鉴定鲁氏接合酵母菌的实时荧光pcr试剂盒及寡核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定鲁氏结合酵母菌的实时荧光PCR试剂盒及寡核苷酸。具体地，本发明提供了一组鉴定鲁氏结合酵母菌的寡核苷酸，为序列表SEQ?ID?No：1至SEQ?ID?No：3所示的寡核苷酸，其中序列SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2分别为鉴定鲁氏结合酵母菌的上游引物和下游引物，序列SEQ?ID?NO：3为鉴定鲁氏结合酵母菌的荧光探针。本发明还提供了含有上述引物和探针的实时荧光PCR试剂盒及食品中鲁氏结合酵母菌的实时荧光PCR鉴定方法，本发明对于鲁氏结合酵母的鉴定灵敏度为10-4ng/μL以内。
【专利说明】鉴定鲁氏接合酵母菌的实时荧光PCR试剂盒及寡核苷酸
【技术领域】
[0001]本发明属于涉及一种鉴定鲁氏接合酵母菌的实时荧光PCR试剂盒及寡核苷酸，属于检验检疫领域。
【背景技术】
[0002]鲁氏接合酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)是最常见的嗜高渗透压酵母菌。既是主要传统发酵食品的生产菌，又是某些低水分活度食品及原料的腐败菌。鲁氏接合酵母菌是生产酱油、日本味噌和泰国发酵鱼制品等发酵制品的重要菌种。在果汁、果酱、软饮料、沙拉酱和调味番茄酱等中则是腐败菌。
[0003]鲁氏接合酵母菌传统的检测方法是基于形态特征、染色特征、生化特征等表型特征来鉴定。这些常规的方法在副溶血性弧菌研究工作中起到了重要作用，但现代科学技术的发展，传统的依靠表型特征来鉴定鲁氏结合酵母菌的方法，已远远不能满足对该菌的快速鉴定的需要，暴露出许多不足之处:操作繁琐，鉴定周期长，不利于口岸快速通关的要求；而且随着分子生物学的日益发展，人们渐渐发现鲁氏接合酵母菌的生理生化特性会发生变化，而传统的鉴定方法无法很好地表现其遗传特性。因此，迫切急需研究出能够更加快速、准确无误、检测通量更高、人为影响因素尽可能减少，而且能获得目标菌基因类型等多重信息的鉴定方法。
[0004]用于鲁氏接合酵母菌分子鉴定 的方法在国内还很少见报道，实时荧光PCR技术充分结合了 PCR扩增和探针杂交的优势，具有高灵敏度、高特异性，重复性和稳定性良好的优点，一次上机即可完成结果检测，容易自动化。
[0005]实时荧光PCR技术根据荧光能量传递原理，融合了 PCR技术的高效扩增、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性和高精确性等优点。它是利用荧光信号伴随着PCR产物的增加而增强的原理，在PCR扩增过程中，连续不断地检测反应体系中荧光光信号的变化。根据荧光信号基线的平均值和平均标准差，在99.7%的置信度时计算出大于平均值的荧光信号即阈值，然后收集荧光信号增强到预定阈值时的PCR循环次数(即Ct值)。该参数和PCR反应体系中起始DNA模板量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度稀释标准品的Ct值绘制成标准曲线，再根据检测样品的Ct值就可以准确地测定靶标病原菌的起始模板拷贝数。
[0006]利用实时荧光PCR技术对鲁氏接合酵母菌进行检测，在国内外尚无相关报道。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的第一个技术问题是提供一组快速、可靠、灵敏度高、特异性强的鉴定鲁氏接合酵母菌的寡核苷酸，包括引物和探针。
[0008]本发明要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的鉴定鲁氏接合酵母菌的实时荧光PCR试剂盒。
[0009]本发明要解决的第三个技术问题是提供一种食品中鲁氏接合酵母菌的实时荧光PCR鉴定方法。
[0010]为解决第一个技术问题，本发明采用以下技术方案:
[0011]一组鉴定鲁氏接合酵母菌的寡核苷酸，为序列表SEQ ID No:1至SEQ ID No:3所示的寡核苷酸，其中序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别为鉴定鲁氏接合酵母菌的上游引物和下游引物，序列SEQ ID NO:3为鉴定鲁氏接合酵母菌的荧光探针，具体为:
[0012]上游引物:5，-CCAGACGCTGCCTGCTTCTA-3’，(SEQID NO:1)；
[0013]下游引物:5’-CCACGATAGTCGTATTAGG-3’，(SEQ ID NO:2)；
[0014]探针:5’-TGAGGTCAAACTTTGAGAA-3’，(SEQ ID NO:3);该探针的 5’ 端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQ1。
[0015]为解决第二个技术问题，本发明采用以下技术方案:
[0016]本发明提供了一种鉴定鲁氏接合酵母菌的实时荧光PCR试剂盒，包括以下组分:
[0017](I)实时荧光PCR反应液，其包括序列表SEQ ID N0.1所示的上游引物，序列表SEQID N0.2所示的下游引物，序列表SEQ ID N0.3所示的荧光探针，该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQl ；
[0018](2)阴性对照:无菌双蒸水；
[0019](3)阳性对照:鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii) CGMCC2.1915。
[0020]进一步地，为了操作方便，本发明所使用的实时荧光PCR反应液还包括TaqManUniversal PCR Master Mix (2X )，其购自北京东方嘉诚科贸有限公司，产品包括PCR 反应缓冲液、dNTPs、Mg2+、AmpErase UNG 及 GeneCore HS DNA Polymaras 的 2x 混合液。
[0021]为解决第三个技术问题，本发明还提供了一种食品中鲁氏结合酵母菌的实时荧光PCR鉴定方法，包括如下步骤:
[0022](I)从待检食品中分离可疑目标菌落，然后进行微生物的纯培养；
[0023](2)提取待鉴定菌株的基因组DNA作为模板；
[0024](3)进行实时荧光PCR反应，其中，所使用的引物为序列SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示的上游引物和下游引物，所使用的探针为序列SEQ ID NO:3所示的荧光探针，该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQl ；
[0025]表1实时荧光PCR反应体系
【权利要求】
1.一组鉴定鲁氏结合酵母菌的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸如序列表SEQ IDN0.1至序列表SEQ ID N0.3所示；其中序列SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2分别为鉴定鲁氏结合酵母菌的上游引物和下游引物，序列SEQ ID N0.3为鉴定鲁氏结合酵母菌的荧光探针。
2.根据权利要求1所述的鉴定鲁氏结合酵母菌的寡核苷酸，其特征在于，所述荧光探针序列SEQ ID NO:3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQ1。
3.权利要求1或2所述的鉴定鲁氏结合酵母菌的寡核苷酸在制备鉴定鲁氏结合酵母菌试剂盒中的应用。
4.一种鉴定鲁氏结合酵母菌的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下组分: (1)实时荧光PCR反应液，其包括序列表SEQID N0.1所示的上游引物，序列表SEQ IDN0.2所示的下游引物，序列表SEQ ID N0.3所示的荧光探针，该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQl ； (2)阴性对照； (3)阳性对照。
5.一种食品中鲁氏结合酵母菌的实时荧光PCR鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)从待检食品中分离可疑目标菌落，然后进行微生物的纯培养； (2)提取待鉴定菌株的基因组DNA作为模板； (3)进行实时荧光PCR反应，其中，所使用的引物为序列SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示的上游引物和下游引物，所使用的探针为序列SEQ ID NO:3所示的荧光探针，该探针的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团BHQl ； (4)根据样品的Ct值进行结果判定。
【文档编号】C12N15/11GK103642929SQ201310683581
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】饶红, 蔡雪凤, 付溥博, 陈世琼, 逄波, 郭铮蕾 申请人:北京市海淀区产品质量监督检验所