一种辐射诱导后细胞染色体形态的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种辐射诱导后细胞染色体形态的检测方法，其特征包括如下步骤：(1)制备荧光基团直接标记泛着丝粒的荧光DNA探针；(2)将步骤(1)所获得的荧光DNA探针与辐射诱导后细胞染色体标本荧光原位杂交；(3)荧光显微镜下检测着丝粒及染色体形态。本发明应用直接标记泛着丝粒的荧光DNA探针通过荧光原位杂交技术(FISH)对辐射诱导后细胞染色体形态进行快速分析，与常用的间接标记探针相比，简化了FISH操作步骤，而且在37℃杂交5-12小时经过简单的洗涤即可在荧光显微镜下检测到非常好的信号。
【专利说明】一种辐射诱导后细胞染色体形态的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及制备直接标记泛着丝粒探针的方法以 及在生物医学、辐射生物学领域中的应用。
【背景技术】
[0002] 染色体标本突光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH)技术 在辐射生物学领域中应用较为广泛，该技术具有直观清晰图像、快速高效分析的优点、分裂 细胞质量要求不那么严，对镜检分析者要求不高，尤其是判定易位畸变比常规G显带方法 要快速、准确，从而解决了剂量估算需要计数大量细胞的难题。目前，FISH技术主要用于回 顾性剂量重建，对早先受电离辐射照射人员和慢性受照人员进行剂量估算（International Atomic Energy Agency. Cytogenetic analysis for radiation dose assessment. A manual technical report series No. 405. Vienna :IAEA,2001 :109-115) 〇
[0003] a -卫星DNA(alpha satellite DNA)是唯--个存在于所有人类染色体着丝 粒区域的着丝粒DNA(centromere DNA, CEN-DNA)家族，由171bp的单体为单位组成的 高度串联重复片段，重复数百次至数千次，跨越长达l〇〇kb的着丝粒DNA区域，其中大 部分序列高度保守，但是在每条染色体上，其保守序列仍具有一定的差异性（Willard HF, Chromosome-specific organization of human alpha satellite DNA. Am J Hum Genet. 1985,37(3) :524-532)。FISH技术中泛着丝粒探针可以与靶DNA紧密结合，杂交信 号也较强，易于检测，主要用于检测染色体的数目，分析双着丝粒体和着丝粒环以及应用泛 着丝粒探针结合全染色体特异性探针准确区分双着丝粒体和易位。
[0004] 理想的探针标记物，应具备以下几点：①高度灵敏性；②标记物与核酸探针分子 的结合，不能影响其碱基配对特异性；③不影响探针分子的主要理化特性；④当采用酶促 法进行标记时，应对酶活性无明显影响；⑤高度特异性（卢圣栋主编.现代分子生物学实验 技术[M].北京：高等教育出版社，1993. 159)。
[0005] 现有FISH技术中应用泛着丝粒探针分析辐射诱导后细胞染色体形态时，常用半 抗原分子（生物素或地高辛）间接标记探针，探针与染色体原位杂交后需用偶联不同荧光 物质的高度特异性和高亲和力抗体进行信号放大反应以及多次洗片，因此具有耗时长、操 作步骤繁琐、效率低等问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于建立一种辐射诱导后细胞染色体形态的检测方法，以解决现有 技术中应用间接标记泛着丝粒探针分析染色体形态耗时长、操作步骤繁琐等问题。
[0007] 本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现：
[0008] -种辐射诱导后细胞染色体形态的检测方法，包括如下步骤：
[0009] (1)、制备荧光基团直接标记泛着丝粒的荧光DNA探针；
[0010] (2)、将步骤（1)所获得的荧光DNA探针与辐射诱导后细胞染色体标本荧光原位杂 交；
[0011] (3)、荧光显微镜下检测着丝粒及染色体形态。
[0012] 其中，步骤（1)中所述的突光基团选自Cy3、Cy5或Fluorescein中的任意一种。
[0013] 其中，步骤（1)所述的荧光DNA探针的DNA序列来自人类染色体着丝粒区域的 α -卫星DNA。
[0014] 优选的，步骤（1)包括如下两个步骤：
[0015] 1)以健康人基因组DNA为模板，PCR扩增人α -卫星DNA片段；
[0016] 2)以步骤1)获得的α-卫星DNA片段PCR产物为模板，PCR扩增溶液中加入带荧 光基团的dUTP，获得荧光基团直接标记泛着丝粒的荧光DNA探针。
[0017] 其中，所述步骤（2)具体包括细胞染色体制片、老化、变性、杂交、洗片、复染及镜 检的步骤。
[0018] 优选的，步骤（2)中所述杂交具体为：将步骤（1)制备的荧光DNA探针联合全染色 体探针与辐射诱导后细胞染色体标本杂交。其中，全染色体探针选自人全染色体探针中的 任何一种。
[0019] 本发明建立的辐射诱导后细胞染色体形态的检测方法，其优点在于通过常规PCR 方法快速制备直接标记泛着丝粒的荧光DNA探针，荧光DNA探针与辐射诱导后细胞染色体 标本荧光原位杂交后，经过简单的洗涤即可在荧光显微镜下检测着丝粒及染色体的形态。 本发明使用的直接标记泛着丝粒的荧光DNA探针与间接标记探针相比，无需杂交后多次洗 片以及抗体信号放大等步骤，只需杂交后经过简单的洗涤即可在荧光显微镜下检测到非常 好的信号。该方法简便、快速、重复性好，效率高、特异性好。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为人α -卫星DNA片段的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。Μ是DNA marker，1、 2、3为PCR产物平行样本。
[0021] 图2为荧光基团标记人α -卫星DNA片段的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。Μ是DNA marker，Label是带有荧光基团标记的人α -卫星DNA片段PCR产物。
[0022] 图3为用Cy3标记的泛着丝粒DNA探针检测正常淋巴细胞分裂中期染色体。
[0023] 图4为用Fluorescein标记的泛着丝粒DNA探针检测正常淋巴细胞分裂中期染色 体。
[0024] 图5为Cy3标记的泛着丝粒DNA探针检测4Gy6°Co γ射线照射后细胞分裂中期染 色体的双着丝粒体。
[0025] 图6为Cy3标记的泛着丝粒DNA探针检测12Gy6°C〇 γ射线照射后早熟染色体凝集 中的双着丝粒体和着丝粒环。箭头1所示为双着丝粒体，箭头2和3所示为着丝粒环。
[0026] 图7为Fluorescein标记的泛着丝粒DNA探针联合人2号全染色体探针鉴别染色 体易位。箭头1和2表示人2号全染色体，其中一条2号染色体的长臂（箭头2)与10号 染色体长臂（箭头3)发生易位；箭头4表示带有荧光标记的着丝粒。
【具体实施方式】
[0027] 以下通过实施例详细描述本发明提供的辐射诱导后细胞染色体形态的检测方法。 下面实施例仅用于解释和说明本
【发明内容】
，而不应作为对本发明保护范围的限定，实施例 中所涉及的生物材料均可在市场中购得，所涉及的生物技术没有特别描述之处均采用细胞 遗传学常规技术，如《分子克隆实验指南》中提供的常规技术方法。
[0028] 实施例1 :直接标记泛着丝粒的荧光DNA探针的制备 [0029] 1、引物设计与合成
[0030] 根据人染色体着丝粒区α-卫星DNA保守序列进行简并引物设计。上游引物 (Primer-F)SEQ ID Ν0:1 为：5' -GAAGCTTAWSTMACAGAGTTKAA-3' ；下游引物（Primer-R)SEQ ID NO :2为：5' -GCTGCAGATCMCMAAGHAGTTTC-3' ；由上海生工生物工程股份有限公司合成。
[0031] 2、D0P-PCR扩增人α -卫星DNA片段
[0032] 1)、PCR反应体系如表1所示。
[0033] 表1PCR反应体系
[0034]
【权利要求】
1. 一种辐射诱导后细胞染色体形态的检测方法，其特征包括如下步骤： (1) 、制备荧光基团直接标记泛着丝粒的荧光DNA探针； (2) 、将步骤（1)所获得的荧光DNA探针与辐射诱导后细胞染色体标本荧光原位杂交； (3) 、荧光显微镜下检测着丝粒及染色体形态。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1)中所述的荧光基团选自 Cy3、Cy5 或 Fluorescein 中的任意一种。
3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（1)所述的荧光DNA探针的DNA 序列来自人类染色体着丝粒区域的α-卫星DNA。
4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（1)包括如下两个步骤： 1) 以健康人基因组DNA为模板，PCR扩增人α -卫星DNA片段； 2) 以步骤1)获得的α-卫星DNA片段PCR产物为模板，PCR扩增溶液中加入带荧光基 团的dUTP，获得荧光基团直接标记泛着丝粒的荧光DNA探针。
5. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤（2)具体包括细胞染色体制 片、老化、变性、杂交、洗片、复染及镜检的步骤。
6. 根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤（2)中所述杂交具体为：将步骤 (1)制备的荧光DNA探针联合全染色体探针与辐射诱导后细胞染色体标本杂交。
7. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述全染色体探针选自人全染色体 探针中的任何一种。
【文档编号】C12Q1/68GK104120171SQ201310145544
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月25日 优先权日:2013年4月25日
【发明者】刘青杰, 李爽, 陆雪 申请人:中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所