用于生产丁醇和丁酸的生物工艺学方法
【专利摘要】本发明涉及一种生产C4体，优选丁酸和/或丁醇的方法，包含以下步骤：使包含在含水培养基中的产乙酸细菌细胞的含水培养基与合成气接触，和将步骤a)中获得的混合物在0至100℃之间的温度下培育至少30分钟，其中在步骤b)中，所述含水培养基包含总组合浓度为至少0.1gL-1的乙醇和/或乙酸。
【专利说明】用于生产丁醇和丁酸的生物工艺学方法
[0001] 本发明涉及一种生产C4体，优选丁酸和/或丁醇的方法，包含以下步骤：使含水培 养基中的产乙酸细菌细胞（acetogenic bacterial cell)与合成气接触，将步骤a)中获得 的混合物在〇至l〇〇°C之间的温度下培育至少30分钟，其中在步骤b)中，含水培养基包含 总组合浓度为至少〇. I g L4的乙醇和/或乙酸。
[0002] 不可再生化石燃料的时代正在终结。虽然化学家迄今已能依赖几乎无限供给的 煤炭、石油和天然气，但是由埋葬在海洋沉积物中的细菌、浮游生物、植物和动物物质经上 百万年形成的这种资源的可得性在不久的将来必然将受到限制。另外，燃烧化石燃料已经 与CO 2的大气浓度提高和相关的气候变化，最值得注意的是全球变暖相联系。因此，生产通 常衍生自化石资源的散装化学品（bulk chemical)，例如丁醇、丁酸及其衍生物的下一代方 法，将必须起始于可再生资源，即可容易地和就地质时间刻度而言快速地补充的材料。
[0003] 工业生物技术，即生物催化剂，例如酶或催化有效生物体（catalyticall competent organism)作为工业催化剂的应用，为使用化石资源作为进料的许多常规方法 提供备选方案。与常规方法相比，生物催化剂不仅能够转化由经常为农业或工艺废物的可 再生材料制造的化合物，否则所述废物将必须被丢弃，而且该生物催化剂不需要使用有毒 的化合物，和最后但并非最不重要的是减少温室气体排放。
[0004] 现有技术中已经报告许多生产丁醇（CH3-CH2-CH 2-CH2-OH)和丁酸（butyric acid) (CH3-CH2-CH2-C00H，也称为丁酸（butyrate)及其C4衍生物的方法，但是其中大部分依赖于 裂解化石燃料并氧化所得短链烃。相反，几乎没有描述从一氧化碳或二氧化碳（得自废气 和样品合成气的化合物）形式的碳起始的方法。
[0005] 合成气，表不包含水和氢气的至少一种和一氧化碳和二氧化碳的至少一种的各种 混合物的术语，是一种可再生的碳源并且可容易地从全世界获得，使用各种起始材料生产 合成气的方法是已知的，包括天然气或液烃的蒸汽转化和煤炭或生物质的气化。
[0006] 现有技术中已经报告合成气用于生产包含碳链的化合物的用途。但是，先前描述 的方法依赖于添加额外的底物，特别是碳水化合物，例如葡萄糖。基于微生物消耗合成气作 为碳源的方法导致所需化合物的产率相当不令人满意。
[0007] 因此，构成本发明基础的问题是提供一种从一氧化碳或二氧化碳（优选合成气的 形式）起始生产C4体，优选丁醇和/或丁酸的方法。
[0008] 构成本发明基础的另一个问题是提供一种生产C4体，优选丁醇和/或丁酸的方 法，该方法起始于由合成气衍生的碳原子而非存在的其它碳源，特别是碳水化合物，例如葡 萄糖制造的一氧化碳或二氧化碳，就产率和/或形成的丁醇和/或丁酸的纯度或者C4体， 优选丁醇和/或丁酸的比例而言，该方法相比现有技术方法得到改进。
[0009] 构成本发明基础的另一个问题是提供一种从合成气起始生产C4体的方法，其中 相对于一氧化碳和二氧化碳之外的含碳反应物，C4产物的产率得到改善，即合成所需的一 氧化碳和二氧化碳之外的碳化合物的量得到降低。
[0010] 在第一个方面，构成本发明基础的问题由一种生产C4体，优选丁酸和/或丁醇的 方法解决，该方法包含以下步骤： a) 在厌氧条件下使含水培养基中的产乙酸细菌细胞与合成气接触， b) 将步骤a)中获得的混合物在O至100°C之间的温度下培育至少30分钟， 其中在步骤b)中，含水培养基包含总组合浓度超过0.1 g I71的乙醇和/或乙酸。
[0011] 在本发明的第一个方面的第一个实施方案中，问题由一种方法解决，其中乙醇和/ 或乙酸是外源性产生的乙醇和/或乙酸。
[0012] 在第一个方面的第二个实施方案中，其也是第一个方面的第一个实施方案的实施 方案，问题由一种方法解决，其中乙醇和/或乙酸的总组合浓度为0.5 g I/1至20 g L'
[0013] 在第一个方面的第三个实施方案中，其也是第一个方面的第一个至第二个实施方 案的实施方案，问题由一种方法解决，其中合成气包含40至100,优选40至95%的C0。
[0014] 在第一个方面的第四个实施方案中，其也是第一个方面的第一个至第三个实施方 案的实施方案，问题由一种方法解决，其中合成气包含少于10%的co 2。
[0015] 在第一个方面的第五个实施方案中，其也是第一个方面的第一个至第四个实施方 案的实施方案，问题由一种方法解决，其中合成气包含少于10%的C0。
[0016] 在第一个方面的第六个实施方案中，其也是第一个方面的第一个至第五个实施方 案的实施方案，问题由一种方法解决，其中该方法包含以下步骤： C)步骤b)之后从混合物中分离和任选再循环乙醇和/或乙酸。
[0017] 在第一个方面的第七个实施方案中，其也是第一个方面的第一个至第六个实施方 案的实施方案，问题由一种方法解决，其中所述产乙酸细菌细胞选自梭菌， 穆尔氏菌紙和一氧化碳嗜热菌，和优选为CZo 1S car box i di vorans 〇
[0018] 在第一个方面的第八个实施方案中，其也是第一个方面的第一个至第七个实施方 案的实施方案，问题由一种方法解决，其中步骤a)和b)中的pH保持在3至7之间，优选4 至6,更优选5至5. 5。
[0019] 在第一个方面的第九实施方案中，其也是第一个方面的第一个至第八个实施方案 的实施方案，问题由一种方法解决，其中步骤b)在15°C至45°C之间的温度，优选30°C至 40°C下进行。
[0020] 在第一个方面的第十个实施方案中，其也是第一个方面的第一个至第九个实施方 案的实施方案，问题由一种方法解决，其中合成气提供超过80,优选超过90%的最初在步骤 a)中存在的碳。
[0021] 在第一个方面的第十一个实施方案中，其也是第一个方面的第一个至第十个实施 方案的实施方案，问题由一种方法解决，其中该方法以连续方式进行。
[0022] 在第一个方面的第十二个实施方案中，其也是第一个方面的第一个至第十一个实 施方案的实施方案，问题由一种方法解决，其中步骤b)在没有碳水化合物存在下进行。
[0023] 在第二个方面，构成本发明基础的问题由乙醇和/或乙酸用于增加由产乙酸细菌 细胞转化的合成气对C4体，优选丁酸和/或丁醇的比例的用途解决。
[0024] 在第二个方面的第一个实施方案中，问题由一种用途解决，其中乙醇和/或乙酸 外源性产生的乙醇和/或乙酸，并且优选在聚集可检测量的由所述细胞外源性产生的乙醇 和/或乙酸之前，加入到包含产乙酸细菌细胞的含水培养基中。
[0025] 在第二个方面的第二个实施方案中，其也是第二个方面的第一个实施方案的实施 方案，问题由一种用途解决，其中乙酸和/或乙醇以超过0.5 g I71，而不超过20 g I71的乙 醇和/或乙酸的总组合浓度存在于包含产乙酸细菌细胞的含水培养基中。
[0026] 在第二个方面的第三个实施方案中，其也是第二个方面的第一个至第二个实施方 案的实施方案，问题由一种用途解决，其中产乙酸细菌细胞选自梭菌，穆尔氏菌和一氧化碳 嗜热菌，和优选为 trit/i應 car办(orit/i rara/75。
[0027] 不希望受任何理论束缚，本发明人们创立理论，乙醇或乙酸的存在引起将合成气 转化为C4体，优选丁醇和/或丁酸所必须的基因表达，因此增加产乙酸细菌细胞代谢来自 合成气的一氧化碳和二氧化碳的生产率。
[0028] 本发明集中在使用产乙酸细菌细胞生产C4体，优选丁醇和/或丁酸。在优选的 实施方案中，如在此使用的，术语"产乙酸细菌细胞"表示能够在厌氧条件下，优选使用氢 气作为电子给体和二氧化碳作为电子受体或一氧化碳代替二氧化碳，生产乙酸的细菌或古 细菌细胞。许多产乙酸细菌已经在现有技术中公开，包括但不限于醋酸梭菌 acetic^?) (Wieringa，K. T. (1936)，J. Microbiol. Serol. 3,263_273)，伍氏醋酸杆菌 Gceto办acteri應 root/i) (Balch, W. E. , Schobert, S. , Tanner, R. S?和 Wolfe, R. S. (1977)，Int. J. Sys. Bacteriol. 27,335-361)，热醋梭菌（C/ostrit/itt? 从e/maceticwfi?) (Fontaine，F. E，Peterson W. H.，McCoy，E?和 Johnson，M. J. (1942)，J. Bact. 43， 701-715), Clostridium lungdahlii (W00068407), Clostridium autoethanogenum (Aribini 等 Archives of Microbiology 161,345-351)，穆尔氏菌种 HUC22-1 (Sakai 等， Biotechnology Letters 29,1697-1612)，和一氧化碳嗜热菌从e/sw/s)属的那 些（Svetlichny 等（1991), Systematic and Applied Microbiology 14,254_260)。这些 和其它产乙酸细菌细胞是例如可购自美国组织和培养物保藏中心（American Tissue and Culture Collection (ATTC))，美国，或德国微生物菌种保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig)，德国。包含至少两种产乙酸细 菌细胞的混合培养物也在本发明范围内。
[0029] 在优选的实施方案中，如在此使用的，术语"C4体"表示以与包含碳之外的原子的 官能团的任何组合的，包含总共四个碳原子的任何有机化合物。在更优选实施方案中，如在 此使用的，术语"C4体"表示由丁醇或丁酸制造的任何衍生物。在最优选实施方案中，所述 衍生物由衍生化获得，所述衍生化包括不同于包括向丁醇或丁酸或其衍生物"净添加或去 除"碳原子的那些反应的任何反应，包括但不限于氧化，特别是羟基化，还原，和甲基转移， 其中特征"净添加或去除碳原子"不排除暂时添加或去除碳原子，例如将C4体或衍生物暂 时束缚至酶或其辅因子。C4体的实例包含1-丁醇（在本申请中表示为"丁醇"），2-丁醇， 丁酸，1，4- 丁二醇，2, 3- 丁二醇，氨基丁烷，硫代丁醇，异丁烯醇和异丁醇。
[0030] 本发明预期野生型产乙酸细菌细胞和遗传修饰的产乙酸细菌细胞两者的用途。 在优选实施方案中，遗传修饰的产乙酸细菌细胞为已经修饰的产乙酸细菌细胞，使得至少 一种酶的活性涉及Wood-Ljungdahl路径，即将一氧化碳、二氧化碳和氢气转换为乙酸的 路径。在优选实施方案中，如在此使用的，术语"涉及Wood-Ljungdahl路径的酶"包含结 合至所述路径的底物之一，或优选接受所述途径的底物之一作为底物的任何酶，所述途径 的底物优选一氧化碳、二氧化碳或氢气，或当底物转化成乙酸或其衍生物时从任何的这些 底物开始的路径内形成的任何中间体。在另一个优选实施方案中，如在此使用的，术语 "Wood-Ljungdahl路径的酶"表示选自CO脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶的酶（Diekert和 Wohlfahrt, (1994) Antonie van Leeuwenhoek 66 (1-3)，209-221)。可用来遗传修饰细 菌细胞的技术在现有技术中描述，例如Sambrook等（Molecular Cloning-A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press)，如增加酶在细菌细胞中的活性 的方法，例如通过染色体基因扩增的方式，增加编码具有所关心活性的酶的基因的表达（W0 03/014330和WO 03/040373)。在优选实施方案中，所述产乙酸细菌细胞选自腫 carboxidivorans, Clostridium drakei 热场{Clostridium Ijungdahlii)。
[0031] 必要的是该方法在厌氧条件下进行。在优选实施方案中，如在此使用的，术语 "厌氧条件"表示按照优先度递增的顺序，所关心的溶液中的氧气饱和度小于30,20,10， 5,2. 5或1饱和度百分率，其中100%饱和度表示在可比较条件下，例如在20°C大气压下， 用纯氧气体大面积吹洗溶液的情况下，存在的氧气的浓度。对于气体，如在此使用的，术 语"厌氧条件"在优选实施方案中表示按照优先递增的顺序和参考总体积，该气体包含小 于30, 20,10, 5, 2. 5,1，0. 5,0. 1，0. 01%的氧气。在另一个优选实施方案中，如在此使用的， 术语"厌氧条件"表示在气体混合物或溶液中，氧气的浓度是使其不抑制厌氧产乙酸细菌， 优选的生长。本领域技术人员熟知可用来将反应荃和溶 液转变为厌氧的技术，例如用氮气、氩气等冲洗气密容器和溶液，或用耗氧的酶体系，例如 0. 6% (w/v) 0 -D-葡萄糖，0. 5单位mr1葡萄糖氧化酶（Sigma)和200单位mr1过氧化 氢酶（Sigma)补充含水溶液，如 Richter, C. D?等（2002)，J. Biol. Chem. 277 (5)， 3094-3100 描述的。
[0032] 合成气为生产C4体，优选丁醇和/或丁酸的本发明的主要碳源。在优选实施方案 中，如在此使用的，术语"合成气^示包含水和氢气（H 2)的至少一种和一氧化碳（CO)和二 氧化碳（CO2)的至少一种的混合物，其中水、氢气、一氧化碳和二氧化碳的总混合体积为混 合物总体积的至少80%，优选90%。其它组分包含氮气，惰性气体等。在优选实施方案中，合 成气包含40至95%的一氧化碳。在优选实施方案中，合成气包含40至100%，优选40至95% 的二氧化碳和〇. 5至20%的H2。在另一个优选实施方案中，合成气包含小于10%的二氧化 碳。在另一个优选实施方案中，合成气包含小于10%的一氧化碳。在另一个优选实施方案 中，合成气包含至少5%，优选10%的一氧化碳。在另一个优选实施方案中，按照优先度递增 的顺序，氢气和二氧化碳的总组合体积大于混合物总体积的50,60, 70,80, 90,95或99%。在 优选实施方案中，如在此使用的，术语使微生物与本申请中说明的任何组成的"合成气""接 触"表示微生物存在于由所述组成的合成气组成的环境中。
[0033] 根据本发明的方法，使产乙酸细菌细胞在含水培养基中在没有氧气存在下与合成 气接触。在优选实施方案中，术语"含水培养基"包含任何含水溶液，该含水溶液包含生长或 支持产乙酸细菌细胞并且支持乙酸化所需的量的盐和缓冲剂。例如，根据Hurst，K. M.和 Lewis，R. (2010) ,Biochemical Engineering Journal 2010,48,159-165 的含水培养基可 用来进行本发明的教导。在优选实施方案中，含水培养基包含酵母提取物。
[0034] 本发明的关键方面是乙醇（CH3-CH2-OH)和/或乙酸（CH 3-COCT)从反应开始时存 在于含水培养基中，其总组合浓度，即乙酸阳离子的浓度和乙醇的浓度的总和为至少〇. I g L'在其它优选实施方案中，乙醇和/或乙醇的浓度为0. 1至50,0. 2至40,0. 25至20或 0? 5 至 20 g L'
[0035] 不同于等待细胞生产内源性乙酸，外源生产的乙酸和/或乙醇最初在步骤a)中存 在于含水培养基中。在优选实施方案中，如在此使用的，术语"外源性生产的"乙酸和/或 乙醇表示在接触产乙酸细菌细胞之前，在独立的反应釜中生产或纯化的乙酸或乙醇，与步 骤b)中（即步骤a)之后）生产的乙酸和/或乙醇相反。在优选实施方案中，术语"外源性 生产的"乙酸和/或乙醇包含由产乙酸细菌细胞生产的乙酸和/或乙醇，或实际上由与步骤 a)中使用的相同产乙酸细菌细胞生产，但是从反应釜中移出，与生产的任何C4体分离并再 循环的乙酸和/或乙醇。在优选实施方案中，外源性生产的乙酸和/或乙醇的浓度在含水 培养基中保持在最初存在的值或值范围，只要步骤b)中由产乙酸细菌细胞催化的反应继 续。在优选实施方案中，含水培养基中的乙酸和/或乙醇作为整体被认为是外源性的，只要 外源性生产的乙酸和/或乙醇占含水培养基中存在的全部乙酸和/或乙醇的大于80%，优选 大于90%。
[0036] 步骤a)中获得的混合物可以培育至少0. 5，1，2,3,5，10，12，16,24,36,48，120或 160小时。在优选实施方案中，步骤b)中存在还原剂。本领域技术人员熟知还原剂，例如含 硫醇试剂，例如半胱氨酸或连二亚硫酸盐。起始浓度可以为至少〇. 1，〇. 5,1，2, 5或10 mM。
[0037] 优选的是该方法包含步骤b)之后从混合物中再循环乙醇和/或乙酸。在优选实施 方案中，这意味着移出一部分来自步骤b)的反应混合物，并将其中的乙酸和/或乙醇与形 成的任何C4体分离，随后将用这样的方式获得的乙酸和/或乙醇输送回到反应混合物中。 可以以分批方式或优选以连续方式移出步骤b)中的一部分反应混合物。在后者情况下，可 以在分离步骤之前收集连续移出的反应混合物。
[0038] 本领域技术人员熟知可用来将水溶液中存在的乙酸和/或乙醇与任何丁醇和/或 丁酸分离的方法，例如使用疏水性有机溶剂萃取，蒸馏等。
[0039] 本申请中涉及的任何有机化合物，例如C4体，乙酸，乙醇，丁酸和丁醇包含所关心 的化合物的质子化形式以及该化合物的各种盐。例如，乙酸可以包含乙酸（CH 3-COOH)，还有 乙酸的各种盐，例如乙酸钠（CH3-COCTNa+)，乙酸钾（CH 3-COOTO，乙酸铵（CH3-C00_NH4+)等。
[0040] 在本发明的优选实施方案中，本发明以连续方式进行，其中连续去除用于进行步 骤a)和b)的来自容器的含水溶液，分离成富集C4体，优选丁醇和/或丁酸的级分，和富集 乙酸和/或乙醇的另一个级分，将后一级分加入到用于进行步骤a)和b)的容器中。
[0041] 考虑到一方面产乙酸细菌细胞的需要，另一方面热力学参数的需要，步骤a)和b) 中的温度需要加以选择。现有技术教导大量产乙酸细菌的温度范围和最佳温度。例如， C/iostrit/i應从erffioacetic應可以在高至60°C的温度下培育（Fontaine等，1942)。同 样参见关于可用来生长产乙酸细菌和古细菌细胞的温度的微生物学的标准教科书，例如 Dworkin 等（2006) The Prokaryotes-A Handbook on the Biology of Bacteria，2 卷。在 优选实施方案中，步骤b)中施加的温度为0至100°C，10至80°C，20至60°C和30至45°C。 在优选实施方案中，施加的合成气的压力为0.5至10 bar,更优选为0.8至8 bar,更优选 为1.5至6匕&1~。在另一个优选实施方案中，压力大于1，1.5,2,3,4,5,6,7,8,9，10匕 &1'。在 优选实施方案中，施加的压力超过大气压。在优选实施方案中，如在此表示的，单位"表压" 表示相对于局部常压或环境压力的压力。例如，假设局部大气压为I bar，容器内部的压力 为I. 8 bar,贝Ij表压为0? 8 bar (表压）。
[0042] 本发明的特别的强度是C4体，优选丁醇和/或丁酸的形成不依赖于包含多于两个 碳原子的碳链的有机化合物的大量存在。在优选实施方案中，步骤a)和b)可以在但是并 非必须在没有碳水化合物存在下进行。在优选实施方案中，术语"在没有碳水化合物存在 下"表示按照度优先递增的顺序，碳水化合物的浓度小于5,1，0. 5,0. 1或0. 05% (每体积重 量）。在优选实施方案中，术语"碳水化合物"包含具有至少两个官能团的任何有机化合物， 所述官能团选自羟基、醛或酮基，以及包含五个或更多碳原子的直线碳链。示例性碳水化合 物包含己糖，例如葡萄糖或果糖，戊糖，例如核酮糖，以及包含两个或多个碳水化合物单体 的复糖，例如蔗糖。
[0043] 同样，优选的是按照优先度递增的顺序，合成气提供多于70, 75,80,85,90或95% 的最初存在于步骤a)中的碳。在优选实施方案中，如在此使用的，术语"合成气提供多于 X%的最初存在于步骤a)中的碳"表示反应釜中存在的多于X%的碳原子为一氧化碳或二氧 化碳分子中的碳原子。例如，如果存在9摩尔的二氧化碳，小于1摩尔的甲烷和一些氢气， 但是没有包含至少一个碳原子的其它化合物，则合成气提供多于90%的存在的碳。
[0044] 该方法可以以分批方式进行。如果是这种情况，如在此使用的，在优选实施方案 中，术语"培育混合物…至少X分钟"表示使产乙酸细菌细胞批料在规定的条件下停留X分 钟，所述条件例如存在含水培养基，存在与产乙酸细菌细胞接触的合成气，温度设定，存在 乙醇和/或乙酸等。另外，该方法可以以连续方式进行。如果是这种情况，如在此使用的， 在优选实施方案中，术语"培育混合物…至少X分钟"表示反应物分子，例如氢气分子在容 器中或规定的条件下消耗的平均时间为X分钟。例如，如果气密容器包含10升氢气，以每 分钟1升的流速添加氢气，以及容器构造使得氢气分子可以被认为按照进入的顺序离开该 容器，则消耗的平均时间，即容器中设定条件下培育的氢气分子消耗的时间为10分钟。
[0045] 如果设想大规模方法，可能有利的是以连续方式进行本发明的教导。在优选实施 方案中，如在此使用的，术语"连续方式"表示包含将底物连续进料到生物反应器中和从生 物反应器中移出包含产物的介质的方法。连续方式可以另外包含恒定进料营养物。细胞在 生物反应器中可以生长，可选地，可以限制营养物以使细胞达到静止期，即通过营养物缺乏 来限制生长，但是细胞保留代谢活性并持续转化底物，例如合成气。在优选实施方案中，如 在此使用的，术语"静止期"表示经历这种阶段的细胞是代谢活性的，基本上不增殖。
[0046] 本发明可以使用允许保持厌氧条件的任何种类的容器来进行。如果以小规模进 行，可以使用提供低氧或无氧的气密套（glove)。在大规模下，大容积合成气发酵器呈现更 多的实用性。在优选实施方案中，反应混合物经历恒定搅拌，以确定细胞、营养物、底物和产 物均匀地分布在整个含水培养基中。
[0047] 现有技术分析工具，例如通过定期从反应混合物中取样并对其进行HPLC分析，允 许恒定监测生物反应器中的许多化合物。如果需要，可以在线调节关键的参数，例如pH和 底物和产物的浓度。在优选实施方案中，将恒定监测下的乙醇和丁醇的至少一种的浓度和 水平调节至与使用的产乙酸细菌细胞的生长和催化活性相容的浓度。
[0048] 本发明进一步通过以下附图和非限制实施例来说明，由所述附图和非限制实施例 可以获得本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。
[0049] 图1显示就实施例1中获得的碳含量而言，培养开始和结束时的产物浓度之间的 差异。单位"mm〇lC/l"表示每升中的以mmol计的碳量。
[0050] 图2显示就实施例2中获得的碳含量而言，培养开始和结束时的产物浓度之间的 差异。单位"mm〇lC/l"表示每升中的以mmol计的碳量。
[0051] 图3显示就使用株系的实施例3中获得的碳含量而言，培养 开始和结束时的产物量。
[0052] 图4显示就使用株系扬氏梭菌的实施例3中获得的碳含量而言，培养开始和结束 时的产物浓度之间的差异。
[0053] 实施例1 :在没有或存在乙醇下生产丁酸 使CZo1SiricarAiorit/iraraas DSMZ 15243预培养物在使用丁基隔膜密封的I L厌 氧瓶中生长，所述瓶中包含200 mL的根据Hurst,K. M.和Lewis, R. (2010)，Biochemical Engineering Journal 2010，48，159-165 的改性PETC，由 I g 的酵母提取物，19 g 的MES， 30 mL的无机盐溶液，10 mL的微量元素溶液和10 mL的维生素溶液组成。无机盐溶液每升 包含80 g的NaCl，100 g的氯化铵，10 g的氯化钾，10 g的单磷酸钾，20 g的硫酸镁和4 g的氯化钙。维生素溶液由每升0.01 g的吡哆素，0.005 g的硫胺素，0.005 g的核黄素， 0. 005 g的泛酸钙，0.005 g的硫辛酸（thioctacid)，0.005 g的对氨基苯甲酸，0.005 g的烟 酸，0.005 g的维生素B12,0.002 g的叶酸和0.01 g的MESNA组成。微量元素溶液由每升 2 g的次氮基乙酸，I g的MnSO4,0.8 g的硫酸铁铵，0.2 g的氯化钴，0.2 g的硫酸锌，0.02 g的氯化铜（II)，0. 02 g的氯化镍，0. 02 g的钥酸钠，0. 02 g的Na2SeO4,0. 02的Na2WO4组 成。将pH调节至5. 9。
[0054] 在接种之前，将介质煮沸20分钟，随后用纯氮气冲洗20分钟。随后在121°C热压 处理20分钟，随后冷却，然后以I bar表压，使用包含50%的C0,45%的H2和5%的CO2的工 艺气体充满。随后，将压力调节至0.8 bar表压。
[0055] 同样，在接种之前，在无菌厌氧条件下添加包含各4%的硫酸钠和半胱氨酸盐酸盐 的1.5 mL溶液作为还原剂。
[0056] 培养物在37°C和100 rpm下生长。每72小时将培养物转移至新鲜培养基。
[0057] 为了实验，使用包含95%的CO和5%的CO2的工艺气体以同样的方式制备培养基。 另外，在无菌厌氧条件下添加每升0. 6 g的乙醇至烧瓶的一半。
[0058] 使用来自48小时培养物的10体积％接种物，在无菌厌氧条件下接种该溶液。在 37°C以100 rpm摇振烧瓶160小时。在实验开始和结尾时测定干燥生物质和产品浓度。
[0059] 使用HPLC测定乙酸，乙醇，丁酸和丁醇的浓度。Aminex HPX-87H塔用作固定相。 以0.6 mL/min的恒定流速将5 mM硫酸用作洗脱剂。塔的温度为40°C。使用折射率测试仪 检测乙醇和丁醇。在210 nm波长下使用二极管阵列测试仪，检测乙酸和丁酸。使用限定浓 度下的各个化合物的校准曲线图，通过峰的积分计算化合物的浓度。
[0060] 图1显示就碳含量而言，培养开始和结尾时的产物浓度之间的差值。
[0061] 与在没有乙醇存在下形成97. 17 mmolC/L乙酸相比，在乙醇存在下，形成105 nmolC/L的乙酸。当使用相同量的干燥生物质，更具体地为480 mg/L的生物质时，与在没有 乙醇存在下，形成13. 57 mmolC/L 丁酸相比，在乙醇存在下形成22.06 mmolC/L 丁酸。
[0062] 总之，添加乙醇导致形成的丁酸量显著增加。
[0063] 实施例2 :在没有或存在乙酸下生产丁酸 如实施例1所述进行实验规程，除了将2 g/L乙酸加入到烧瓶的一半，代替0.6 g/L的 乙醇，以及使用的合成气批料包含50%的一氧化碳和50%的氢气。
[0064] 图2显示就碳含量而言，培养开始和结尾时的产物浓度之间的差值。与在没有乙 酸存在下形成26, 43 mmolC/L的丁酸相比，在乙酸存在下形成42, 13 nmolC/L的丁酸。
[0065] 总之，添加乙酸也导致形成的丁酸量增加。
[0066] 实施例3 :使用替代的株系和气体混合物，在乙酸或乙醇存在下生产丁酸 使用的培养基和溶液： 改良的ATCC 1754 (PETC最低限度培养基）
【权利要求】
1. 一种生产C4体，优选丁酸和/或丁醇的方法，包含以下步骤： a) 在厌氧条件和优选在没有碳水化合物存在下，使含水培养基中的产乙酸细菌细胞 与合成气接触， b) 将步骤a)中获得的混合物在0至100°C之间的温度下培育至少30分钟， 其中在步骤b)中，所述含水培养基包含至少0.1 g Γ1的总组合浓度的乙醇和/或乙 酸。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述乙醇和/或乙酸为外源性产生的乙醇和/或乙酸。
3. 根据权利要求1至2中任一项的方法，其中所述乙醇和/或乙酸的总组合浓度为0. 5 g 至 20 g I71。
4. 根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述合成气包含40%至100%，优选40% 至95%的CO。
5. 根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述合成气包含小于10%的C02。
6. 根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述合成气包含小于10%的CO。
7. 根据权利要求1至6中任一项的方法，其中所述方法包含以下步骤： c) 步骤b)之后从所述混合物中分离和任选再循环乙醇和/或乙酸。
8. 根据权利要求1至7中任一项的方法，其中所述产乙酸细菌细胞选自梭菌 (C/iosirii/itt?)，穆尔氏菌（M9〇re77a)和一氧化碳嗜热菌（CkrAojyiAe/SMAs)，且优选为 Cl os tri di um car box i di vorans 〇
9. 根据权利要求1至8中任一项的方法，其中步骤a)和b)中的pH保持在3至7之 间，优选4至6,更优选5至5. 5。
10. 根据权利要求1至9中任一项的方法，其中步骤b)在15°C至45°C之间的温度，优 选30°C至40°C下进行。
11. 根据权利要求1至10中任一项的方法，其中所述合成气提供大于80%，优选大于 90%的最初在步骤a)中存在的碳。
12. 根据权利要求1至11中任一项的方法，其中所述方法以连续方式进行。
13. 根据权利要求1至12中任一项的方法，其中步骤b)在没有碳水化合物存在下进 行。
14. 乙醇和/或乙酸的用途，其用于增加由厌氧条件下含水培养基中的产乙酸细菌细 胞转化的合成气对C4体，优选丁酸和/或丁醇的比例。
15. 根据权利要求14的用途，其中所述乙醇和/或乙酸是外源性产生的乙醇和/或乙 酸，并且优选在聚集可检测量的由所述细胞外源性产生的乙醇和/或乙酸之前，加入到含 水培养基中。
16. 根据权利要求14至15中任一项的用途，其中所述乙酸和/或乙醇以0.5至5 g Γ1 的总组合浓度存在于包含产乙酸细菌细胞的含水培养基中。
17. 根据权利要求14至16中任一项的用途，其中所述产乙酸细菌细胞选自梭菌，穆尔 氏菌和一氧化碳嗜热菌，且优选为carAiorii/irarafls。
【文档编号】C12P7/16GK104302778SQ201380010630
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年2月22日 优先权日:2012年2月22日
【发明者】Y.席曼, L.赖内克, T.哈斯, D.沃伊斯特-博茨, H.克里斯平 申请人:赢创工业集团股份有限公司