减少1-＞2读框移位的方法
【专利摘要】本文报道了一种重组生产包含二肽AR的多肽的方法，其特征在于所述方法包括从包含编码所述多肽的核酸的细胞或包含编码所述多肽的核酸的细胞的培养物的培养基回收多肽，从而生产所述多肽，其中包含在所述多肽中的二肽AR由寡核苷酸gca?cgt，或寡核苷酸gcg?cgt，或寡核苷酸gcc?cgt编码。
【专利说明】减少1- > 2读框移位的方法
[0001 ] 本发明属于重组多肽生产领域。本文报道了一种重组生产具有减少的副产物含量的多肽的方法，其中通过修饰在翻译或转录过程中减少移码(frameshift)的编码核酸实现副产物含量的减少。
_2] 发明背景
[0003]蛋白质在现今的医用组合中发挥重要作用。对于人的应用，每种药用物质必须满足不同的标准。为了保证生物药剂对人的安全性，尤其必须将会引起严重危害的核酸，病毒，和宿主细胞蛋白质移除。为了满足质量管理规格标准(regulatory specificat1n),—个或更多个纯化步骤必须按照制造工艺。
[0004]可以例如通过原核细胞(比如大肠杆菌)生产重组多肽。重组生产的多肽占原核细胞的多肽含量的大多数并且经常在原核细胞内沉积为不溶的聚集体，即为所谓的包涵体。为了分离重组多肽，必须将细胞破碎并且必须在从细胞碎片分离包涵体之后将包含在包涵体中的重组多肽溶解。对于增溶离液剂，使用比如脲或盐酸胍。为了切开二硫键，尤其在碱性条件下加入还原剂，比如二硫赤藓醇，二硫苏糖醇，或巯基乙醇。溶解聚集的多肽之后，必须将重组多肽的对于生物活性至关重要的球状结构重建。在该所谓的复性过程中，例如通过针对合适的缓冲液透析(缓慢)降低还原剂的浓度，其允许变性的多肽重折叠为其生物活性结构。复性后，纯化重组多肽到对于预期用途可接受的纯度。例如，对于作为治疗性蛋白质的使用，必须建立大于90 %的纯度。
[0005]重组生产的多肽通常伴有来自生产细胞的核酸，内毒素，和/或多肽。除了宿主细胞来源的副产物，在粗制多肽制备物中还存在多肽来源的副产物。除了别的以外，可以存在研究的多肽的截短的变体。
[0006]在WO 95/25786中，报道了在细菌表达系统中生产人载脂蛋白Al。
[0007]发明概沭
[0008]已经发现，编码二肽AR的寡核苷酸可以是在编码包含二肽AR的多肽的核酸的翻译或转录过程中1->2移码的点。由于移码的出现，产生具有不编码的氨基酸序列的无义多肽。
[0009]因此，已经发现，包含在编码更大多肽的核酸中的编码二肽AR的寡核苷酸应该选自寡核苷酸 gca cgt (SEQ ID NO:03), gcg cgt (SEQ ID NO:04) JPgcc cgt (SEQ ID NO:05)。已经发现，编码所述二肽AR的寡核苷酸中的第四个核苷酸不应该是‘a’。
[0010]如本文报道的一个方面是重组生产包含所述二肽AR (SEQ ID NO:06)的多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤:
[0011]-从包含编码所述多肽的核酸的细胞或包含编码所述多肽的核酸的细胞的培养物的培养基回收所述多肽并从而生产所述多肽，
[0012]其中包含在编码所述多肽的核酸中的编码所述二肽AR的寡核苷酸在第四位具有核苷酸‘c’。
[0013]因此，作为一个方面，本文报道了，重组生产包含二肽AR(SEQ ID NO:06)的多肽的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤:
[0014]-从包含编码所述多肽的核酸的细胞或包含编码所述多肽的核酸的细胞的培养物的培养基回收所述多肽并从而生产所述多肽，
[0015]其中包含在所述多肽中的二肽AR由寡核苷酸gca cgt (SEQ ID N0:03)，或寡核苷酸 gcg cgt (SEQ ID NO:04)，或寡核苷酸 gcc cgt (SEQ IDNO:05)编码。
[0016]如本文报道的一个方面是在包含二肽AR (SEQ ID NO:06)的多肽的生产中减少由1- > 2移码导致的副产物形成的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤:
[0017]-从包含编码所述多肽的核酸的细胞或包含编码所述多肽的核酸的细胞的培养物的培养基回收所述多肽并从而生产所述多肽，
[0018]其中编码包含在编码所述多肽的核酸中的二肽AR的寡核苷酸在第四位具有核苷酸 ‘C，。
[0019]因此，作为一个方面，本发明报道了在包含二肽AR (SEQ ID NO:06)的多肽的重组生产中减少由1- > 2移码导致的副产物形成的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤:
[0020]-从包含编码所述多肽的核酸的细胞或包含编码所述多肽的核酸的细胞的培养物的培养基回收所述多肽并从而生产所述多肽，
[0021]其中包含在所述多肽中的二肽AR由寡核苷酸gca cgt (SEQ ID N0:03)，或寡核苷酸 gcg cgt (SEQ ID NO:04)，或寡核苷酸 gcc cgt (SEQ ID NO:05)编码。
[0022]在如之前报道的所有方面的一个实施方案中，所述二肽AR是所有二肽AR。
[0023]在如本文报道的所有方面的一个实施方案中，所述二肽AR是氨基酸序列中最后的二肽AR。
[0024]如本文报道的一个方面是重组生产包含二肽AR (SEQ ID NO:06)的SEQ ID NO:09或SEQ ID NO:11的载脂蛋白A-1的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤:
[0025]-从包含编码SEQID NO:09或SEQ ID NO: 11的载脂蛋白A-1的核酸的细胞或包含编码SEQ ID N0:09或SEQ ID NO:11的载脂蛋白A-1的核酸的细胞的培养物的培养基回收所述载脂蛋白A-1并从而生产所述载脂蛋白A-1，
[0026]其中包含在编码所述载脂蛋白A-1的核酸中的编码最后的二肽AR的寡核苷酸在第四位具有核苷酸‘C’。
[0027]因此，作为一个方面，本发明报道了重组生产包含二肽AR(SEQ ID NO:06)的SEQID NO:09或SEQ ID NO: 11的载脂蛋白A-1的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤:
[0028]-从包含编码SEQID NO:09或SEQ ID NO: 11的载脂蛋白A-1的核酸的细胞或包含编码SEQ ID N0:09或SEQ ID NO:11的载脂蛋白A-1的核酸的细胞的培养物的培养基回收所述载脂蛋白A-1并从而生产所述载脂蛋白，
[0029]其中包含在所述载脂蛋白A-1氨基酸序列中的最后的二肽AR由寡核苷酸gcacgt (SEQ ID NO:03)，或寡核苷酸 gcg cgt (SEQ ID NO:04)，或寡核苷酸 gcc cgt (SEQ ID NO:05)编码。
[0030]如本文报道的一个方面是编码在其氨基酸序列中包含二肽AR的多肽的核酸，其中所述二肽AR由寡核苷酸gca cgt (SEQ ID NO:03)，或寡核苷酸gcg cgt (SEQ ID NO:04),或寡核苷酸gcc cgt (SEQ ID NO:05)编码。
[0031]如本文报道的一个方面是包含如本文报道的核酸的细胞。
[0032]如本文报道的一个方面是寡核苷酸gca cgt (SEQ ID NO:03)，或寡核苷酸gcgCgt (SEQ ID NO:04)，或寡核苷酸gcc cgt (SEQ ID NO:05)用于编码包含在多肽中的二肽AR的用途。
[0033]以下具体说明如本文报道的所有方面的实施方案。
[0034]在一个实施方案中，所述二肽AR由寡核苷酸gca cgt (SEQ ID NO:03)编码。
[0035]在一个实施方案中，所述二肽AR由寡核苷酸gcg cgt (SEQ ID NO:04)编码。
[0036]在一个实施方案中，所述二肽AR由寡核苷酸gcc cgt (SEQ ID NO:05)编码。
[0037]在一个实施方案中，所述多肽包含约50个氨基酸残基至约500个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述多肽包含约100个氨基酸残基至约400个氨基酸残基。在一个实施方案中，所述多肽包含约250氨基酸残基至约350氨基酸残基。
[0038]在一个实施方案中，所述细胞是原核细胞。在一个实施方案中，所述原核细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞，或芽胞杆菌(Bacillus)细胞。
[0039]在一个实施方案中，所述细胞是真核细胞。在一个实施方案中，所述细胞是CHO细胞，或HEK细胞，或BHK细胞，或NSO细胞，或SP2/0细胞，或酵母细胞。
[0040]在一个实施方案中，所述多肽是异源多聚多肽。在一个实施方案中，所述多肽是抗体或抗体片段。
[0041]在一个实施方案中，所述多肽是同源多聚多肽。在一个实施方案中，所述多肽是同源二聚体或同源三聚体。
[0042]在一个实施方案中，所述多肽是人载脂蛋白A-1或具有人载脂蛋白A-1的生物活性的其变体。在一个实施方案中，所述载脂蛋白A-1变体具有选自SEQ ID N0:09至SEQ IDNO:14的组的氨基酸序列。
[0043]在一个实施方案中，所述多肽是具有SEQ ID NO:09或SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的人载脂蛋白A-1。
[0044]发明详沭
[0045]定义:
[0046]术语"氨基酸"指羧基α-氨基酸类，其可以直接或以前体的形式由核酸编码。个体氨基酸被由三个核苷酸组成的核酸(所谓密码子或碱基三联体)编码。每个氨基酸由至少一个密码子编码。由不同密码子编码相同氨基酸被称为“遗传密码的简并”。术语”氨基酸”指天然存在的羧基α -氨基酸并且包括丙氨酸(三字母代码:ala，单字母代码:A)，精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N),天冬氨酸(asp, D),半胱氨酸(cys,C),谷氨酰胺(gin,Q)，谷氨酸(glu，E)，甘氨酸(gly，G)，组氨酸(his，H)，异亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，赖氨酸(lys, K)，甲硫氨酸(met, Μ)，苯丙氨酸(phe, F)，脯氨酸(pro, P)，丝氨酸(ser, S)，苏氨酸(thr,T),色氨酸(trp,W),酪氨酸(tyr, Y),和纟颜氨酸(val,V)。
[0047]术语"载脂蛋白A-1"指具有蛋白质-脂质和蛋白质-蛋白质相互作用性质的，两亲的，螺旋多肽。载脂蛋白A-1由肝和小肠合成为267个氨基酸残基的前载脂蛋白原(prepro-apolipoprotein),其以载脂蛋白原(pro-apolipoprotein)分泌，所述载脂蛋白原被切割为具有243个氨基酸残基的成熟多肽。载脂蛋白A-1由6至8个不同氨基酸重复(每个由被接头部分(常常是脯氨酸)分开的22个氨基酸残基组成)组成，并且在一些情况下由通过一些残基构成的区段组成。在GenPept数据库入口(database entry)NM-000039或数据库入口 X00566 ;GenBank NP-000030.1 (gi 4557321)中报道了代表性的人载脂蛋白A-1氨基酸序列。存在人载脂蛋白A-1 (SEQ ID NO:07)的天然存在的变体，比如P27H，P27R, P28R, R34L, G50R, L84R, D113E, A-A119D，D127N, K131 的缺失，K131M, W132R, E133K,R151C(氨基酸残基 151 从 Arg 改变为 Cys，载脂蛋白 A-1-Paris)，E160K, E163G，P167R，L168R，E171V，P189R，R197C(氨基酸残基 173 从 Arg 改变为 Cys，载脂蛋白 A-1-Milano)和E222K。还包括的是具有保守氨基酸修饰的变体。
[0048]术语“密码子”指由编码限定的氨基酸的三个核苷酸组成的寡核苷酸。由于遗传密码的简并性，一些氨基酸由多于一种密码子编码。这些编码相同氨基酸的不同密码子在个体宿主细胞中具有不同的相对使用频率。因此，特定氨基酸可以由一组不同的密码子编码。同样地，多肽的氨基酸序列可以由不同核酸编码。因此，特定氨基酸可以由一组不同的密码子编码，其中这些密码子中的每个具有给定的宿主细胞中的使用频率。
[0049]表:大肠杆菌密码子使用(密码子I编码的氨基酸I使用频率[% ])
[0050]
【权利要求】
1.一种在包含二肽AR(SEQ ID NO:06)的多肽的生产中减少由1_ > 2移码导致的副产物形成的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤: -从包含编码所述多肽的核酸的细胞或包含编码所述多肽的核酸的细胞的培养物的培养基回收所述多肽，从而生产所述多肽， 其中包含在编码所述多肽的核酸中的编码所述二肽AR的寡核苷酸在第四位具有核苷酸 ‘C，。
2.一种在包含二肽AR(SEQ ID NO:06)的多肽的重组生产中减少由1_ > 2移码导致的副产物形成的方法，其特征在于所述方法包含以下步骤: -从包含编码所述多肽的核酸的细胞或包含编码所述多肽的核酸的细胞的培养物的培养基回收所述多肽，从而生产所述多肽， 其中包含在所述多肽中的二肽AR由寡核苷酸gca cgt (SEQ ID NO:03),或寡核苷酸gcgcgt (SEQ ID NO:04)，或寡核苷酸 gcc cgt (SEQ ID NO:05)编码。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包含在所述多肽中的二肽AR由寡核苷酸gca cgt,或寡核苷酸gcg cgt,或寡核苷酸gcc cgt编码。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于所述细胞是原核细胞。
5.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于所述原核细胞是大肠杆菌细胞。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于所述多肽是载脂蛋白A-1，或具有载脂蛋白A-1活性的其变体，或具有载脂蛋白A-1活性的其融合多肽。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述多肽具有选自包含SEQID NO:09至SEQ ID NO: 14的组的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于所述多肽具有SEQID NO:09或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。
【文档编号】C12N15/67GK104136459SQ201380011005
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年2月22日 优先权日:2012年2月29日
【发明者】阿德尔伯特·格罗斯曼, 弗里德里克·黑塞, E·科佩茨基, 维尔马·劳, 克里斯蒂安·尚茨 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司