21染色体中基因检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种21染色体中基因检测方法，包括步骤：提取检测对象的基因组DNA；采用两套PCR引物对和Taqman?MGB荧光探针组合分别对基因组DNA进行荧光定量PCR，其中PCR引物对分别是SEQ?ID?NO:4与SEQ?ID?NO:5以及SEQ?ID?NO:7与SEQ?ID?NO:8所示的核苷酸序列，Taqman?MGB荧光探针具有的核苷酸序列分别是SEQ?ID?NO:6和SEQ?ID?NO:9所示的核苷酸序列；根据荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线，分析基因组DNA中的21号染色体是否存在三体可能性。还涉及相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用，本发明设计巧妙，采用闭管检测，可有效避免样本污染，且检测快速、准确、简便，从而可作为医师诊断和用药的参考依据，适于大规模推广应用。
【专利说明】21染色体中基因检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及疾病相关检测【技术领域】，更具体地，涉及21染色体中基因检测【技术领域】，特别是指一种21染色体中基因检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相
关应用。
【背景技术】
[0002]21三体综合症(先天愚型,Down’s syndrome,唐氏综合症)是一种常见的常染色体病，其主要原因是因为21号染色体三体化造成的严重遗传物质不平衡而导致智力严重低下(IQ50-70)，特别面容(国际脸)、身体多种畸形率高和肿瘤发病率高等等系列疾病特征。S21三体综合症发病率在1/500左右，随孕妇年龄增大发病率明显增加。21三体综合症几乎没有自理生存能力，寿命与正常人类似，病人生命质量极差，也给家庭和社会造成沉重负担。21三体综合症目前尚无有效的治疗办法，预防患者出生是阻断该病遗传的最有效的手段，因此产前基因检测是避免再次生育患者的最佳选择。
[0003]21三体综合症可以参考染色体检测结果和其他附加医疗检测进行判断，。对于产前诊断，羊水合绒毛组织都是适合的检测样本。但是由于染色体检测需要活细胞培养以及后续染色体显带分析，对样本要求高(2ml全血或10ml羊水)，检测时间长(2周)，难以广泛开展。染色体检测因为技术条件复杂，影响因素多，即便在条件良好的试验室也有较多的失败案例。随后开发的荧光原位杂交可以不使用活细胞，直接在固定细胞操作大大简化了检测流程，但是探针检测范围局限性无法取代染色体检测。而包括AFP检测和孕妇血浆二代测序检测远远无法达到染色体检测的准确度，仅仅作为发现高危人群的一种筛选方法。
[0004]本发明检测21染色体中基因的方法，其采用MGB探针定量闭管检测2个21染色体特异性单拷贝位点，可对少量样本(血滤纸，0.1ml羊水，口腔拭子)进行检测，仅仅在2-3小时内准确得出21号染色体的体性特点。
【发明内容】
[0005]本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种21染色体中基因检测方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用，该检测方法设计巧妙，采用闭管检测，可有效避免样本污染，且检测快速、准确、简便，从而可作为医师诊断、用药的参考依据，适于大规模推广应用。
[0006]为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种21染色体中基因的检测方法，其特点是，包括步骤:
[0007]a.提取检测对象的基因组DNA ;
[0008]b.采用第一 PCR引物对和第一 Taqman MGB荧光探针对所述步骤a得到的基因组DNA进行荧光定量PCR，其中所述第一 PCR引物对是SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列，所述第一 Taqman MGB突光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID N0:6所不的核苷酸序列；采用第二 PCR引物对和第二 Taqman MGB荧光探针对所述步骤a得到的基因组DNA进行荧光定量PCR，其中所述第二PCR引物对是SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，所述第二 Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列；
[0009]c.根据所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线，分析所述基因组DNA中的21染色体的两个位点来判断染色体数量是否正常。
[0010]较佳地，在进行荧光定量PCR时，还采用内参PCR引物对和内参Taqman MGB荧光探针进行扩增，其中所述内参PCR引物对是SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列，所述内参Taqman MGB突光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列。
[0011]在本发明的第二方面，提供了一种21染色体中基因检测探针组合物，其特点是，包括第一 PCR引物对、第一 Taqman MGB荧光探针、第二 PCR引物对和第二 Taqman MGB荧光探针，其中所述第一 PCR引物对是SEQ ID N0:4和SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列，所述第一 Taqman MGB突光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID N0:6所不的核苷酸序列，所述第二PCR引物对是SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，所述第二 Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列。
[0012]较佳地,所述21染色体中基因检测探针组合物还包括内参PCR引物对和内参Taqman MGB荧光探针，所述内参PCR引物对是SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列，所述内参Taqman MGB突光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列。
[0013]在本发明的第三方面，提供了上述的21染色体中基因检测探针组合物在检测21染色体中基因中的应用。
[0014]在本发明的第四方面，提供了一种21染色体中基因检测试剂盒，其特点是，包括第一引物容器、第一荧光探针容器、第二引物容器和第二荧光探针容器，所述第一引物容器内具有第一 PCR弓丨物对干燥粉末或溶液，所述第一荧光探针容器内具有第一 Taqman MGB荧光探针干燥粉末或溶液，所述第二引物容器内具有第二 PCR引物对干燥粉末或溶液，所述第二荧光探针容器内具有第二 Taqman MGB荧光探针干燥粉末或溶液，其中所述第一 PCR引物对是SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列，所述第一 Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列，所述第二PCR引物对是SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述第二 Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQID N0:9所示的核苷酸序列。
[0015]较佳地，所述21染色体中基因检测试剂盒还包括内参引物容器和内参荧光探针容器，所述内参引物容器内具有内参PCR引物对干燥粉末或溶液，所述内参荧光探针容器内具有内参Taqman MGB荧光探针干燥粉末或溶液，其中所述内参PCR引物对是SEQ IDNO: 10和SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列，所述内参Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列。
[0016]在本发明的第五方面，提供了上述的21染色体中基因检测试剂盒在检测21染色体中基因中的应用。
[0017]本发明的创新点在于通过荧光定量PCR技术检测检测对象(主要是正常人或患者)的基因组DNA中的21染色体的2个位点来判断21染色体数量，设计巧妙，采用闭管检测，可有效避免样本污染，且检测快速、准确、简便，从而可作为医师诊断、治疗和用药的参考依据，适于大规模推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是人21号ADAMTS5正常检测结果，I为β-actin基因扩增曲线，2为21号染色体ADAMTS5特异性片段扩增曲线横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的
突光信号。
[0019]图2是人21号染色体ADAMTS521染色体异常型检测结果，3为β-actin基因扩增曲线，4为21号染色体ADAMTS5基因扩增曲线，横坐标是以0_42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的突光信号。
[0020]图3是人21号染色体DSCRA正常检测结果，5为β-actin基因扩增曲线，6为21号染色体DSCRA特异性片段扩增曲线，横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的突光信号。
[0021]图4是人21号染色体DSCRA21染色体异常型检测结果。7为β -actin基因扩增曲线，8为21号染色体DSCRA基因扩增曲线。横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号，横坐标是以0-42的偶数标示的循环数，纵坐标是相应的荧光信号。
【具体实施方式】
[0022]为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，下列具体实施例仅仅用于说明本 发明，而不是对本发明的限制。
[0023]实施例1:DNA制备
[0024]I)测试用正常人基因组DNA制备
[0025]采取正常人血滤纸，ChlexlOO抽提制备，正常人基因组DNA浓度调节到IOng/μ I。
2)正常基因型标准品制备
[0026]依据人21 号染色体 ADAMTS5 (a disintegrin and metallopeptidase withthrombospondin typelmotif5, —种含有I型血栓反应素结构花式5的去整合素及金属蛋白酶)基因、DSCRA (Down syndrome critical region gene3,唐氏综合症关键区域基因3)基因和内参基因 β-actin 序列，人工合成 ADAMTS5 (SEQ ID NO:1),DSCRA (SEQ ID NO:2)和i3-actin(SEQ ID N0:3)。分别含上述片段的T载体按1:1:1混合，浓度调节为lng/ul作为10倍正常基因型模板。
[0027]3) 21染色体异常型基因型标准品制备
[0028]人工合成ADAMTS5 (SEQ ID NO:1), DSCRA (SEQ ID N0:2)和 β-actin (SEQ IDNO: 3)。含上述片段的T载体按摩尔数3:3:2混合，浓度调节为lng/ul作为21染色体异常型基因型模板。
[0029]实施例2:21号染色体特异性单拷贝基因扩增引物和MGB探针设计合成
[0030]根据人21号染色体ADAMTS5和DSCRA设计合成引物，ADAMTS5基因、DSCRA基因探针标记Fam,内参基因探针标记Vic。验证突光定量PCR引物特异性扩增目标基因片段，Taqman MGB位点特异性探针报告对应荧光信号。人工合成基因片段特异性扩增引物和位点特异性Taqman MGB报告探针。基因片段特异性引物和位点特异性Taqman MGB探针序列见表 I 和表 2 (SEQ ID N0:4 到 SEQ ID NO: 12)。
[0031]表1
[0032]
【权利要求】
1.一种21染色体中基因检测方法，其特征在于，包括步骤: a.提取检测对象的基因组DNA; b.采用第一PCR引物对和第一 Taqman MGB荧光探针对所述步骤a得到的基因组DNA进行荧光定量PCR，其中所述第一 PCR引物对是SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列，所述第一 Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；采用第二 PCR引物对和第二 Taqman MGB荧光探针对所述步骤a得到的基因组DNA进行荧光定量PCR，其中所述第二 PCR引物对是SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列，所述第二 Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列； c.根据所述荧光定量PCR中收集的荧光信号而形成的实时扩增曲线，分析所述基因组21号染色体是否存在三体可能性。
2.根据权利要求1所述的21染色体中基因检测方法，其特征在于，在进行荧光定量PCR时，还采用内参PCR引物对和内参Taqman MGB荧光探针进行扩增，其中所述内参PCR引物对是SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列，所述内参Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列。
3.一种21染色体中基因检测探针组合物，其特征在于，包括第一 PCR引物对、第一Taqman MGB荧光探针、第二 PCR引物对和第二 Taqman MGB荧光探针，其中所述第一 PCR引物对是SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述第一 Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，所述第二PCR引物对是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述第二 Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQID NO:9所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的21染色体中基因检测探针组合物，其特征在于，所述21染色体中基因检测探针组合物 还包括内参PCR弓丨物对和内参Taqman MGB突光探针,所述内参PCR引物对是SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列，所述内参Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的21染色体中基因检测探针组合物在检测21染色体中基因中的应用。
6.—种21染色体中基因检测试剂盒,其特征在于,包括第一引物容器、第一突光探针容器、第二引物容器和第二荧光探针容器，所述第一引物容器内具有第一 PCR引物对干燥粉末或溶液，所述第一荧光探针容器内具有第一 Taqman MGB荧光探针干燥粉末或溶液,所述第二引物容器内具有第二 PCR引物对干燥粉末或溶液，所述第二荧光探针容器内具有第二 Taqman MGB荧光探针干燥粉末或溶液，其中所述第一 PCR引物对是SEQ ID N0:4和SEQID NO:5所示的核苷酸序列，所述第一 Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ IDNO:6所示的核苷酸序列，所述第二 PCR引物对是SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述第二 Taqman MGB荧光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的21染色体中基因检测试剂盒，其特征在于，所述21染色体中基因检测试剂盒还包括内参引物容器和内参荧光探针容器，所述内参引物容器内具有内参PCR引物对干燥粉末或溶液，所述内参突光探针容器内具有内参Taqman MGB突光探针干燥粉末或溶液，其中所述内参PCR引物对是SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列，所述内参Taqman MGB突光探针具有的核苷酸序列是SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的21染色体中基因检测试剂盒在检测21染色体中基因中的 应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103820565SQ201410093318
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】陈金中, 赵翊均 申请人:上海融圆生物技术有限公司