一株反硝化细菌及其培养条件的制作方法
【专利摘要】本发明公开一株反硝化细菌及其培养条件，属于环境微生物领域。经鉴定，该反硝化细菌为黄色海假单胞菌Pseudomonasxanthomarina，命名为DN1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.7650。经初步优化，该菌株的培养基为：丁二酸钠6-8g/L、酵母粉6-10g/L、硝酸钠0.67g/L、磷酸二氢钾1.36g/L、硫酸铵0.24g/L、硫酸镁0.2g/L，摇床培养条件为：pH5.0，30℃，200rpm。上述条件下所得菌体，在NO3-浓度为10mmol/L的水体中，作用72h，脱氮率达到90%以上。
【专利说明】一株反硝化细菌及其培养条件
【技术领域】
[0001]本发明属于环境微生物【技术领域】，具体涉及一株反硝化细菌及其培养方法，以及其反硝化能力。
【背景技术】
[0002]水体富营养化是现今我国水环境面临的重大问题，严重地阻碍着我国国民经济的发展。废水处理过程中的脱氮处理越来越显示其重要地位。在现代水产养殖业中，由于养殖动物排泄和饵料过剩等原因造成水体中氨氮、亚硝酸盐等的含量严重超标，水质恶化，进而导致病害频发，并严重影响了水产养殖业的健康可持续发展。相对于物理化学脱氮方法，生物脱氮已经成为废水中去除氮素污染的最有效的方法之一，而微生物的反硝化作用正是改善水质，特别是降低水体中亚硝酸盐浓度的有效手段之一。
[0003]本发明的目的在于提供一株反硝化细菌及其培养条件，并初步研究其反硝化能力，可应用于水体的净化工艺。
【发明内容】
[0004]反硝化细菌的筛选、鉴定与培养条件优化方法如下:
(I)平板初筛及反硝化能力初步鉴定:从江南大学湖边采集土壤样品，制备土壤悬液，涂布于DM固体平板，于30°C恒温培养至长出明显菌落，用接种环逐个挑取形态各异的菌落至新的DM固体平板，划线分离出单菌落。选取分离后的单菌落，点种于BTB平板上，挑取有蓝色变色圈的阳性菌株即为反硝化细菌。
[0005](2)摇瓶复筛与脱氮能力测定:初筛得到的菌株经摇瓶发酵，测定其脱氮能力。经复筛，3号菌总氮去除率最高，达78%。
[0006](3)菌株16S rDNA鉴定:提取总DNA，用细菌16S rDNA通用引物扩增，得到的基因序列为1500 bp,经测序比对,为黄色海假单胞菌xanthomarina'),命名为DN1，于2013年5月29日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.7650。
[0007](4)菌株发酵条件初步优化:利用单因素实验对菌株的发酵培养基及发酵条件进行优化，得到最适培养基配方为丁二酸钠6-8 g/L、酵母粉6-10 8/1、硝酸钠0.67 g/L、磷酸二氢钾1.36 g/L、硫酸铵0.24 g/L、硫酸镁0.2 g/L，摇床培养条件为:pH 5.0，30。。，200rpm,该条件下发酵 14h, OD600 达 7.29,约 3X IO8 cfu/ml。
[0008](5)反硝化能力测定:在NaN03浓度为10 mmol/L的水体中，添加丁二酸钠4 g/L,按1%的量接入上述菌液，72h后检测水样中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮含量(以不投加菌体的水样作为对照)，计算脱氮率达到90%以上。
[0009]其中步骤(1)中所述的DM培养基为(g/L):丁二酸钠4.72，NaNO3 0.67, KH2PO4
1.50，Na2HPO4 0.42，MgSO4.7H20 1.00，微量元素溶液2 ml，pH调至7.2，固体培养基添加2%琼脂；BTB平板培养基为(g/L):FeCl3*H20 0.5，琥珀酸钠8.5，BTB I ml (1%溶于酒精)，KNO3 1.00，KH2PO4 1.00，CaCl2.2H20 0.2，MgSO4.7H20 1.00，pH 调至 7.0-7.3。
[0010]本Iky^Wi'i^Pseuckmionas xanthomarina DNl 为反硝化细菌,可广泛应用于各种富营养化水体的净化。
【具体实施方式】
[0011]实施例1反硝化细菌的筛选与鉴定
1、培养基配方
LB培养基(g/L):胰蛋白胨I，酵母提取物0.5，氯化钠I，pH 7.0-7.2。需要时使用前加入100 μ g /ml氨节青霉素，固体培养基添加2%琼脂,用于大肠杆菌的培养。
[0012]DM 培养基(g/L): 丁二酸钠 4.72，NaNO3 0.67，KH2PO4 1.50，Na2HPO4 0.42，MgSO4.7H20 1.00，微量元素溶液2 ml, pH调至7.2，固体培养基添加2%琼脂。
[0013]微量元素溶液(g/L):CuS0.5Η20 4.00，FeSO4.7Η20 0.7，FeCl3.6Η20，CoCl2.6Η20，Na2MO4.2Η20 3.40，CaCl2.2Η20 2.00。
[0014]SM培养基(g/L):丁二酸钠 3,NaNO3 0.67，KH2PO4 1.36，酵母粉 I,MgSO4.7Η20 1.00,
pH调至7.2，固体培养基添加2%琼脂。
[0015]BTB 平板(g/L) =FeCl3.H2O 0.5，琥珀酸钠 8.5，BTB I ml (1% 溶于酒精)，KNO31.00，KH2PO4 1.00，CaCl2.2H20 0.2，MgSO4.7H20 1.00，pH 调至 7.0-7.3。
[0016]2、平板初筛及反硝化能力初步鉴定
从江南大学湖边采集土壤样品，称取IOg置于250 ml三角瓶中，加100 ml无菌水及几粒玻璃珠，摇床振荡I 5 min使土样分散均匀。待土样分散后,静置5 min后,吸取I ml 土壤悬液至9 ml稀释液(无菌水)，得到10_2稀释度悬液，依次按10倍稀释法稀释至10_7，由此制得各稀释度土壤悬液。分别吸取各稀释度悬液0.1 ml至DM固体平板(放置过夜，无杂菌生长)，于30°C恒温培养至长出明显菌落，用接种环逐个挑取形态各异的菌落至新的DM固体平板，划线分离出单菌落。
[0017]选取分离后的单菌落，点种于BTB平板上，BTB在酸性条件是黄绿色的，当反硝化细菌消耗了硝酸根，PH上升，BTB会变蓝，初筛得到3株反硝化细菌。
[0018]3、摇瓶复筛与脱氮能力测定
初筛得到的菌株经摇瓶发酵，测定其脱氮能力。通过测定滤液中的no3_-n和no2_-n浓度变化，可以反映各菌株的硝酸盐还原能力和实际脱氮能力。no3_-n的去除率，可以表明菌株的硝酸盐还原能力，而不考虑硝酸盐还原产物类型的差异(不论终产物是亚硝酸盐或气态产物)；NOx^-N (NOx--N =N03--N+N02--N，亦称总氧化氮TON)的去除率，可以近似表明菌株的脱氮能力。NO3--N和NO2--N浓度测定采用国标方法。
[0019]经复筛,3号菌总氮去除率最高,达78%。
[0020]4、16S rDNA 鉴定
提取总DNA，用细菌16S rDNA通用引物扩增，得到的基因序列为1500 bp，经测序比对，与黄色海假单胞菌的16S rDNA序列同源性高达99%，初步判断其为黄色海假单胞菌QPseudomonas xanthomarina ),DNl。
[0021]实施例2菌株发酵条件初步优化及反硝化能力测定
利用单因素实验对菌株的发酵培养基及发酵条件进行优化，得到最适培养基配方为丁二酸钠6-8 g/L、酵母粉6-10 g/L、硝酸钠0.67 g/L、磷酸二氢钾1.36 g/L、硫酸铵0.24g/L、硫酸镁0.2 g/L，摇床培养条件为:pH 5.0，30。。，200 rpm，该条件下发酵14h，OD600达
7.29，约 3X IO8 cfu/ml。
[0022]在NaNO3浓度为10 mmol/L的水体中，添加丁二酸钠4 g/L,按1%的量接入上述菌液，72h后检测水样中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮含量(以不投加菌体的水样作为对照)，计算脱氮率达到90%以上。
【权利要求】
1.一株反硝化细菌DNl,分类命名为黄色海假单胞菌xanthomarinaΛ%保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.7650，保藏日期为2013年5月29日。
2.权利要求1所述菌株的培养方法，其培养基为:丁二酸钠6-8g/L、酵母粉6-10 g/L、硝酸钠0.67 g/L、磷酸二氢钾1.36 g/L、硫酸铵0.24 g/L、硫酸镁0.2 g/L，摇床培养条件为:pH 5.0，30。。，200 rpm。
3.利用权利要求2所述的培养方法得到的菌液在水体脱氮中的应用方法:在NO3-浓度为10 mmol/L的水体中，作`用72h，脱氮率达到90%以上。
【文档编号】C12R1/38GK103555637SQ201310568985
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】张旦旦, 窦文芳, 史劲松, 许正宏 申请人:江南大学