毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH及其编码蛋白的制作方法
【专利摘要】毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH及其编码蛋白，本发明涉及一种与植物抗旱性有关的cDNA序列及其编码的氨基酸序列，还涉及该基因抵抗干旱机制的研究及转基因植物抗旱能力的分析与应用。本发明提供了毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH及其编码蛋白。毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的基因序列如序列表Seq?ID?No：1所示。毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的编码蛋白，编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq?ID?No：2所示。本发明属于分子生物学领域。
【专利说明】毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH及其编码蛋白
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种与植物抗旱性有关的cDNA序列及其编码的氨基酸序列，还涉及该基因抵抗干旱机制的研究及转基因植物抗旱能力的分析与应用，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002]自然界中，植物的生长发育与环境的变化密切相关。环境中存在多种多样的动态因素，如干旱、高低温等，这些因素在特定环境下会对植物造成不利影响，形成非生物胁迫。而干旱是制约植物生长的一个重要胁迫因素。我国干旱、半干旱地区约占国土面积的1/2，主要分布于北方和西北地区，干旱尤其是重大干旱引起的水资源短缺、粮食危机、生态恶化(如荒漠化)，直接威胁到国家的长期粮食安全和社会稳定。因而，研究植物的耐旱特征、寻找植物抵御干旱胁迫的机制，改造植物的耐旱特性，进一步开发和利用耐旱植物资源有着重要的经济价值和实用价值。
[0003]苔藓植物是最古老的由水生向陆生过渡的植物类群，现存的种类数量仅次于被子植物，分布于世界各地，包括南北两极和赤道。中国是苔藓大国，地理自然环境复杂，使得苔藓植物的多样性非常丰富，其中已报道的藓类植物有67科421属近2500种。而藓类植物在长期的进化过程及自然选择下形成了适应环境的多种多样的形态结构。其构造较简单，没有真正的维管系统，在进化上较为低等。但是许多种类能在干旱、高寒、高温和弱光等其他植物难以生存的极端环境中繁衍生长，如一些耐旱种类能生活在裸露的岩石上，长期忍受干燥，具有较强的抗旱能力。
[0004]毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)属紫萼藓科(Grimmiaceae)紫萼藓属(Grimmia)，生于光照强烈的岩石上或林下石面上，在干燥几分钟后叶片就会卷缩，慢慢进入休眠状态，而复水后瞬间可恢复活力，积累了大量的抗逆基因，是典型的小型耐旱藓类。因此，从毛尖紫萼藓中克隆出与抗旱性有关的基因，初步研究其潜在的生物学功能，可为深入研究该基因的抗旱相关机理和苔藓植物的耐旱机制提供理论依据，为创造新的抗旱性材料奠定基础。
[0005]泛素(ubiquitin)是真核生物中广泛存在的一类具有76个氨基酸残基的高度保守的小蛋白，在动植物、藻类和酵母中仅有1-3个氨基酸差异，主要功能是标记生物体内需要分解掉的蛋白质，使其被水解，避免异常蛋白过多积累对生物体造成伤害。植物体内存在一系列的酶介导着泛素与底物的结合，但同时也有许多酶进行着相反作用，它们将泛素从标记的底物上水解下来并回收泛素，行使着泛素化逆向调节的作用，这些酶叫做去泛素化酶。泛素羧基末端水解酶(ubiquitin Carboxy-terminal hydrolase,UCHs)就是其中一种，可通过打 开泛素C末端的甘氨酸与靶蛋白之间的异肽键，将泛素释放出来，从而参与细胞内许多重要的生化过程，如DNA损伤修复、重要蛋白质翻译后修饰和改造、离子通道、细胞器的形成等。UCHs含有组氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸等活性位点，这种特殊的结构对于调节其催化酶活性起着关键作用。UCHs家族由UCH-L1，UCH-L2，UCH-L3，UCH-L4，UCH-L5五个成员组成，主要功能是将泛素羧基末端所连接的小肽或酯类分子水解下来，特异性识别泛素C-末端区域，促进泛素再循环，对泛素系统的正常运行非常重要。
[0006]UCHs的研究大部分集中在人和哺乳动物中，植物中研究的较少，苔藓植物中尚未有该基因研究的相关报道。
【发明内容】
[0007]本发明提供了毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH及其编码蛋白。
[0008]毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的基因序列如序列表Seq ID No:1所
/Jn ο
[0009]毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的编码蛋白，编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No:2所示。
[0010]本发明包含以下有益效果:
[0011]本发明以毛尖紫萼藓为材料，克隆出与抗旱紧密相关的基因泛素羧基末端水解酶基因，研究其基本的生物学特性和功能，不仅为植物基因工程育种提供优良基因资源，而且对于作物抗逆育种显得尤为重要。
[0012]从转基因植株耐旱性鉴定中可以看出，转基因植株的抗旱能力与野生型植株有着较大的区别。通过测定转基因株系和野生型株系在干旱胁迫处理后各项生理指标的动态变化得知，烟草植物体内非常重要的渗透调节物质可溶性蛋白和可溶性糖的含量增加，转基因植株的可溶性蛋白的含量是对照的2.61倍，而转基因植株可溶性糖的含量是对照的
2.37倍。膜系统是受环境胁迫最敏感的部位之一，干旱胁迫使膜透性增加产生大量的MDA，在干旱20天时转基因植株MD A含量为对照的1.3倍。脯氨酸在受到干旱胁迫时植物体内主动积累参与植物的渗透调节，在干旱20天时转基因植株为对照的2.05倍。以上指标都表明转GpUCH基因可能通过调节渗透物质的含量提高转基因烟草的抗旱性，以维持正常的生理生化过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为实施例中毛尖紫萼藓总RNA图；
[0014]图2为实施例中:V -RACE结果图；其中，M为DNA Marker，I为:V -RACE扩增结果;
[0015]图3为实施例中GPUCH PCR扩增结果图；其中，M为DNA Marker, I为PCR扩增结果;
[0016]图4为实施例中重组质粒PGpUCH双酶切结果图；其中，M为DNA Marker，I为GpUCH酶切产物；
[0017]图5为实施例中重组质粒PR1-GpUCH双酶切结果图；其中，M为DNA Marker, I为PR1-GpOsmC酶切产物；
[0018]图6为实施例中烟草再生体系建立过程中共培养图；
[0019]图7为实施例中烟草再生体系建立过程中生芽培养图；
[0020]图8为实施例中烟草再生体系建立过程中伸长培养图；
[0021]图9为实施例中烟草再生体系建立过程中生根培养图；
[0022]图10为实施例中烟草再生体系建立过程中室外培养图；[0023]图11为实施例中转基因烟草T1 RPCR结果图；其中，M:DNA Marker ; 1-15:转化植株；16:纯水对照；CK-:非转化植株；
[0024]图12为实施例中转基因烟草T1 RRT-PCR结果图；其中，M:DNA Marker ; 1-15:转化植株；16:纯水对照；CK-:非转化植株；
[0025]图13为实施例中干旱胁迫对土壤含水量的影响图；其中，A:转基因烟草土壤水分含量；B:野生型烟草土壤水分含量；
[0026]图14为实施例中干旱胁迫对1\代烟草可溶性蛋白含量的影响图；其中，A:转基因烟草可溶性蛋白含量变化；B:野生型烟草可溶性蛋白含量变化；C:未处理野生型烟草可溶性蛋白含量变化； [0027]图15为实施例中干旱胁迫对T1代烟草可溶性糖含量的影响图；其中，A:转基因烟草可溶性糖含量变化；B:野生型烟草可溶性糖含量变化；C:未处理野生型烟草可溶性糖含量变化；
[0028]图16为实施例中干旱胁迫对1\代烟草丙二醛含量的影响图；其中，A:转基因烟草丙二醛含量变化；B:野生型烟草丙二醛含量变化；C:未处理野生型烟草丙二醛含量变化；
[0029]图17为实施例中干旱胁迫对1\代烟草脯氨酸含量的影响图；其中，A:转基因烟草脯氨酸含量变化；B:野生型烟草脯氨酸含量变化；C:未处理野生型烟草脯氨酸含量变化。
【具体实施方式】
[0030]【具体实施方式】一:本实施方式的毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的基因序列如序列表Seq ID No: I所不。
[0031]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的编码蛋白，编码蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
[0032]其它步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0033]通过以下试验验证本发明的效果:
[0034]一: GPUCH基因的克隆
[0035]1.以毛尖紫萼藓为材料，采用改良的SDS法提取总RNA:
[0036](I)取0.3g毛尖紫萼藓于液氮中快速研磨成粉末状，转至1.5mL离心管中，加入750 μ LSDS, 350 μ L Tris 饱和酚，350 μ L 氯仿，震荡 IOmin, 4°C 12000rpm 离心 IOmin ；
[0037]SDS配方:2 % SDS, 0.0125mol/L 四硼酸钠，50mmol/L Tris-Cl，200mmol/L氯化钠，20mmol/L EDTA ；
[0038](2)取上清,分别加入350 μ L Tris饱和酹和氯仿,震荡IOmin, 4°C 12000rpm离心IOmin ；
[0039](3)重复步骤(2) —次；
[0040](4)取上清,加入等体积氯仿,震荡IOmin, 4°C 12000rpm离心IOmin ；
[0041](5)取上清，加入1/2体积的8mmol/L LiCl，1/2体积75 %乙醇，于_20°C沉降Ih ；
[0042](6) 40C 12000rpm离心20min，弃上清，用600 μ L75 %乙醇洗涤沉淀2次，冰浴晾干;
[0043](7)加适量DEPC处理水溶解沉淀，用I %琼脂糖凝胶电泳检查其完整性，检测结果如图1所示。[0044]2.以RNA为模板，按照Promega公司M-MLV反转录酶说明书对2 μ g总RNA进行逆转录合成cDNA第一链。
[0045]3.GpUCH 基因克隆
[0046]从毛尖紫萼藓干旱cDNA文库中获得的GpUCH基因长为666bp，经NCBI Blast验证有完整的5 '端，无3 '端，因此设计3 ' -RACE弓丨物GpUCH_GSP和GpUCH_NGSP，分别与通用引物UMP进行2轮PCR，扩增获得全长序列，操作步骤按SMART-ER?RACE cDNAAmplification Kit (Clontech)试剂盒说明书进行。将目的条带进行胶回收，回收产物与PMD-18T Simple Vector连接，转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，筛选阳性克隆并测序，命名为PGpUCH。测序后得到871bp的特异性条带。如图2和3所示(2为:V -RACE扩增结果；3为PCR扩增结果)。
[0047]其中，所述SMART-ER?RACE cDNA Amplification Kit 试剂盒购买自 Clontech 公司；
[0048]毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GPUCH制备过程中设计的上游引物3' -RACE特异上游引物如序列表SEQ ID N0.3所示；
[0049]毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GPUCH制备过程中设计的下游引物3' -RACE特异下游引物如序列表SEQ ID N0.4所示；
[0050]通用引物UMP核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.5所示；
[0051]全长验证引物上游GpUCH-F引物核苷酸序列通用引物UMP核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.6 所示；
[0052]全长验证引物下游GpUCH-R引物核苷酸序列通用引物UMP核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.7 所示；
[0053]二、含有目的基因GpUCH表达载体的构建
[0054]1.提取含有GpUCH基因的T载体质粒，用Sal I和BamH I双酶切，获得带有粘性末端的GpUCH基因的cDNA片段。结果如图3所示(泳道M为Marker2000，泳道I为PGpUCH酶切产物)克隆载体双酶切反应体系如表1所示:
【权利要求】
1.毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH，其特征在于毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的基因序列如序列表Seq ID No: I所不。
2.毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH的编码蛋白，其特征在于该蛋白由如权利要求I所述的毛尖紫萼藓泛素羧基末端水解酶基因GpUCH编码，编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No:2所示。
【文档编号】C12N15/57GK103695402SQ201310703425
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】沙伟, 刘博 , 张梅娟, 宋璐, 安洪雪 申请人:齐齐哈尔大学