一种以红松籽粕为原料制备免疫活性肽的方法
【专利摘要】本发明的一种以红松籽粕为原料制备免疫活性肽的方法，属于农产品精深加工及其副产物综合利用的【技术领域】。经过原料预处理、复合酶可控酶解、膜分离、减压浓缩、真空冷冻干燥过程，获得分子量为3000～10000Da、蛋白质含量为92%～96%、水分2%～4%、灰分为0.5%～1.5%，淋巴细胞转化值为0.40～0.60、NK细胞活性为45%～65%的红松籽粕免疫活性肽，并使用淋巴细胞转化及NK细胞活性测定进行免疫活性评价。本发明所选用的红松籽粕源于长白山红松籽冷压榨法榨油后产生的副产物，未接触任何有机提取溶剂，方便有效地分离出一种红松籽粕免疫活性肽，保存了长白山红松籽原有的品质及功能。
【专利说明】一种以红松籽粕为原料制备免疫活性肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农产品精深加工及其副产物综合利用的【技术领域】，涉及一种以红松籽柏为原料制备免疫活性肽的方法，获得分子量为3000~lOOOODa、蛋白质含量为92.0%~ 96.0%、含水量2.0%~4.0%、灰分为0.5%~1.5%,淋巴细胞转化值为0.40~0.60,NK细胞活性为45%~65%的红松籽柏免疫活性肽。
【背景技术】
[0002]我国红松籽生产历史悠久，是出口红松籽的主要国家，长白山是红松籽的主产区， 具有得天独厚的红松籽资源优势，红松籽种仁大，产量高，因其生长于无污染的自然环境中，大都属于有机或绿色食品，品质也久富盛名。但是，我国的红松籽生产，目前仍处于采集野生资源的阶段，产品初加工多，产品开发程度低。所以，如何发挥长白山天然资源优势，提高红松籽精深加工产品的科技含量，用以创造最大经济效益具有十分重要的意义。
[0003]红松籽蛋白是一种良好的食源性功能肽来源。经研究发现，红松籽蛋白中含有19 种氨基酸，分别是异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、门冬酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、精氨酸、缬氨酸、组氨酸、门冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸和丝氨酸，其中，含有8种人体必需氨基酸。将这19种氨基酸的含量与WHO(国际卫生组织)和FAO(联合国粮农组织)氨基酸人体必需量的标准值对比，得出红松籽蛋白的氨基酸含量与国际规定标准十分接近，其中异亮氨酸、苯丙氨酸的含量均高于国际标准。此外，谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸含量也较高，它们对人体的生理作用有着重要功能。
[0004]目前，国内外的研究热点主要集中于红松籽油脂的功能活性，开发红松籽饮料产品，而对于红松籽柏活性肽的研究与开发鲜有报道。且在红松籽油脂提取过程中，副产物多数被当作废弃物处理，因此，研究红松籽柏活性肽，对于提高红松籽产品附加值，开发红松籽柏活性肽系列功能性食品，创造经济收益意义重大。
[0005]免疫活性肽 是指一类存在于生物体内具有免疫功能的活性肽，这种肽在体内一般含量较低，结构多样，是一种细胞信号传递物质。免疫活性肽的研究始于1981年，Jolles等首次用用胰蛋白酶水解人乳蛋白，能增强小鼠腹腔巨嗜细胞对绵羊红细胞的吞噬作用。目前，已有的报道中表明，不同生物学功能的免疫活性肽，如抗血栓转化酶抑制肽、酪蛋白磷酸肽、抗菌肽等，能够刺激机体淋巴细胞的增殖，增强巨嗜细胞的吞噬功能，但既有研究中， 未见过采用天然优质红松籽柏进行免疫活性肽相关研究。因此，以红松籽柏为基础，分离制备免疫活性肽，进而评价其体内相关免疫活性，对食物蛋白来源免疫活性肽的相关研究意义重大，同时为提高红松籽产品附加值，开发辅助提高免疫力产品，奠定了研究基础，并产生了深远影响。
[0006]本申请发明专利的技术优势分析
[0007]第一，本专利所采用的原料来源广泛、天然、无污染，易获取，成本低。红松籽柏源于长白山红松籽冷压榨法榨油后产生的副产物，其特征在于未接触任何有机提取溶剂，保存了长白山红松籽蛋白的原有的品质及功能。[0008]第二，本发明采用复合酶可控酶解技术，膜分离技术方便有效地分离出一种红松籽柏免疫活性肽，并使用淋巴细胞转化及NK细胞活性测定进行免疫活性评价；
[0009]( I)本发明使用复合酶对红松籽柏进行酶解，获得了红松籽柏酶解液，实现了对红松籽优质蛋白资源的有效增值利用；
[0010](2)采用膜分离技术方便有效地分离出一种3000~lOOOODa、蛋白质含量为 92.0%~96.0%、含水量2.0%~4.0%、灰分为0.5%~1.5%，淋巴细胞转化值为0.40~0.60、 NK细胞活性为45%~65%的红松籽柏免疫活性肽；
[0011](3)本专利采用淋巴细胞转化法作为一种红松籽柏免疫活性肽的衡量指标，经测定，淋巴细胞转化值为0.40~0.60 ;
[0012](4)本专利采用NK细胞活性测定法作为一种红松籽柏免疫活性肽的衡量指标，以 YAC-1为细胞模型，以受试小鼠脾细胞为效应细胞，经测定，NK细胞活性为45%~65%。
【发明内容】
[0013]本发明需要解决的技术问题:公开一种以红松籽柏为原料制备免疫活性肽的方法，是以红松籽柏为原料，经过原料预处理、复合酶可控酶解、膜分离、减压浓缩、真空冷冻干燥过程，获得分子量为3000~1000ODa的红松籽柏免疫活性肽。
[0014]本发明的技术方案:
[0015]1.一种以红松籽柏为原料制备免疫活性肽的方法，其特征在于，是以蛋白质含量为30%~40%，脂肪含量为15%~25%，淀粉含量为25%~35%，水分含量为2%~4%，灰分含量为5%~7%的红松籽柏为原料，经过原料预处理、复合酶可控酶解、膜分离、减压浓缩、 真空冷冻干燥过程，获得分子量为3000~lOOOODa、蛋白质含量为92.0%~96.0%、水分含量2.0%~4.0%、灰分含量为0.5%~1.5%，淋巴细胞转化值为0.40~0.60,NK细胞活性为 45%~65%的红松籽柏免疫活性肽；
[0016]1)所述的原料预处理过程，是指以蛋白质含量为30%~40%，脂肪含量为15%~ 25%，淀粉含量为25%~35%，水分含量为2%~4%，灰分含量为5%~7%的红松籽柏为原料， 在室温条件下，按照红松籽柏与水的比例为3: 100g/mL~10: 100g/mL范围内进行混合， 浸泡12~20h后；再利用超声波仪处理物料混合液，超声功率为100~300W，超声时间为 5~35min，再将超声后的样液置于储存罐中，4°C存放20~60min，剥离凝固的红松籽油脂层，获得超声处理液，备用；
[0017]2)所述的复合酶可控酶解过程，是指将超声处理液置于反应罐中，启动搅拌器将转速设置为20~30r/min，同时加热升温使其内料液温度为85~95°C，保温时间为 10~15min，将反应罐中料液温度降低至35~45°C后，保持恒温和搅拌状态，利用8.0~
10.0mol/L的氢氧化钠溶液调整反应罐中料液pH为5.5~8.5 ;将木瓜蛋白酶与中性蛋白酶按照比例为1: 2~1: 10投入反应罐中，控制其底物浓度为6%~12%，使用8~IOmol/ L的氢氧化钠溶液使反应罐中料液的pH为5.5~8.5 ;控制酶解温度为35~45°C，酶解时间为1.5~3.5h，酶解结束后，将反应罐中红松籽柏酶解液迅速升温至90~95°C时，保温 10~30min后，冷却至5~20°C，将冷却后的酶解液进行离心处理，离心温度为0~4°C，转速为8000~10000r/min，离心时间为10~20min，收集上清液，获得红松籽柏酶解物离心液；[0018]3)所述的膜分离过程，是指将红松籽柏酶解物离心液进行膜分离处理，膜分截流量为3000~lOOOODa，调控进口压力为10~30psi，回流压力为5~20psi，流速为1.0~
2.0mL/min，收集膜下液，获得分子量为3000~1000ODa的红松籽柏免疫活性肽液；
[0019]4)所述的减压浓缩过程，是指将3000~1000ODa的红松籽柏免疫活性肽液，置于真空旋转蒸发仪中，控制转速为1000~1500rpm,温度45~65°C,浓缩至初始体积的1/3~ 1/8，收集获得分子量为3000~1000ODa的红松籽柏免疫活性肽浓缩液，冷却至5~15°C备用；
[0020]5)所述的真空冷冻干燥过程，是指将5~15°C的3000~1000ODa的红松籽柏免疫活性肽浓缩液，分装于400X 200mm的冷冻盘中，厚度为3~5mm ;然后置于预冻温度为-40~_30°C冷冻库中，预冻时间为0.5~1.5h后，再移至真空冷冻干燥机中，制冷温度设定为-60~-50°C，真空度压力设定为20~60Pa，冻干时间为8~15h，获得一种分子量为 3000~lOOOODa、蛋白质含量为92.0%~96.0%、含水量2.0%~4.0%、灰分为0.5%~1.5%, 淋巴细胞转化值为0.40~0.60、NK细胞活性为45%~65%的红松籽柏免疫活性肽。
[0021]2.根据权利要求1所述的一种以红松籽柏为原料制备免疫活性肽的方法，其特征在于，是以长白山红松籽为原料，通过冷压榨技术处理后，获得的红松籽柏固体，原料的蛋白质含量为30%~40%，脂肪含量为15%~25%，淀粉含量为25%~35%，水分含量为2%~ 4%,灰分含量为5%~Tl。
[0022]3.根据权利要求1中所述的一种以红松籽柏为原料制备免疫活性肽的方法，其特征在于，原料预处理过程，水是PH为7.0的去离子水。
[0023]4.根据权利要求1中所述的一种以红松籽柏为原料制备免疫活性肽的方法的超声波提取水溶性蛋白过程，其特征在于，所述的利用超声波仪处理物料混合液，是利用高能超声波破碎细胞，控制功率为100~300W，温度为35~45°C，处理时间25~35min。
[0024]5.根据权利要求1所述的一种以红松籽柏为原料制备免疫活性肽的方法的复合酶可控酶解过程，其特征在于，所述的木瓜蛋白酶与中性蛋白酶，酶活`力均为20万u/g。
[0025]6.根据权利要求1所述的一种以红松籽柏为原料制备免疫活性肽的方法的膜分离过程，其特征在于，利用分子截流量为3000~1000ODa的超滤膜，调控进口压力为10~ 30psi,回流压力为5~20psi，流速为1.0~2.0mL/min。
[0026]7.一种红松籽柏免疫活性肽，其特征在于，分子量为3000~lOOOODa，蛋白质含量为92.0%~96.0%、含水量2.0%~4.0%、灰分为0.5%~1.5%,淋巴细胞转化值为0.40~
0.60、NK细胞活性为45%~65%。
[0027]本发明技术效果:
[0028](I)本发明是以长白山红松籽柏为原料，经超声波提取水溶性蛋白，使用复合酶可控酶解技术进行酶解，采用膜分离技术，对酶解液进行分离，获得分子量为3000~ lOOOODa、蛋白质含量为92.0%~96.0%、水分含量2.0%~4.0%、灰分含量为0.5%~1.5%, 淋巴细胞转化值为0.40~0.60、NK细胞活性为45%~65%的红松籽柏免疫活性肽；
[0029](2)本发明设计的工艺技术路线简单，投入设备较少，产品利用价值高，有助于提高提高红松籽产品附加值，可用于工业推广。
【具体实施方式】[0030]实施例1:
[0031]以蛋白质含量为32%，脂肪含量为15%，淀粉含量为26%，水分含量为2%，灰分含量为7%的红松籽柏为原料，使用温度为18°C的去离子水，按照红松籽柏与水的比例为
5: 100g/mL进行混合，浸泡12h后，置于超声处理仪中，调整红松籽柏浸泡液pH为6.0， 设置超声处理仪工作参数，功率为100W，温度为45°C，处理时间33min，超声处理后，剥离凝固的红松籽油脂层，获得超声处理液，将超声处理液置于反应罐中，开启搅拌器使其转速为20r/min，同时加热升温使罐内料液温度为89°C时，保持温度为IOmin后，启动冷却器， 使反应罐中料液温度降低至35°C后，利用8.0mol/L的氢氧化钠溶液调整反应罐中的料液 pH为6.5 ;称取初始松籽柏质量的6%的复合酶投入反应罐中，木瓜蛋白酶与中性蛋白酶投放比例为1: 8，继续用8.0mol/L的氢氧化钠溶液使反应罐中料液的保持pH6.5 ;酶解温度为35°C，酶解时间为2.5h，酶解结束后，将反应罐中红松籽柏酶解液迅速升温至90°C时， 保持温度20min后，然后冷却至10°C，将冷却后的酶解液进行离心处理，设置离心参数，温度为TC，转速为8500r/min，离心时间为lOmin，收集上上清液，获得红松籽柏酶解物离心液。将PH6.5的红松籽柏酶解液进行膜分离处理，膜分截流量为3000~lOOOODa，进口压力为IOpsi，回流压力为20psi，流速度为1.2mL/min，收集膜下液，即为3000~1000ODa的红松籽柏免疫活性肽液，将其置于真空旋转蒸发器中，控制转速为lOOOrpm，温度65°C，浓缩至初始体积的1/5，冷却至15°C，获得红松籽柏免疫活性肽浓缩液。将1000~3000Da 的红松籽柏免疫活性肽浓缩液，分装于400 X 200mm的冷冻盘中，厚度为3.5mm ;置于温度为_32°C冷冻库中进行预冻，预冻时间为1.5h后，再移至真空冷冻干燥机中，制冷温度设定为-50°C，真空度压力设定为30Pa，冻干时间为9h，获得一种分量为3000~lOOOODa、蛋白质含量为92.5%、含水量2.0%、灰分为1.2%，淋巴细胞转化值为0.60,NK细胞活性为65%的红松籽柏免疫活性肽。
[0032]实施例2:
[0033]以蛋白质含量为35%，脂肪含量为25%，淀粉含量为25%，水分含量为3%，灰分含量为5.5%的红松籽柏为原料，使用温度为19°C的去离水，按照红松籽柏与水的比例为 8: 100g/mL进行混合，浸泡19h后，置于超声处理仪中，调整红松籽柏浸泡液pH为7.5， 设置超声处理仪工作参数，功率为300W，温度为35°C，处理时间25min，超声处理后，剥离凝固的红松籽油脂层，获得超声处理液，将超声处理液置于反应罐中，开启搅拌器使其转速为 30r/min，同时加热升温使罐内料液温度为95°C时，保持温度为Ilmin后，启动冷却器，使反应罐中料液温度降低至45°C后，利用9.0mol/L的氢氧化钠溶液调整反应罐中的料液pH 为7.5 ;称取初始松籽柏质量的12%的复合酶投入反应罐中，木瓜蛋白酶与中性蛋白酶投放比例为1: 2，继续用9.0mol/L的氢氧化钠溶液使反应罐中料液的保持pH7.5 ;酶解温度为36°C，酶解时间为1.5h，酶解结束后，将反应罐中红松籽柏酶解液迅`速升温至93°C时，保持温度IOmin后，然后冷却至15°C，将冷却后的酶解液进行离心处理，设置离心参数，温度为0°C，转速为9000r/min，离心时间为15min，收集上上清液，获得红松籽柏酶解物离心液。 将pH7.5的红松籽柏酶解液进行膜分离处理，膜分截流量为3000~lOOOODa，进口压力为 18psi,回流压力为15psi，流速度为1.5mL/min，收集膜下液，即为3000~1000ODa的红松籽柏免疫活性肽液，将其置于真空旋转蒸发器中，控制转速为1300rpm，温度45 V，浓缩至初始体积的1/4，冷却至8°C，获得红松籽柏免疫活性肽浓缩液。将1000~3000Da的红松籽柏免疫活性肽浓缩液，分装于400 X 200mm的冷冻盘中，厚度为3.0mm ;置于温度为_30°C冷冻库中进行预冻，预冻时间为0.9h后，再移至真空冷冻干燥机中，制冷温度设定为_52°C， 真空度压力设定为60Pa，冻干时间为10h，获得一种分量为3000~lOOOODa、蛋白质含量为 96.0%、含水量4.0%、灰分为0.8%，淋巴细胞转化值为0.50、NK细胞活性为48%的红松籽柏免疫活性肽。
[0034]实施例3:
[0035]以蛋白质含量为40%，脂肪含量为19%，淀粉含量为34%，水分含量为4%，灰分含量为6%的红松籽柏为原料，使用温度为20°C的去离水，按照红松籽柏与水的比例为 7: 100g/mL进行混合，浸泡14h后，置于超声处理仪中，调整红松籽柏浸泡液pH为6.5， 设置超声处理仪工作参数，功率为250W，温度为39°C，处理时间35min，超声处理后，剥离凝固的红松籽油脂层，获得超声处理液，将超声处理液置于反应罐中，开启搅拌器使其转速为 29r/min,同时加热升温使罐内料液温度为85°C时，保持温度为14min后，启动冷却器，使反应罐中料液温度降低至37°C后，利用8.5mol/L的氢氧化钠溶液调整反应罐中的料液pH为
5.5 ;称取初始松籽柏质量的8%的复合酶投入反应罐中，木瓜蛋白酶与中性蛋白酶投放比例为1: 5，继续用8.5mol/L的氢氧化钠溶液使反应罐中料液的保持pH5.5 ;酶解温度为 44°C，酶解时间为3.5h，酶解结束后，将反应罐中红松籽柏酶解液迅速升温至92°C时，保持温度15min后，然后冷却至20°C，将冷却后的酶解液进行离心处理，设置离心参数，温度为 2°C，转速为10000r/min，离心时间为18min，收集上上清液，获得红松籽柏酶解物离心液。 将pH5.5的红松籽柏酶解液进行膜分离处理，膜分截流量为3000~lOOOODa，进口压力为 30psi,回流压力为5psi，流速度为1.9mL/min,收集膜下液，即为3000~1000ODa的红松籽柏免疫活性肽液，将其置于真空旋转蒸发器中，控制转速为1200rpm，温度55°C，浓缩至初始体积的1/3，冷却至11 °C，获得红松籽柏免疫活性肽浓缩液。将1000~3000Da的红松籽柏免疫活性肽浓缩液，分装于400 X 200mm的冷冻盘中，厚度为5.0mm ;置于温度为_40°C冷冻库中进行预冻，预冻时间为1.0h后，再移至真空冷冻干燥机中，制冷温度设定为-55°C， 真空度压力设定为50Pa，冻干时间为15h，获得一种分量为3000~lOOOODa、蛋白质含量为 94.0%、含水量3.5%、灰分为1.5%，淋巴细胞转化值为0.58、NK细胞活性为55%的红松籽柏免疫活性肽。
[0036]实施例4:
[0037]以蛋白质含量为30%，脂肪含量为20%，淀粉含量为35%，水分含量为3.5%，灰分含量为6.8%的红松籽柏为原料，使用温度为25°C的去离水，按照红松籽柏与水的比例为 3: 100g/mL进行混合，浸泡13h后，置于超声处理仪中，调整红松籽柏浸泡液pH为8.0， 设置超声处理仪工作参数，功率为200W，温度为38°C，处理时间30min，超声处理后，剥离凝固的红松籽油脂层，获得超声处理液，将超声处理液置于反应罐中，开启搅拌器使其转速为 20r/min,同时加热升温使罐内料液温度为93°C时，保持温度为15min后，启动冷却器，使反应罐中料液温度降低至39°C后，利用10.0mol/L的氢氧化钠溶液调整反应罐中的料液pH 为8.0 ;称取初始松籽柏质量的9%的复合酶投入反应罐中，木瓜蛋白酶与中性蛋白酶投放比例为1: 10，继续用10.0mol/L的氢氧化钠溶液使反应罐中料液的保持pH8.0 ;酶解温度为45°C，酶解时间为3.0h，酶解结束后，将反应罐中红松籽柏酶解液迅速升温至95°C时， 保持温度30min后，然后冷却至5°C，将冷却后的酶解液进行离心处理，设置离心参数，温度为3°C，转速为8000r/min，离心时间为20min，收集上上清液，获得红松籽柏酶解物离心液。 将pH8.0的红松籽柏酶解液进行膜分离处理，膜分截流量为3000~lOOOODa，进口压力为 20psi,回流压力为IOpsi，流速度为2.0mL/min,收集膜下液，即为3000~1000ODa的红松籽柏免疫活性肽液，将其置于真空旋转蒸发器中，控制转速为1400rpm，温度50°C，浓缩至初始体积的1/8，冷却至5°C，获得红松籽柏免疫活性肽浓缩液。将1000~3000Da的红松籽柏免疫活性肽浓缩液，分装于400 X 200mm的冷冻盘中，厚度为4.0mm ;置于温度为_35°C冷冻库中进行预冻，预冻时间为0.5h后，再移至真空冷冻干燥机中，制冷温度设定为-60°C， 真空度压力设定为40Pa，冻干时间为8h，获得一种分量为3000~lOOOODa、蛋白质含量为 93.5%、含水量3.0%、灰分为1.0%，淋巴细胞转化值为0.40、NK细胞活性为45%的红松籽柏免疫活性肽。
[0038]实施例5:
[0039]以蛋白质含量为38%，脂肪含量为17%，淀粉含量为29%，水分含量为2.5%，灰分含量为5%的红松籽柏为原料，使用温度为23°C的去离水，按照红松籽柏与水的比例为
6: 100g/mL进行混合，浸泡18h后，置于超声处理仪中，调整红松籽柏浸泡液pH为9.0， 设置超声处理仪工作参数，功率为150W，温度为43°C，处理时间28min，超声处理后，剥离凝固的红松籽油脂层，获得超声处理液，将超声处理液置于反应罐中，开启搅拌器使其转速为 25r/min，同时加热升温使罐内料液温度为86 °C时，保持温度为13min后，启动冷却器，使反应罐中料液温度降低至42°C后，利用9.5mol/L的氢氧化钠溶液调整反应罐中的料液pH 为8.5 ;称取初始松籽柏质量的11%的复合酶投入反应罐中，木瓜蛋白酶与中性蛋白酶投放比例为1: 3，继续用9.5mol/L的氢氧化钠溶液使反应罐中料液的保持pH8.5 ;酶解温度为38°C，酶解时间为2.0h，酶解结束后，将反应罐中红松籽柏酶解液迅速升温至91°C时， 保持温度25min后，然后冷却至8°C，将冷却后的酶解液进行离心处理，设置离心参数，温度为4°C，转速为9500r/min，离心时间为13min，收集上上清液，获得红松籽柏酶解 物离心液。 将pH8.5的红松籽柏酶解液进行膜分离处理，膜分截流量为3000~lOOOODa，进口压力为 25psi,回流压力为8psi，流速度为1.0mL/min，收集膜下液，即为3000~1000ODa的红松籽柏免疫活性肽液，将其置于真空旋转蒸发器中，控制转速为1500rpm，温度60°C，浓缩至初始体积的1/7，冷却至10°C，获得红松籽柏免疫活性肽浓缩液。将1000~3000Da的红松籽柏免疫活性肽浓缩液，分装于400 X 200mm的冷冻盘中，厚度为4.5mm ;置于温度为_37°C冷冻库中进行预冻，预冻时间为1.2h后，再移至真空冷冻干燥机中，制冷温度设定为-55°C， 真空度压力设定为20Pa，冻干时间为12h，获得一种分量为3000~lOOOODa、蛋白质含量为 92.0%、含水量2.5%、灰分为0.5%，淋巴细胞转化值为0.49、NK细胞活性为50%的红松籽柏免疫活性肽。
【权利要求】
1.一种以红松籽柏为原料制备免疫活性肽的方法，其特征在于，是以蛋白质含量为 30%~40%，脂肪含量为15%~25%，淀粉含量为25%~35%，水分含量为2%~4%，灰分含量为5%~7%的红松籽柏为原料，经过原料预处理、复合酶可控酶解、膜分离、减压浓缩、真空冷冻干燥过程，获得分子量为3000~lOOOODa、蛋白质含量为92.0%~96.0%、水分含量2.0%~4.0%、灰分含量为0.5%~1.5%，淋巴细胞转化值为0.40~0.60、NK细胞活性为 45%~65%的红松籽柏免疫活性肽； 1)所述的原料预处理过程，是指在室温条件下，按照红松籽柏与水的比例为3: 100g/ mL~10: 100g/mL范围内进行混合，浸泡12~20h后；再利用超声波仪处理物料混合液， 超声功率为100~300W，超声时间为5~35min，再将超声后的样液置于储存罐中，4°C存放 20~60min，剥离凝固的红松籽油脂层，获得超声处理液，备用；2)所述的复合酶可控酶解过程，是指将超声处理液置于反应罐中，启动搅拌器将转速设置为20~30r/min，同时加热升温使其内料液温度为85~95°C，保温时间为10~15min， 将反应罐中料液温度降低至35~45°C后，保持恒温和搅拌状态，利用8.0~10.0moI/L的氢氧化钠溶液调整反应罐中料液PH为5.5~8.5 ;将木瓜蛋白酶与中性蛋白酶按照比例为 1: 2~1: 10投入反应罐中，控制其底物浓度为6%~12%，使用8~lOmol/L的氢氧化钠溶液使反应罐中料液的pH为5.5~8.5 ;控制酶解温度为35~45°C，酶解时间为1.5~3.5h，酶解结束后，将反应罐中红松籽柏酶解液迅速升温至90~95°C时，保温10~30min 后，冷却至5~20°C，将冷却后的酶解液进行离心处理，离心温度为0~4°C，转速为8000~ 10000r/min，离心时间为10~20min，收集上清液，获得红松籽柏酶解物离心液；3)所述的膜分离过程，是指将红松籽柏酶解物离心液进行膜分离处理，膜分截流量为 3000~lOOOODa，调控进口压力为10~30psi，回流压力为5~20psi，流速为1.0~2.0mL/ min，收集膜下液，获得分子量为3000~1000ODa的红松籽柏免疫活性肽液；4)所述的减压浓缩过程，是指将红松籽柏免疫活性肽液，置于真空旋转蒸发仪中，控制转速为1000~1500rpm，温度45~65°C，浓缩至初始体积的1/3~1/8，收集获得分子量为 3000~1000ODa的红松籽柏免疫活性肽浓缩液，冷却至5~15°C备用；5)所述的真空冷冻干燥过程，是指将5~15°C的3000~1000ODa的红松籽柏免疫活性肽浓缩液，分装于400X200mm的冷冻盘中，厚度为3~5mm;然后置于预冻温度为-40~_30°C冷冻库中，预冻时间为0.5~1.5h后，再移至真空冷冻干燥机中，制冷温度设定为-60~_50°C，真空度压力设定为20~60Pa，冻干时间为8~15h，获得红松籽柏免疫活性肽。
2.根据权利要求1所述的以红松籽柏为原料制备免疫活性肽的方法，其特征在于，原料预处理过程，水是pH为7.0的去离子水。
3.根据权利要求1所述的以红松籽柏为原料制备免疫活性肽的方法，其特征在于，所述的利用超声波仪处理物料混合液，是利用高能超声波破碎细胞，控制功率为100~300W， 温度为35~45°C，处理时间25~35min。
4.根据权利要求1所述的以红松籽柏为原料制备免疫活性肽的方法，其特征在于，所述的木瓜蛋白酶与中性蛋白酶，酶活力均为20万u/g。
5.一种权利要求1以红松籽柏为原料制备免疫活性肽的方法制备的红松籽柏免疫活性肽，其特征在于，分子量为3000~lOOOODa，蛋白质含量为92.0%~96.0%、含水量2.0%~`4.0%、灰分为0.5%~1.5%,淋巴细`胞转化值为0.40~0.60、NK细胞活性为45%~65%。
【文档编号】C12P21/06GK103555800SQ201310513028
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月26日 优先权日:2013年10月26日
【发明者】林松毅, 刘轩廷, 刘博龙, 贾亚平, 王爽, 刘颢然, 姜源 申请人:吉林大学