不含RNase/DNase的水，于PCR仪上42°C反应60分钟，然后98°C孵育五分钟，随后冷却至室温。反转录成功后，从中取出0.5微升作为模板，使用上述方法设计的引物，采取聚合酶链式反应扩增目的基因，所用的试剂有高保真聚合酶KOD及其缓冲液(Toyobo公司)，dNTP (Takara公司)，引物，在PCR仪上运行下述程序:96°C变性5分钟，95°C 30秒，60°C退火25秒，68°C延伸3.5分钟，2-4步循环32次。c.质粒构建
请参阅图13，完成扩增反应后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，应用凝胶回收试剂盒(天根公司，DP214-03)提取PCR片段。pMXs载体(载体购自addgene，插入多克隆位点和FLAG标签序列)，改造后的pMXs载体被称为pMXs-FLAG，其质粒图参见图13。以pmel酶切，应用CIAP小牛肠碱性磷酸酶对其去磷酸化以防止载体自连。用凝胶回收试剂盒(天根公司，DP214-03)回收处理好的载体备用。pMX-FLAG载体和Jhdmla/Jhdmlb的基因片段应用连接试剂盒(Takara公司，DNA Ligation Kit)进行,然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细菌，挑选阳性克隆，提取质粒，测序确定，最后大量制备质粒。2、将Jhdmla/Jhdmlb以及多能性干细胞诱导因子(转录因子)的编码序列导入小鼠胚胎成纤维细胞。如无特殊说明，基于小鼠的体细胞重编程均采用如下方式进行。培养基饲养层细胞、MEF细胞和PlatE细胞的培养基组成为:高糖基础培养基DMEM(gibco)，外加 10% 胎牛血清(FBS，PAA)。诱导培养基:本发明使用实验室常规的诱导培养基，优选使用的诱导培养基成分包括DMEM高糖培养基(Gibco)、15%的胎牛血清(FBS, Gibco)、0.1mM非必需氨基酸(NEAA, Gibco), 2mML_ 谷氨酸胺(Glutamax, Gibco), ImM 丙酮酸钠(sodiumpyruvate, Gibco), 55 μ Μβ 巯基乙醇(β-ME, Gibco),青霉素(50U/mL)和链霉素(50 μ g/mL)，白血病抑制因子1000U/ml (LIF，Millipore)，根据需要添加维生素C (sigma)，其浓度是50微克每晕升。干细胞培养基:本发明使用实验室常规的干细胞培养基，优选mES干细胞培养基，其组分为:高糖DMEM培养基添加15%胎牛血清、0.1mM非必需氨基酸(NEAA, Gibco)，2mML-谷氨酸胺(Glutamax, Gi bco), ImM 丙酮酸钠(sodium pyruvate, Gibco)、55 μ Mβ巯基乙醇(gibco)、青霉素(50U/mL)和链霉素(50 μ g/mL),白血病抑制因子1000U/ml(LIF, Millipore)。根据需要添加维生素C (sigma),其浓度是50微克每毫升。KSR无血清培养基:KSR为Knockout Serum Replace的缩写，为一种商品化代血清干细胞培养添加剂，用于培养干细胞或iPS克隆的完全KSR无血清培养基，其组成成分为:KNOCKOUT DMED (一种渗透压经过优化的适于干细胞培养的基础培养基)，15%KSR添加齐[J, 0.1mM 非必需氨基酸(NEAA, Gibco), 2mML-谷氨酰胺(Glutamax, Gibco), ImM 丙酮酸钠(sodium pyruvate, Gibco), 55 μ M β 疏基乙醇(β-ME, Gibco),青霉素(50U/mL)和链霉素(50 μ g/mL)，白血病抑制因子1000U/ml(LIF，Millipore),。所有iPS过程与克隆培养基都添加鼠白细胞抑制因子LIF (millipore，商品名为ESGR0，为一种抑制小鼠干细胞分化的生长因子)，添加的终浓度为1000U/ml。3、用于重编程的细胞重编程采用的体细胞类型均为0G2小鼠胚胎成纤维细胞(由实验室自制)，传代数不超过三代。0G2小鼠的一个特点是在干细胞特异表达基因0ct4基因的启动子后连有绿色荧光蛋白(GFP)。在重编程过程中，当0G2小鼠胚胎成纤维细胞内源0ct4被激活时，绿色荧光蛋白伴随表达，在荧光显微镜下，可见成功重编程的细胞或克隆细胞团块呈现绿色，通过直接统计重编程克隆即绿色荧光克隆数或采用流式细胞仪分析绿色荧光细胞的比率，可以容易地比较不同条件下的重编程效率。
如下所述准备重编程细胞。以20000个细胞/孔的密度种植细胞于12孔培养板(Corning),细胞种植6_18小时后,视其密度和状态用带有小鼠重编程因子的病毒进行感染。4、病毒的制备用于重编程的转录因子包括小鼠0ct4、Sox2、Klf4、c_Myc的cDNA的逆转录病毒载体 pMXs (来自 Addgene 公司，编号分别为 Plasmidl3366, Plasmid 13367, Plasmidl3370和 Plasmidl3375);0ct4，NCBI 登录号为 NM_013663 ;Sox2，NCBI 登录号为 NM_011443 ；Klf4,NCBI登录号为010637 ;c_Myc，NCBI登录号为NM_001177353。应用自制的磷酸钙转染试剂将PMX载体上的重编程因子质粒转染进病毒包装细胞(PlatE)，具体过程:接种750万PlatE细胞于10厘米直径的培养盘(Corning)，12小时后以7.5毫升不含青霉素/链霉素的培养基更换掉旧的培养基，随后将细胞放进培养箱。接下来准备转染混合物:取25微克质粒加入15毫升离心管，按序依次加入156.25微升2M的氯化钙溶液，补加适量水使三者的总体积为1.25毫升，混合均匀，然后加入1.25毫升HBS溶液，立即混合均匀，然后静置2分钟，随后逐滴加入PlatE培养盘中，混合均匀。转染后9-12小时，更换10毫升新鲜培养液，转染后48小时收集培养液并以0.45微米滤膜过滤培养液，作为第一次感染用病毒液，添加新鲜培养液24小时后如此再收集培养液作为第二次感染病毒液。5、用病毒感染MEF细胞:感染分两轮进行，所用的诱导因子均同时感染细胞，12孔板的每个孔感染病毒用量为I毫升，第一轮 感染后24小时后进行第二轮感染,第二轮感染后24小时将病毒液更换成mES培养基(前述)。换液当天记为第O天(D0);感染后不同时间点，按实验需要在原孔内数GFP荧光克隆数或采用流式细胞仪分析GFP荧光细胞的比率。6、对感染后的细胞进行培养直到干细胞克隆形成:使用玻璃针将形态隆起，边缘清晰的胚胎干细胞样的单个克隆挑选出来，直接转移至提前铺好饲养层细胞(饲养层细胞为丝裂霉素处理过的ICR小鼠成纤维细胞)的培养板(Corning)中以KSR培养基进行培养。感染后的第2天，将培养体系更换为新鲜的诱导培养基，之后每天更换诱导培养基直到实验完成。按上文所述干细胞克隆形成的方法，用不同的多能干细胞诱导因子组合进行实验。各多能干细胞诱导因子组合说明如下:Kif4, Sox2, c-Myc, 0ct4 的组合简写为 SKOM。Kif4, Sox2, 0ct4 的组合简写为 SK0。Kif4, 0ct4的组合简写为K0。Sox2，0ct4的组合简写为SO。0ct4与Jhdmlb的组合简写为0B。C4、C14、C15、C16是从OB诱导的重编程细胞中挑选的四株克隆。选用各干细胞诱导因子组合实验结果如下:请参阅图1，无论是否有维生素C的存在，Jhdmla或Jhdmlb对于重编程的效率都有明显地提高，在维生素C存在的条件下，增加幅度更为显著，图1显示了 Jhdmla或Jhdmlb提高SKO介导的诱导多能性干细胞效率的数据，其中对照是没有插入任何基因序列的pMXs-FLAG空载体；请参阅图2，无论是否有维生素C的存在，Jhdmla或Jhdmlb对于重编程的效率都有明显地提高，在维生素C存在的条件下，增加幅度更为显著，图2显示了 Jhdmla或Jhdmlb提高SKOM介导的诱导多能性干细胞效率的数据，其中对照是没有插入任何基因序列的pMXs-FLAG 空载体；请参阅图3，在维生素C存在的条件下，Jhdmla和Jhdmlb共同作用，能够使得在只有S0、K0或者0ct4的条件下诱导多能性干细胞，mESC+Vc表示诱导过程中所用的培养基是干细胞培养基mES，并且添加了 50 μ g/ml的维生素C，其中对照是pMXs-FLAG空载体。因此，本发明得出，Jhdmla和Jhdmlb能够显著改善诱导多能性干细胞的效率，在保持较高的重编程效率大大减少所需导入的转录因子的种类，从而对于减少重编程细胞突变的积累，减少其致癌性提供了重大的益处。另外，本发明的方法也提高重编程技术的可操作性，降低了操作的难度，为后续的医药用途提供了便利。实施例2:对实施例1所得诱导性多能干细胞的鉴定:如图3以及图6至图10所示，对0ct4和Jhdmlb诱导的多能干细胞克隆进行一系列鉴定实验，以证明其是否为iPS细胞(诱导性多能干细胞)，鉴定实验包括:定量PCR、免疫荧光分析其表面标记物、启动子甲基化程度分析、核型鉴定、嵌合体形成等。定量PCR实验:所有定量PCR实验均应用Takara公司的试剂盒在Biorad公司CFX-96型定量PCR仪上完成，所用反应条件是95°C 2分钟`；95°C 10秒，60°C 30秒，读取荧光值，如此重复40个循环。启动子区域甲基化状况分析该分析通过亚硫酸氢钠测序方法进行测定。提取目的细胞中的基因组DNA(Promega 公司，Wizard*1 Genomic DNA Purification Kit),测定浓度值，将约 2ugDNA于1.5mlEP管中使用ddH20稀释至50 μ 1，加入5.5ul新鲜配制的3MNa0H并于42°C水浴30min ;随后取出溶液,加30 μ I体积的IOmM对苯二酹(氢醌)(sigma)至上述水浴后混合液中，然后再加520 μ I体积的3.6Μ亚硫酸氢钠(Sigma，S9000)至上述水浴后溶液中，EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液；加200 μ I石蜡油，防止水分蒸发，防制氧化并于50°C避光水浴16h。随后，将移液器枪头伸入石蜡油层下，吸取混合液至一洁净1.5ml离心管中，使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统(Promega, A7280)对修饰后DNA进行回收，_20°C保存或进行下一步的实验。取50ng上述提取的DNA作为模板进行PCR反应，随后对PCR产物进行凝胶回收(天根公司，DP214-03)，然后将PCR产物与T载体(Takara公司)进行连接和转化，挑选阳性克隆送测序公司进行测序，得到结果进行比对，统计CpG岛的甲基化状态。iPS细胞的核型鉴定iPS细胞的核型鉴定按照下述方法进行:待做核型分析的细胞在收获前2-3小时加入0.1ml5ug/ml秋水仙素(市售，终浓度0.lug/ml)混匀后继续培养2-3小时，转入IOml离心管中，以1500-2000转/分钟离心10分钟，去上清液，加入8ml低渗液(0.075M Kcl,37°C预热)将细胞沉淀吹打均匀，放入温箱中37°C半小时，加入Iml新配制的固定液(甲醇:冰醋酸体积比为3:1的混合物，原料市售)，轻轻混匀后以与前面相同的转速和时间离心，吸去上清液。加入8mL固定液并充分将细胞混匀，室温固定至少半小时，重复离心后，去掉上清液，加入新鲜固定液再次固定至少半小时(最好过夜)经离心和去上清液后的细胞沉淀中加入约0.2ml新鲜固定液混匀，细胞悬液滴于预冷的载玻片上(以每张玻片3滴细胞悬液为宜)，酒精灯烘烤滴片，冷却后进行分带处理。囊胚嵌合体试验囊胚嵌合体试验，将iPS细胞注射到供体小鼠的囊胚腔中，再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中制作嵌合体小鼠，出生的小鼠根据毛色来判定是否产生嵌合。按以上方法进行实验，结果分析为:请参阅图5，显示了对多能干细胞克隆的基因组DNA进行PCR扩增的结果表明OB诱导的多能干细胞克隆C4、C14、C15和C16基因组中只有0ct4和Jhdmlb整合，对照是感染Sox2、klf4、oct4、cMyc和Jhdmlb的细胞提取的基因组DNA，MEF表示从小鼠胚胎成纤维细胞中提取的基因组DNA ；请参阅图6，显示了定量PCR结果，表明OB诱导的多能性干细胞克隆C4、C14、C15和C16外源基因被沉默表达，其中OB D4对照是从感染0ct4和Jhdmlb并培养4天后的细胞中提取的mRNA反转录得到的cDNA模板，MEF是小鼠胚胎成纤维细胞；请参阅图7,如图7所示,显示了实时定量PCR结果,其表明OB诱导的多能干细胞克隆C4、C14、C15和C16表达胚胎干细胞特异性基因，其中Rl是小鼠胚胎干细胞系，MEF是小鼠胚胎成纤维细胞；使用0ct4和Jhdmlb组合得到的干细胞的内源性胚胎干细胞转录因子等表达量与胚胎 干细胞表达基本一致。表明OB诱导的多能干细胞克隆C4、C14、C15和C16表达胚胎干细胞特异性基因，因此说明通过本发明方法诱导得到的多能性干细胞具有多能性干细胞的特征。请参阅图8,如图8所示，免疫突光结果显示OB得到的多能干细胞表面表达SSEA-1，而且表达Rexl。请参阅图9，显示0ct4启动子区域的CpG岛甲基化状态分析，供体细胞的CpG岛未甲基化，而诱导多能干细胞相应位置的CpG岛发生显著的去甲基化。请参阅图10，显示Nanog启动子区域的CpG岛甲基化状态分析，0B-C14、0B_C15和0B-C16分别是由0ct4和Jhdmlb诱导产生的多能干细胞的三株多能干细胞。黑色部分为表示已甲基化，白色表示没有甲基化。供体细胞的CpG岛未甲基化，而诱导多能干细胞相应位置的CpG岛发生显著的去甲基化；Nanog和0ct4是胚胎干细胞特异性表达的基因，表达状态与细胞的命运密切相关，这些结果说明，使用OB组获得的细胞其命运发生了改变，也就是说被诱导成为了多能性干细胞。请参阅图11，显示通过本发明方法得到的干细胞的核型正常，0B-C14、OB-C15和OB-C16分别是由0ct4和Jhdmlb诱导产生的多能干细胞的三株多能干细胞，它们都具有正常的核型。请参阅图4，如图4所示:a，d为0ct4+jhdmlb(简写为0B)最终形成的诱导多能干细胞的显微照片山，e为OB最终形成的诱导多能干细胞注射囊胚后发育形成的嵌合体后代照片；c，f为OB最终形成的诱导多能干细胞注射囊胚后发育形成的嵌合体与野生型小鼠个体交配后产生的后代的照片；显示了通过本发明方法得到的干细胞可以形成嵌合体，其中供体细胞为诱导的多能干细胞，其细胞来源是0G2/129细胞，而假孕小鼠是实验饲养的ICR小鼠。得到的嵌合体具有将原来供体细胞通过生殖系传递到下一代，说明此干细胞具有良好的质量。Jhdmlb变体的功能性测定:请参阅图12，如图12所示，在中发生突变的Jhdmlb变体不具有提高重编程效率的活性，因此Jhdmlb的DNA结合结构域(CXXC)和催化结构域(Jmjc)对于重编程是必须的，缺少任何一个均不能促进重编程。而且，0ct4和Jhdmlb的组合在普通的培养基条件下就可以完成重编程，在维生素C存在的条件下效果更加显著。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。序列表
权利要求
1.一种提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，其特征在于，包括如下步骤: a、将转录因子与Jhdmla转入哺乳动物的成体细胞，在诱导培养基中培养，诱导获得多能性干细胞克隆，所述哺乳动物的成体细胞为小鼠胚胎成纤维细胞，所述诱导培养基包括DMEM高糖培养基、15%的胎牛血清、0.1mM非必需氨基酸，2mML-谷氨酰胺，ImM丙酮酸钠，55μΜβ巯基乙醇，50U/mL青霉素，50μ g/mL链霉素和1000U/ml白血病抑制因子，所述转录因子为0ct4、Klf4和Sox2的组合或0ct4、Klf4、Sox2和C-Myc的组合。
2.如权利要求1所述的提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，其特征在于，还包括步骤b:将诱导获得的多能性干细胞克隆在干细胞培养基中培养扩增，所述干细胞培养基为步骤a所述诱导培养基。
3.根据权利要求2所述的提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，其特征在于，所述将Jhdmla转入哺乳动物的成体细胞是以包含能够表达Jhdmla的载体导入细胞中来实现的。
4.根据权利要求3所述的提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，其特征在于，所述载体为病毒载体、质粒载体。
5.根据权利要求4所述的提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，其特征在于，所述病毒载体为逆转录病毒，所述逆转录病毒为PMXs载体。
6.一种提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，其特征在于，包括如下步骤: a、将转录因子与Jhdmla转入哺乳动物的成体细胞，在诱导培养基中培养，诱导获得多能性干细胞克隆，所述哺乳动物的成体细胞为小鼠胚胎成纤维细胞，所述诱导培养基包括DMEM高糖培养基、15%的胎牛血清、0.1mM非必需氨基酸，2mML-谷氨酰胺，ImM丙酮酸钠，55μΜβ巯基乙醇，5 (^/1^青霉素，5(^8/1^链霉素，100(^/1111白血病抑制因子和50 μ g/mL维生素C，所述转录因子为单独的0ct4，或0ct4和Sox2的组合，或0ct4和Klf4的组合，或0ct4 和 Klf4 和 Sox2 的组合,或 0ct4、Klf4、Sox2 和 C-Myc 的组合。
7.如权利要求6所述的提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，其特征在于，还包括步骤b:将诱导获得的多能性干细胞克隆在干细胞培养基中培养扩增，所述干细胞培养基为步骤a所述诱导培养基。
8.根据权利要求7所述的提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，其特征在于，所述将Jhdmla转入哺乳动物的成体细胞是以包含能够表达Jhdmla的载体导入细胞中来实现的。
9.根据权利要求8所述的提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，其特征在于，所述载体为病毒载体、质粒载体。
10.根据权利要求9所述的提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，其特征在于，所述病毒载体为逆转录病毒，所述逆转录病毒为PMXs载体。
全文摘要
本发明涉及一种提高诱导生成多能性干细胞效率的方法，尤其涉及用修饰组蛋白基因jhdm1a提高诱导生成多能性干细胞效率的方法。本发明利用Jhdm1a和干细胞诱导因子提高了诱导多能干细胞的效率，提高了诱导多能干细胞的质量。所述干细胞诱导因子为Oct4、Klf4的组合，或Sox2、Oct4和Klf4的组合，或Oct4和Sox2的组合，以及单独的Oct4等。本发明的方法还包括将所述细胞暴露于维生素C，其相比于不使用维生素C进一步提高了诱导多能干细胞的效率。本发明的方法通过使用较少的干细胞诱导因子降低了潜在的致癌性，同时获得了较高的诱导效率，并可以得到高质量的具有生殖系传递能力的诱导多能干细胞。
文档编号C12N5/10GK103173490SQ201310072228
公开日2013年6月26日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者裴端卿, 王涛 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院