一种编码巯基-二硫键氧化还原酶基因的应用的制作方法
【专利摘要】本发明披露了一种编码巯基-二硫键氧化还原酶基因在黄原胶生产中的应用。该基因用于构建及选育黄原胶高产的基因工程菌。该基因工程菌携带该基因的重组质粒pL0495，通过将pL0495导入野油菜黄单胞菌野油菜变种的野生型菌株8004获得。本发明鉴定了Xcc8004菌株基因组中编码巯基-二硫键氧化还原酶基因与黄原胶产量有关，该基因可用于构建、选育黄原胶高产的基因工程菌株。
【专利说明】—种编码巯基-二硫键氧化还原酶基因的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物遗传工程技术，尤其涉及一种编码巯基-二硫键氧化还原酶基因在改良黄原胶高产菌株中的应用。
【背景技术】
[0002]黄原胶(Xanthan gum)是一种由野油菜黄单胞菌(Xanthomonas oampestris)所产生的胞外多糖(extracellular polysaccharide,EPS)聚合物，由多个“五糖单元”聚合而成。两个D-葡萄糖分子通过(6-(1 — 4)糖苷键连接成主链骨架，一条由甘露糖-(P — 1，
4)_葡萄糖醛酸-(P — 1，2)_甘露糖组成的侧链通过a_(l —3)糖苷键连接到主链的一个D-葡萄糖残基，组成一个“五糖单元”(Swings & Civerolo, 1993)。“五糖单元”例链的甘露糖残基不同程度地被乙酰化或丙酮酰化。不同来源的菌株和不同培养条件所产生的黄原胶的结构基本相同，但侧链的酰基化程度不同，因而乙酸和丙酮酸的含量不同，黄原胶的质量也就不同(Cadmus et al., 1976 ；Stankowski et al., 1993)。工业生产上通常采用野油菜黄单胞菌野油菜变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc)作为生产菌种进行发酵生产黄原胶。
[0003]黄原胶是目前仅次于抗生素和溶剂的第三大类发酵产品，具有良好的假塑性和流变性，被作为悬浮剂、增稠剂、乳化剂等广泛应用于二十多个工业行业的一百多种产品的生产中。目前全球对黄原胶的年消耗量超过5万吨，并且每年仍以10%的速度增长(Beckeret al., 1998 ；Garcia~0choa et al., 2000 ；Swings & Civerolo，1993)。
[0004]由于黄原胶具`有巨大的商业价值，其生物合成机理的研究从上世纪八十年代起在国际上就受到人们的重视，已发现黄原胶合成的一些重要途径和所需的酶系统。目前已鉴定Xcc染色体上有三簇基因与黄原胶合成有关:参与糖核苷等衍生物前体形成的一个
35.3kb 的基因簇(Harding etal., 1993 ；Koplin et al., 1992),参与“五糖单元”的顺序性
组装、残基修饰、重复单元间的聚合以及黄原胶分泌的gum基因簇(Harding et al., 1987 ；Ielpi et al.，1993)，以及一个包含三个基因但在黄原胶合成过程的具体作用尚未十分清楚的基因簇(Lu et al.，2007)。尽管人们已对黄原胶的生物合成机理作了较多的研究，但有关黄原胶生物合成的调控、影响黄原胶生物合成的产量和质量的其他代谢途径等问题仍尚未十分清楚。
[0005]黄原胶在我国的研究开发始于八十年代，并于八十年代末实现了国产黄原胶的工业化生产。但是，国产黄原胶与国外产品相比，生产成本高、产品质量差，不具备与国外产品竞争的能力。目前国外产品在国内黄原胶市场仍占很大的份额，并随着国内黄原胶市场需求的增加其市场份额有逐渐增加趋势。改良黄原胶生产菌株、提高黄原胶产量和质量，是我国黄原胶生产面临的主要问题。发达国家黄原胶生产菌株的黄原胶产量比国内的生产菌株往往高出20%以上。另外，在黄原胶的粘度、抗盐性和对酸碱热的稳定性等质量指标方面，国外产品也比国内产品要高。因此国内黄原胶生产企业迫切需要优良的黄原胶生产菌株和新的生产工艺。由于采用传统的育种方法改良菌种效果有限，故人们寄望于采用现代遗传工程手段来定向改良菌种。鉴定和克隆与黄原胶生物合成相关的基因，将可为通过遗传工程改良菌种或设计新工艺提供工作基础。
[0006]许多生物体的蛋白质功能的发挥需要形成并维持一定的空间构象，二硫键对形成和维持稳定的且具有活性蛋白质构象起着非常重要的作用。近年来，在一些细菌中发现了七个 Dsb 家族(DsbA-G)的疏基-二硫键氧化还原酶(thiol-disulf ide oxidoreductase)催化细胞周质多肽的折叠和氧化，DsbD便是其中的一种。另外，也发现了 DsbD在细胞色素C的合成过程有关，作用于细胞色素C的还原。但有关DsbD在黄原胶生产中的应用尚未见文献报道。
[0007]主要参考文献
[0008]Becker,A.,Katzen,F.,Puhler,A.et al.(1998).Xanthan gum biosynthesis andapplication:a biochemical / genetic perspective.Appl Microbiol Biotechnol，50:145-152
[0009]Cadmus, M.C.,Rogovin,S.P., Burton, K.A.et al.(1976).Colonial variation inXanthomonas campestris NRRL B—1459and characterization of the Dolvsaccharidefrom a variant strain.Can J Microbiol,22(7):942—948
[0010]Chung, J.，Chen, T.，Missiakas，D.(2000).Transfer of electrons across thecytoplasmic membrane by DsbD, a membrane protein involved in thioldisulphideexchange and protein folding in the bacterial periplasm.Mol Microbiol，35(5):1099—1109.[0011]Fabianek，R.A., Hennecke, H.，Thony，M.L.(2000).Periplasmic Protein Thiol:Disulfide Oxidoreductases of Escherichia Col1.FEMS Microbiol Rev,24 (3):303—316.[0012]Garcia-Ochoa, F.，Santos，V.E.，Casas, J.A.et al.(2000).Xanthan gum:production，recovery, and properties.Biotechnol Adv，18:549—579Harding，N.E.，Cleary, J.M.，Cabanas, D.K.et al.(1987).Genetic and physical analyses ofa cluster of genes essential for xanthan gum biosynthesis in Xanthomonascampestris.J Bacteriol，169:2854—2861
[0013]Harding，N.E.，Raffo，S.，Raimondi，A.et al.(1993).1dentification, geneticand biochemical analysis of genes involved in synthesis sugar nucleotideprecursors of xanthan gum.J Gen Microbiol，139:447—457
[0014]Ielpi, L, Couso，R.0.，Dankert, M.A.(1993).Sequential assembly andpolymerization of the polypreno1-1 inked pentasaccharide repeating unit of thexanthan polysaccharide in Xanthomonas campestris.J Bacteriol，175:2490—2500.[0015]Koplin.R.，Arnold, W.，Hotte，B.et al.(1992).Genetics of xanthanproduction in Xanthomonas campestris:the xanA and xanB genes are involvedin UDP-glucose and GDP—mannose biosynthesis.J Bacteriol，174:191—199.Lu,G.T.，Ma, Z.F.，Hu, J.R.，Tang, D.J.，He，Y.Q.，Feng, J.X.，Tang, J.L (2007).A hovellocus involved in extracellular polysaccharide production and virulence ofXanthomonas campestris pathovar campcstris.Microbiology, 153:737-746.[0016]tankowski, J.D., Mueller, B.E., Zeller, S.G.(1993).Location of a second0-acetyl group in xanthan gum by the reductive-cleavage method.Carbohydr Res,241:321-326.[0017]Stewart, E.J., Katzen, F., Beckwith, J.(1999).Six conserved cysteines ofthe membrane protein DsbD are required for the transfer of electrons from thecytoplasm to the periplasm of Escherichia col1.EMBO J,18(21):5963—5971.[0018]Swings, J.G.& Civerolo, E.L.(1993).Xanthomonas.London:Chapman & Hall.[0019]Vandcrslice, R.ff., Doherty, D.H., Capage, M.A.et al.(1988).Geneticengineering of polysaccharide structure in Xanthomonas campestris.pp.145—157.1n V.Crcscenz i , 1.C.M.Dea, S.Paoletti , S.S.Stivala, 1.ff.Sutherland(ed.).Biomedical and biotechnological advances in industrial polysaccharides.New York:Gordon and Breach Science Publishers.
【发明内容】
[0020]本发明所要解决的技术问题是提供一种编码巯基-二硫键氧化还原酶基因的应用，该基因用于构建能够改良黄原胶生产菌株的基因工程菌。
[0021]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种编码巯基-二硫键氧化还原酶基因在黄原胶生产中的应用。
[0022]优选地，所述基因用于构建及选育黄原胶高产的基因工程菌。
[0023]优选地，所述基因工程菌携带该基因的重组质粒PL0495，通过将pLp495导入野油菜黄单胞菌野油菜变种的野生型菌株8004获得。
[0024]优选地，所述基因工 [0025]优选地，所述基因是下列核苷酸序列之一:
[0026]I)序列表中序列I的DNA序列；
[0027]2)与序列表中序列I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
[0028]优选地，序列表中序列I的DNA序列是野油菜黄单胞菌8004菌株的基因组中的一段DNA序列，由2820个核苷酸组成，含完整的编码巯基-二硫键氧化还原酶的基因，自5'端的第481-2787位核苷酸为该基因的开放阅读框，自5'端的第481-483位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5'端的第2785-2787位核苷酸为终止密码子TGA。
[0029]优选地，在序列表中序列2的蛋白质是所述基因编码的巯基-二硫键氧化还原酶演绎的氨基酸序列，由768个氨基酸组成。该蛋白质预测分子量为81817道尔顿，等电点为8.92。
[0030]优选地，含有所述基因的表达载体为pL0495。
[0031]优选地，所述基因的缺失突变体0495nK。
[0032]本发明鉴定了 Xcc8004菌株基因组中编码巯基-二硫键氧化还原酶基因(编号为XC_0531，其EC为1.8.1.8)与黄原胶产量有关，该基因可用于构建、选育黄原胶高产的基因工程菌株。
【专利附图】
【附图说明】[0033]图1为本发明对XC_0531基因整合突变体0495nk的PCR验证，其中:
[0034]M:100bp DNA ladder ；1:野生型菌株 8004 ;2 ~5:整合突变体 0495nk ；
[0035]图2为克隆有XC_0531基因的重组质粒pL0495酶切电泳图谱，其中:
[0036]Ml:100bp 标准 DNA ；1:载体 pLAFR3 ；2:重组质粒 pL0495 ；
[0037]M2:DNA 标记入 DNA / HindIII ；
[0038]图3为本发明对Xcc的XC_0531基因突变体0495nk及其及工程菌8004 / pL0495
黄原胶产量的定性检测。
【具体实施方式】
[0039]以下结合附图和优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下例举的实施例仅意图说明本发明，而不意图限制本发明的技术方案。本发明的范围由后附的权利要求限定。
[0040]本发明提供的黄单胞菌中一种编码巯基-二硫键氧化还原酶(thiol-disulfideoxidoreductase)的基因(在Xcc8004菌株基因组中编号为XC_0531基因)，其是下列核苷酸序列之一:
[0041]I)序列表中序列I的DNA序列；
[0042]2)与序列表中序列I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
[0043]序列表中序列I的DNA序列是野油菜黄单胞菌(Xcc) 8004菌株的基因组中的一段DNA序列，由2820个核苷酸组成，含完整的编码巯基-二硫键氧化还原酶(thiol-disulfideoxidoreductase)的基因(编号为XC_0537)，自5'端的第481-2787位核苷酸为该基因的开放阅读框(Open Reading Frame,0RF),自5'端的第481—483位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5'端的第2785— 2787位核苷酸为终止密码子TGA。
[0044]序列表中序列2的蛋白质是XC_0531基因编码的疏基_ 二硫键氧化还原酶(thiol-disulfide oxidoreductase)的氨基酸序列，由768个氨基酸组成。该蛋白质预测分子量为81817道尔顿，等电点为8.92。
[0045]该基因的序列已在美国国立生物技术信息中心(NCBI)公布，基因组序列号NC_007086，该基因编码蛋白序列号YP_241632。该基因的整合突变体0495nk、携带该基因的质粒PL0495以及携带多拷贝PL0495的Xcc基因工程菌8004 / pL0495已在广西大学生命科学与技术学院保存。
[0046]本发明还涉及含有上述基因的表达载体，优选为pL0495。
[0047]本发明提供上述基因在基因工程改良黄原胶的生产菌种中的应用。
[0048]在以下本发明的实施例中所用到的材料包括:
[0049]野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)野生型菌株8004，购于英国植物病原细菌国家保藏中心(The National Collection of Plant Pathogenic Bacteria,NCPPB),保藏号为 NCPPB N0.1145 ；
[0050]大肠杆菌(Escherichiacoli)株系 JM109、载体pGEM_3Zf (+)购自 Promega 公司，带有 Iac 启动子的载体 pLAFR3 (Staskawicz et al., 1987)
[0051]自杀质粒pK18mob ( Schafer et al., 1994)为本研究室保存的质粒；
[0052]限制性内切酶、连接酶和其它修饰酶等试剂购自Promega、QIAGEN公司等；[0053]PCR反应所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0054]实施例1
[0055]野油菜黄单胞菌Xcc中巯基-二硫键氧化还原酶编码基因(XC_0531)突变体的构
建
[0056]采用自杀质粒pK18mob诱变XC_0531基因，具体方法参照windgassen等(FEMSMicrobiol.Lett.2003，193:201— 205)所描述。[0057]根据XC_0531基因的DNA序列(基因组序列号NC_007086，Qian et al.，2005)，设计引物 0531F/R(0531F:ACAGTTGGATCCAGCACGCCGGTAAAGAAG:0531R:ACAGTTGGATCCGATCCTGTCGCTGAAGGT)，以野油菜黄单胞菌8004菌株总DNA为模板，采用PCR法(95°C预变性4min ;95°C变生lmin，55°C复性30s，74°C延伸30s,30个循环；74°C延伸5min)扩增XC_0531基因的ORF内800~1126bp之间的327bp区域的同源片段，为方便克隆，引物的5'端分别加上相应的酶切位点序列(即上述DNA引物序列中的下划线部分)。DNA片段经BamHI酶切后，克隆到pK18mob上。将获得的重组质粒通过三亲本接合导入Xcc野生型菌株8004，筛选具有卡那霉素(Km)和利福平(Rif)抗性的接合子，三亲本接合具体方法可参考Turner等所述(1985)。随机挑选4株接合子，分别提取总DNA作为模板，以根据自杀质粒pK18mob的序列和XC_0531终止密码子下游的DNA序列分别设计的引物P18conF (GCCGATTCATTAATGCAGCTGGCAC)和 C0531R1 (GCGGCAGTCAGTACTGAT)进行 PCR 验证，以野生型菌株8004作为对照。根据设计，如XC_0531被整合突变，可从突变体的总DNA中扩增出约1300bp左右的PCR产物。
[0058]图1所示的PCR反应结果显示，以接合子总DNA为模板时，扩增所获得DNA片段约1300bp (图1中2-5泳道)，与预期的大小相符，而在对照中则没有PCR产物(图1中I泳道)，这证实了这些接合子是XC_0531基因的整合突变体，命名为0495nk。
[0059]实施例2
[0060]巯基-二硫键氧化还原酶编码基因(XC_0531)的克隆、序列测定及携带多个拷贝XC_0531基因的基因工程菌的构建
[0061]根据XC_0531 基因的 DNA 序列(NC_007086, Qian et al.，2005)，设计引物C0531F/R(C0531F=AAGCTT GCGGCAGTCAGTACTGAT ；C0531R:GGATCCTCCCATGCTGAATCAAGC)，以 Xcc8004 菌株总 DNA 为模板，PCR(95°C预变性 4min ;95°C变性 lmin，55°C复性 30s，74°C延伸3min，30个循环；74°C延伸5min)扩增该基因全长序列(包含XC_0537基因编码区上游439bp和下游28bp的2774bp的DNA片段)。为方便克隆，引物的5'端分别加上BamHI和HindIII的酶切位点序列(上述DNA引物序列中的下划线部分)。将所获得的DNA片段克隆至载体pGEM3Zf (+)中，用Sanger末端中止法对所克隆的DNA核苷酸序列进行测序验证。将测序验证正确的DNA片段克隆到广谱宿主质粒PLAFR3位点上，获得了含XC_0531基因的重组质粒PL0495。该质粒用BamH、HindIII酶切，除了一条约22kb的载体DNTA片段外，还有一条约2.8kb的外源片段(请参见图2，M为Marker，I为质粒pLAFR3，2为重组质粒 pL0495)。
[0062]构建携带多拷贝的XC_0531基因的基因工程菌的实施，是采用Turner等所述的三亲本接合法将重组质粒PL0495导入Xcc野生型菌株8004，获得携带重组质粒pL0495的基因工程菌株8004 / pL0495，请参见图3。[0063]实施例3
[0064]巯基-二硫键氧化还原酶编码基因(XC_0531)突变体及工程菌8004 / pL0495的
黄原胶产量检测
[0065]Xcc黄原胶产量的定性定量的检测是参照Tang等(Mol.Gen.Genet.1991，226:409-417)所描述方法进行。
[0066](I)定性检测
[0067]将XC_0531基因的突变体0495nk、携带多拷贝XC_0531的基因工程菌8004 /PL0495接种在含2%葡萄糖或蔗糖的NYG培养基的平板上，以野生型菌株g004作对照，培养5cL
[0068]结果可见突变体形成的菌落要比野生型菌株8004小，而工程菌8004 / pL0495形成的菌落则比野生型菌株较大较圆润粘稠，如图3所示。这表明与野生型菌株8004相比，突变体0495nk的黄原胶产量可能降低，而工程菌8004 / pL0495的产量增加。
[0069](2)定量检测
[0070]为准确衡量EPS的产量，采用摇瓶发酵准确测定Xcc菌株的产量。将菌株培养在分别添加有葡萄糖和蔗糖的NYG液体培养基中，培养5d后，8004菌株、突变体0495nk以及工程菌8004 / pL0495在含葡萄糖、蔗糖的培养基中黄原胶产量如表1所示。
[0071]表1
[0072]
【权利要求】
1.一种编码巯基-二硫键氧化还原酶基因在黄原胶生产中的应用。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因用于构建及选育黄原胶高产的基因工程菌。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌携带所述基因的重组质粒pL0495，通过将所述pL0495导入野油菜黄单胞菌野油菜变种的野生型菌株8004获得。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因工程菌为携带所述基因的多拷贝 pL0495 的 8004 / pL0495。
5.按照权利要求1至4任一项所述的应用，其特征在于，所述基因是下列核苷酸序列之 1)序列表中序列I的DNA序列； 2)与序列表中序列I限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
6.按照权利要求5所述的应用，其特征在于， 所述序列表中序列I的DNA序列是所述野油菜黄单胞菌8004菌株的基因组中的一段DNA序列，由2820个核苷酸组成，含完整的编码巯基-二硫键氧化还原酶的基因，自5'端的第481-2787位核苷酸为该基因的开放阅读框，自5'端的第481-483位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5'端的第2785-2787位核苷酸为终止密码子TGA。
7.按照权利要求5所述的应用，其特征在于， 在所述序列表中序列2的蛋白质是所述基因编码的巯基-二硫键氧化还原酶演绎的氨基酸序列，由768个氨基酸组成。该蛋白质预测分子量为81817道尔顿，等电点为8.92。`
8.按照权利要求5所述的应用，其特征在于，含有所述基因的表达载体为所述pL0495。
9.按照权利要求5所述的应用，其特征在于，所述基因的缺失突变体0495nK。
【文档编号】C12N15/74GK103695453SQ201310705911
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】陆光涛, 胡杰, 李磊, 王一诺, 崔萍, 陈蕾, 唐纪良 申请人:广西大学