专利名称：一种优秀越野滑雪运动员体能相关基因的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选优秀越野滑雪运动员体能相关基因的分子生物学方法，具体是以基因芯片法及生物信息学分析对优秀越野滑雪运动员家系进行体能相关基因的筛选。适合于优秀越野滑雪运动员在基因上的早期选材，属于体育科学、遗传学、生物信息学与分子生物学交叉的学科领域。
背景技术：
越野滑雪是目前流行的极限运动项目之一。越野滑雪运动作为体能主导类项目，运动员的力量和耐力素质对运动成绩起着决定性作用。越野滑雪强调勇敢跨越心理障碍时所获得的愉悦感、成就感，也追求竞技体育超越生理极限的“更快、更高、更强”。所以作为越野滑雪运动中最艰苦的运动项目之一，越野滑雪运动员在训练和比赛中，除了要求具有对寒冷和寂寞超常的适应性，更要承受长距离滑行的高强度运动对体能的影响。冬季奥运会越野滑雪共设12个小项，男女各6项。男子项目设:1.5km竞速、15km传统式+15km自由式追逐、15km传统式、5km自由式、团队竞速、4X IOkm接力。女子项目设:1.5km竞速、7.5km传统式+7.5km自由式追逐、IOkm传统式、30km自由式、团队竞速、4X5km接力。如此长距离长时间的体育运动必然对体能有很高的要求，而且，现代的越野滑雪场地路线对运动员的体能提出了更高的要求。一个运动员要达到较高的运动水平，不是几年的训练就可以实现的，必须有一个长期的系统的科学的过程。在这个过程中，运动员的科学选材是所有工作的前提和训练的基础，是运动员创造世界高水平运动成绩的重要因素。实践证明，只有那些具有天赋的运动员，才能攀上世界顶尖运动水平的高峰。如何根据越野滑雪运动项目的特点和要求，采用现代的科学方法和手段，从众多儿童少年中将天赋条件优越且适合从事越野滑雪运动的优秀人才选拔出来，一直是广大体育科学工作者亟待解决的一个重要课题。近年来分子遗传学的研究揭示运动`员的体能与遗传因素相关。如肌肉力量、耐力、肌肉动作能力、平衡力、神经肌肉动作技巧和协调性、柔韧性、有氧运动能力、无氧运动能力、训练应答，以及疲劳恢复等都有重要的生物学背景。人的体能是基于多种基因的表达调控和环境影响的复杂性状，从单基因入手进行运动员选材考虑的候选基因较多，较为复杂困难，也存在不够全面的缺点。因而需要一种行之有效的方法全面综合的筛选出优秀越野滑雪运动员的体能相关基因，从而科学准确的对越野滑雪运动员进行早期基因选材。体能的复杂网络化特点决定了体能的形成必然与多个基因网络相关，因而运用基因组学进行家系的生物信息学研究可阐释体能的遗传特征。从遗传角度考虑，优秀越野滑雪运动员的体能相关基因分布在优秀越野滑雪运动员的直系亲属家系中，运用基因芯片法可以快捷而全面的筛选获得这些基因。基因芯片是生物芯片中应用最广泛、技术最成熟的分支，可以大规模、高通量地对成千上万个基因进行同时研究。利用基因芯片技术可以筛选并确立优秀越野滑雪运动员身体素质体能相关基因的特定遗传与变异规律。利用基因芯片高通量筛选基因的特点，结合优秀越野滑雪运动员的体能及训练相关数据资料，通过相关分析，获得其体能相关基因网络，筛选得到目的基因。从体育运动的角度出发，筛选并挖掘与越野滑雪运动员体能相关基因，探讨不同运动能力者相关基因的分布特征、基因表达状况以及对运动训练的适应性等问题。这是保证科学训练达到高效益、高质量、培养高水平运动员的途径，同时有助于高水平越野滑雪运动员的科学选材。根据文献检索，目前尚未发现有关运用基因芯片对优秀越野滑雪运动员体能相关基因的筛选方法。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种优秀越野滑雪运动员体能相关基因的筛选方法。本发明以优秀越野滑雪运动员家系为对象，应用高通量寡核苷酸基因芯片技术比较优秀越野滑雪运动员体能差异基因表达谱，并通过基因本体论(gene ontology, GO)分析和阐释差异基因的分子功能、生物学途径和细胞组件，从而筛选出体能遗传相关的目标通路，获得优秀越野滑雪运动员体能的相关目的基因。
具体实施例方式以下以优秀越野滑雪运动员家系基因芯片分析筛选其体能相关基因为例，说明本发明的具体实施方法。实施例1:优秀越野滑雪运动员家系基因芯片分析筛选体能相关基因1、研究对象选择以优秀越野滑雪运动员家系为研究对象。“优秀越野滑雪运动员家系”定义为一级亲属中至少有I人为优秀越野滑雪运动员，对每位优秀越野滑雪运动员进行调查，确定研究对象，根据每位优秀越野滑雪运动员确定其一级亲属家系成员(包括父母、同胞及子女，年龄、性别不限)。以年龄18 75岁，与试验组优秀越野滑雪运动员无血缘关系的健康成年人为参照，进行优秀越野滑雪运动员体能相关基因的筛选。每位受试者均须签署知情同意书。2、高通量寡核苷酸基因芯片制备与分析I)芯片选择选用美国Mfymetrix公司的HunanGenome U133Plus2.0芯片(该芯片有探针组54614个，分析47000个转录本和变异体，其中可能的已知基因38500个)。实验前用该系列质控芯片Test3进行检测，以确保样品与全基因组芯片杂交时样品RNA的质量和荧光标记量质量达到要求。2)探针制备每例受试者采全血4mL。(I)白细胞提取，并用Trizol试剂将白细胞溶解，保存待测；⑵RNA的抽提、纯化、质检、样本混合，由RNA合成双链cDNA，生物素标记cDNA
的纯化和定量等芯片的制作流程均由公司完成。3)芯片杂交、洗涤及染色。
4)芯片分析采用基因芯片扫描仪3000(Cat#00_00212，美国Affymetrix)进行扫描，用Command Console Software3.1读取原始数据；对质控合格数据采用Gene SpringSoftwarell.0进行归一化处理，所用算法为现代有限元程序系统(MAS5.0)。(I)差异基因的筛选差异倍数(fold change, FC)为待比较的2个指标标准化后信号的比值，设定差异基因筛选的阈值FC彡2及FC彡3。(2)差异基因的分析①差异基因功能通过基因本体论网站(http://www.geneontology.0rg/)进行GO分析，寻找每个差异基因的生物学功能、代谢途径和细胞定位(P < 0.05)，结合优秀越野滑雪运动员的体能及训练的个人数据(P < 0.05)，筛选与体能相关的差异基因。②信号差异基因通路分析确定优秀越野滑雪运动员体能的相关差异基因后，通过信号转导通路的相关网站及数据库(http://www.bioearta.com/ 和 http://www.genome, ip/kegg/)找到每个差异基因所在信号途径，应用超几何分布统计学方法分析通路结果，取显著性P < 0.05，筛选有意义的目标通路。3、荧光 定量RT-PCR验证在差异基因中选择表达FC较大和较小的若干基因进行荧光定量RT-PCR验证。分别取优秀越野滑雪运动员家系成员及对照组样本抽提总RNA，经甲醛变性胶检测后，进一步进行基因组DNA消化，以特异引物进行反转录，确定阴性对照和阳性对照，采用荧光定量PCR仪对测试基因进行PCR扩增，验证所选基因与优秀越野滑雪运动员体能的相关性。4、统计学分析采用FoxPro软件建立数据库，录入数据并至少核对2次无误，统计处理之前进行逻辑核对，缺项核查，以确保原始资料录入的准确性。使用在线SAS统计分析系统进行数据的差异筛选、统计分析。
权利要求
1.一种优秀越野滑雪运动员家系的体能相关基因筛选方法。“优秀越野滑雪运动员家系”定义为一级亲属中至少有I人为优秀越野滑雪运动员，对每位优秀越野滑雪运动员进行调查，确定研究对象，根据每位优秀越野滑雪运动员确定其一级亲属家系成员(包括父母、同胞及子女，年龄、性别不限)。
2.如权利要求1所述，基因筛选方法是以优秀越野滑雪运动员家系为研究对象，通过高通量寡核苷酸探针基因芯片的制备与分析筛选获得体能相关基因，主要步骤是: (1)选取优秀越野滑雪运动员家系； (2)制备高通量寡核苷酸探针基因芯片； (3)筛选差异基因进行基因本体论分析和信号通路分析:设定差异基因筛选的阈值FC≥2及FC≥3，GO分析每个差异基因的生物学功能、代谢途径和细胞定位(P < 0.05)，结合优秀越野滑雪运动员的体能及训练的个人数据(P < 0.05)，筛选与体能相关的差异基因； (4)荧光定量RT-PCR验证靶基因。
全文摘要
本发明提供一种优秀越野滑雪运动员体能相关基因的筛选方法。本发明以优秀越野滑雪运动员家系为对象，应用高通量寡核苷酸基因芯片技术比较优秀越野滑雪运动员体能差异基因表达谱，并通过基因本体论分析和阐释差异基因的分子功能、信号途径和细胞定位信息，从而筛选出体能遗传相关的目标通路，通过BioCarta及KEGG网站寻找差异基因所在通路，应用超几何分布统计学方法分析筛选出有意义的目标通路，并用实时荧光定量RT-PCR对差异基因进行验证。获得优秀越野滑雪运动员体能的相关目的基因。
文档编号C12Q1/68GK103160585SQ20131010886
公开日2013年6月19日 申请日期2013年4月1日 优先权日2013年4月1日
发明者王旋, 张强, 高俊江, 金红, 王文杰, 关伟军 申请人:哈尔滨体育学院