抗siglec-15抗体的制作方法

抗siglec-15抗体的制作方法
【专利摘要】在此描述了特异性地结合Siglec-15的抗体和抗原结合片段。这些抗体或抗原结合片段可具有抑制破骨细胞分化的能力和/或抑制破骨细胞骨再吸收活性的能力。还特此披露了组合物和表达抗Siglec-15抗体或抗原结合片段的细胞。抗Siglec-15抗体还可有用于治疗骨丢失或骨疾病。还描述了用于检测或诊断骨丢失或骨相关疾病的方法。
【专利说明】抗SIGLEC-15抗体 发明领域
[0001] 本发明涉及特异性结合Siglec-15的抗体及其抗原结合片段。本发明具体地涉及 适用于向人给药的抗Siglec-15抗体和/或包含人IgGl恒定区的氨基酸的抗Siglec-15 抗体。本发明还涉及抗Siglec-15抗体用于治疗和/或诊断疾病或病状的用途。
[0002] 本发明的这些抗体可例如用来抑制Siglec-15的活性或功能或将治疗剂递送至 表达该蛋白质的细胞。
[0003] 发明背景
[0004] 骨是一种动态结缔组织，该动态结缔组织是由支持骨的结构、机械和生物化学完 整性和人体矿物质体内平衡所需要的功能相异细胞群体构成。所涉及的主要细胞类型包括 负责骨形成和维持骨质量的成骨细胞和负责骨再吸收的破骨细胞。成骨细胞和破骨细胞在 称为骨重建的动态过程中起作用。这些细胞从它们祖先的发育和增殖是由在骨微环境中产 生的生长因子和细胞因子的网络以及由全身性激素来管控。骨重建贯穿个体一生来进行并 且是维持健康骨组织和矿物质体内平衡所必需的。该过程在很大程度上保持平衡并且通过 全身性激素、肽和下游信号传导途径蛋白、局部转录因子、细胞因子、生长因子以及基质重 建基因的复杂相互作用来管控。
[0005] 在骨重建过程中出现的干扰或不平衡可以产生骨骼疾病，其中最常见骨骼病症的 特征在于骨质量的净减少。此骨质量减少的主要原因是破骨细胞数量和/或活性增加。最 常见的此种疾病（并且也许是最著名的）是特别地在开始绝经后的妇女中发生的骨质疏松 症。事实上，骨质疏松症是中年后期和老年妇女中骨骼骨折的最重要根本原因。虽然雌激 素缺乏被强烈地提示是绝经后骨质疏松症的一个因素，但是存在长期的证据证明重建是发 生在整个骨骼的不连续块中的局部控制过程，如由Frost(弗若斯特）四十多年前首次描述 (弗若斯特H.M. 1%4)。
[0006] 因为骨重建发生在不连续块中，对骨再吸收和正常重建过程的起始而言局部产生 的激素和酶可比全身性激素更为重要。此种局部控制是由其中它们运行的微环境中的成 骨细胞和破骨细胞来介导。例如，破骨细胞附着至骨基质并且在自身与骨表面之间形成一 个单独的区室，该区室是由环绕皱褶缘的肌动蛋白环形成的一个缝合区来界定的。多个小 囊泡将酶朝向该骨基质输送并且使部分消化的骨基质内化。该缝合区内的微环境富含溶酶 体酶的存在并且与身体的正常生理pH相比是高度酸性的。皱褶缘膜还表达RANKL的受体 RANK和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)受体，这两种受体均负责破骨细胞分化；以及能够 使该破骨细胞快速灭活的降钙素受体（Baron，R.(巴雄，R) 2003)。
[0007] 在抑制和刺激的一种复杂模式下，生长激素、胰岛素样生长因子-1、性类固醇、甲 状腺激素、趋興激素（calciotrophichormone)如PTH和前列腺素E2、不同细胞因子，如 白细胞介素-1 0、白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-a以及1，25-二羟基维生素D(骨化 三醇）共同在该骨重建过程中起作用（Jilka(吉卡）等人1992;Poli(波利）等人1994 ; Srivastava(斯里兰卡）等人 1998;deVemejoul(德唯米焦）1996)。
[0008] 因此，毫无疑问由这些特化细胞形成的独特局部环境是由于不在其他组织中表达 的独特基因序列和/或在其他组织中表达的多核苷酸和多肽的剪接变体的表达。对破骨细 胞活性有特异性的多核苷酸、多肽以及它们的变体和衍生物的分离和鉴定可容许更清楚地 理解该重建过程并且为治疗与骨重建相关的疾病状态提供组织特异性治疗靶标。
[0009] 对与骨重建相关的许多疾病是理解甚少的、通常不可治疗的或仅可治疗到有限的 程度。例如，骨关节炎难以治疗，因为不存在集中于减轻疼痛并且预防受伤关节变形的治愈 和治疗方法。非类固醇抗炎药（NSAID)通常被用来减轻疼痛。
[0010] 另一个实例是骨质疏松症，其中目前仅有的被FDA批准在美国使用的药剂是预防 骨损坏的抗再吸收剂。雌激素替代疗法是抗再吸收剂的一个实例。其他实例包括阿仑膦酸 盐（alendronate)(福善美（Fosamax)-二膦酸盐抗再吸收剂）、利塞膦酸盐（risedronate) (安妥良（Actonel)-双膦酸盐抗再吸收剂）、雷洛昔芬（raloxifene)(易维特（Evista)-选 择性雌激素受体调节剂（SERM))、降钙素（鲑鱼降钙素（Calcimar)-激素）以及甲状旁腺激 素/特立帕肽（teriparatide)(骨稳（Forteo)-人激素甲状旁腺激素的合成版，该激素帮 助调节钙代谢）。
[0011] 双膦酸盐如阿仑膦酸盐和利塞膦酸盐永久结合骨的表面并且干扰破骨细胞活性。 这允许这些成骨细胞超过再吸收的速率。最常见的副作用是恶心、腹痛和松散的肠运动。 然而，据报道阿仑膦酸盐还引起食道刺激和炎症，并且在一些情况下引起食道溃疡。利塞膦 酸盐与阿仑膦酸盐在化学上不同并且具有较小的引起食道刺激的可能性。然而，某些食物、 钙、铁补充剂、维生素和矿物质或含钙、镁或铝的抗酸剂可减少利塞膦酸盐的吸收，从而导 致失去有效性。
[0012] 雷洛昔芬和其他SERMS(如他莫昔芬（Tamoxifen))的最常见副作用是热潮红。然 而，已显示雷洛昔芬和其他激素替代疗法可增加血凝块的风险，包括深静脉血栓形成和肺 栓塞、心血管疾病和癌症。
[0013] 降钙素在增加骨密度和加强骨方面不如雌激素和其他抗再吸收剂有效。注射型或 鼻用喷雾降钙素的常见副作用是恶心和面红。患者可以发展鼻腔刺激、流鼻涕或鼻出血。可 注射降钙素可以引起注射部位处局部皮肤发红、皮疹和面红。
[0014] 展示涉及骨重建的若干病症或疾病状态之间联系的情况是使用FDA首次批准治 疗佩吉特氏病（Paget'sdisease)的依替膦酸盐（乙哚乙酸二钠（Didronel))。佩吉特 氏病是特征在于无序且加速的重建骨从而导致骨虚弱和疼痛的一种骨疾病。乙哚乙酸二 钠已按'超说明书用药（off-label)'使用并且在一些研究中显示可增加患有已建立的骨 质疏松症的绝经后妇女的骨密度。还发现它有效于预防需要长期类固醇药剂（如泼尼松 (Prednisone)或可的松（Cortisone))的患者中的骨丢失。然而，高剂量乙哚乙酸二钠或连 续使用乙哚乙酸二钠可以引起称为骨软化症的另一种骨疾病。像骨质疏松症一样，骨软化 症可以导致弱骨，骨折的风险增加。因为骨软化症问题和尚且缺乏关于减小骨骨折速率的 足够研究，美国FDA尚没有批准将乙哚乙酸二钠用于治疗骨质疏松症。
[0015] 骨质疏松症疗法主要集中于减小骨丢失速率的抗再吸收药物，但新兴疗法在增加 骨矿物质密度而不是仅维持它或减缓它的恶化方面显示出前景。骨质疏松症的早期管道主 要由新治疗类别中的候选药物组成，具体是组织蛋白酶K抑制剂、骨保护素和钙阻滞剂以 及新型双膦酸盐。这些药物中的一些是其中基于更深刻地理解骨生物学来开发利用基因组 程序的新型药物并且从长期来看具有改变骨病症治疗面貌的潜力的实例。
[0016] 本发明具体地涉及适用于向人给药的抗Siglec-15抗体。本发明还具体地涉及包 含人IgGl恒定区的氨基酸的抗Siglec-15抗体（例如，包括人源化抗体、嵌合抗体或非人 源化抗体）。在一些情况下，本发明的抗体和抗原结合片段可以结合对人Siglec-15蛋白独 特并且不存在于其他物种的相应Siglec-15蛋白中（例如，不存在于Siglec-15直向同源 物或假定直向同源物中）的一个表位。在其他情况下，本发明的抗体和抗原结合片段可以 结合对人Siglec-15蛋白和小鼠Siglec-15蛋白共同的一个表位。而在其他情况下，本发 明的抗体和抗原结合片段可以结合对人Siglec-15和其他直向同源物或假定直向同源物 共同的一个表位（参见例如，Angata(安格塔）等人，2007)。
[0017] 本发明描述了特异于Siglec-15的抗体用于诊断、预后和治疗（包括预防）癌症 或骨丢失（例如，与骨相关疾病相关联或与破骨细胞分化或活性增加相关联的严重或过度 骨丢失）的用途。具体地说，本发明涉及抗Siglec-15抗体用于抑制破骨细胞的分化和/ 或用于抑制骨再吸收的用途。本发明还涉及这些抗体用于诊断、预防和治疗其中破骨细胞 活性增加的其他不同类型疾病的用途。
[0018] 唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglec)是具有与唾液酸相互作用能力的免疫 球蛋白（Ig)超家族的成员（McMillan(麦克米伦）和Crocker(克洛克尔），2008;克洛克 尔等人，2007)。有若干Siglec族成员均共享特定的结构特征，具体地说，显现出一个结合 唾液酸的氨基末端V-组Ig结构域和一个可变数量的C2-组Ig结构域。这些膜受体通常 以高度特异性方式表达并且许多这些家族成员在造血细胞中表达（麦克米伦和克洛克尔， 2008)。这些蛋白质被认为促进细胞-细胞相互作用、介导信号传导并且通过识别聚糖来调 节免疫功能（克洛克尔等人，2007)。唾液酸是典型地位于细胞表面上的复合糖缀合物末端 处的九碳糖。它们可以附着至各种各样的蛋白质和脂质上（麦克米伦和克洛克尔，2008)。
[0019]Siglec-15是最近描述的与Siglec-14具有高同源性的Siglec家族成员之一（安 格塔等人，2007)。这些作者报道该Siglec-15优先结合唾液酸Tn(sialylTn)结构并且它 与DAP12和DAP10相互作用。这些相互作用的功能意义尚不可知，但是已提出Siglec-15 可能具有一种激活功能（安格塔等人，2007)。尽管对Siglec-15在哺乳动物中的潜在作 用有了这些初步了解，但是当将其序列鉴定为用于发现新型破骨细胞分化调节剂的筛选的 一部分时，才促成了在理解该蛋白质的生物功能方面的重要进展（Sooknanan(苏库兰）等 人2007)。在此专利申请中，显示出在破骨细胞生成的一个小鼠模型中由RNA干扰引起的 Siglec-15转录物削减导致了响应于RANKL治疗的前体分化的明显减少。在人破骨细胞中 发现类似结果。此外，在此披露中呈现的这些研究还显示，在细胞膜处的Siglec-15定位是 它在破骨细胞分化中的功能所必需的。此外，一个最近出版物显示在表面糖缀合物的末端 处存在唾液酸是适当破骨细胞分化所需要的并且可能对破骨细胞前体细胞的融合是重要 的（Takahata(高畑）等人，2007)。这个最近的观察结果在唾液酸结合与Siglec-15在分 化破骨细胞中的表达之间建立了一种直接的功能联系，并且强烈表明Siglec-15在破骨细 胞前体的早期分化程序中起作用。
[0020] 因此，Siglec-15的表达谱、它在破骨细胞分化过程中的强可诱导性、它在膜表面 处的定位以及它的结构特征均有助于用单克隆抗体靶向细胞表面处的这种蛋白质的可行 性。祀向破骨细胞的基于单克隆抗体的疗法的仅其他实例是地诺单抗（denosumab)，一种特 异于RANKL的人单克隆抗体（Ellis(埃利斯）等人2008)。本发明涉及抗Siglec-15抗体 或抗原结合片段作为破骨细胞分化和/或骨再吸收的阻断剂在检测或治疗骨丢失中的用 途，尤其是在骨相关的疾病背景下或在增加的破骨细胞分化或活性的背景下。本发明还涉 及抗体或抗原结合片段在检测或治疗癌症中的用途。
[0021] 发明概述
[0022] 本发明涉及有用于治疗（包括预防）、检测和诊断骨丢失或癌症的抗体和抗原结 合片段以及试剂盒。具体地涵盖人源化的抗Siglec-15抗体。
[0023] 本发明的抗体或抗原结合片段可有用于治疗骨丢失或骨再吸收。
[0024] 这些抗体和抗原结合片段还可具体地有用于检测分化的破骨细胞或正经历分化 的破骨细胞。这些抗体和抗原结合片段可另外有用于检测和诊断骨丢失。本发明的抗体或 抗原结合片段还可有用于治疗骨丢失。
[0025] 这些抗体和抗原结合片段还可具体地有用于检测或诊断表达Siglec-15的癌细 胞以及具体地具有Siglec-15高表达的癌症。这些抗体和抗原结合片段可进一步具体地有 用于检测卵巢癌、肾癌、中枢神经系统癌症、前列腺癌、黑素瘤、乳癌、肺癌或结肠癌。本发明 的抗体或抗原结合片段可进一步有用于治疗卵巢癌、肾癌、中枢神经系统癌症、前列腺癌、 黑素瘤、乳癌、肺癌或结肠癌。
[0026] 本发明的抗体或抗原结合片段可结合Siglec-15(SEQIDN0. : 2)的氨基酸20至 259或一种Siglec-15变体（例如，与SEQIDN0. : 12具有至少80%序列一致性的变体， 包括例如SEQIDN0. :4)的相应区。更具体地说，本发明的抗体或抗原结合片段可结合 Siglec-15(SEQIDN0.: 2)的氨基酸 49 至 165 或一种Siglec-15 变体（例如，与SEQID NO. : 12具有至少80%序列一致性的变体，包括例如SEQIDNO. :4)的相应区。本发明的抗 体或抗原结合片段包括可结合对人Siglec-15独特的一个表位的那些，该表位包括例如包 含位于SEQIDN0. :2的位置99上的精氨酸（R99)的一个表位。
[0027] 该抗体或抗原结合片段可能够抑制该多肽的破骨细胞分化活性和/或骨再吸收。
[0028] 在此应理解，相比小鼠Siglec-15更优选结合人Siglec-15的抗体可在抑制人破 骨细胞的分化或活性上比抑制小鼠破骨细胞更有效。结合存在于人Siglec-15中而不存在 于小鼠Siglec-15中的一个表位的抗体可抑制人破骨细胞的分化或活性而不抑制小鼠破 骨细胞的分化或活性。食蟹猴的Siglec-15蛋白与人Siglec-15氨基酸的Siglec-15蛋白 是非常类似的。因此可在猴中或使用分离自猴的细胞来测试抗Siglec-15抗体的效力。因 此，可取决于该抗体的特异性（例如，针对人、猴和/或小鼠Siglec-15)改编效力测定。
[0029] 根据本发明的一个实施例，该抗体或抗原结合片段可干扰该多肽促进破骨细胞分 化和/或骨再吸收的能力。根据本发明的另一个实施例，该抗体或抗原结合片段可干扰该 多肽促进肿瘤生长的能力。
[0030] 本发明的抗体或抗原结合片段可能够干扰（抑制）破骨细胞前体细胞分化成分化 的破骨细胞。
[0031] 根据本发明，该抗体或抗原结合片段可以是例如一种多克隆抗体、一种单克隆抗 体、一种嵌合抗体、一种人源化抗体、一种人抗体、一种杂交抗体或其一种片段。
[0032] 本发明涵盖的抗体的具体实例包括以下这类抗体：具有包含一个人源化的可变结 构域的至少一个免疫球蛋白链（轻链或重链），而其他可变结构域可以是非人源化的（例 如，小鼠可变结构域），从而产生一种杂交抗体。本发明涵盖的抗体的其他实例包括具有包 含一个人源化的可变结构域的重链和轻链免疫球蛋白链的抗体。
[0033] 本发明的其他具体实施例包括一种人源化抗体，其中已经再引入非人氨基酸（例 如，来自小鼠抗体配对物的一种或多种氨基酸）。
[0034] 因此，本发明提供一种能够特异性结合Siglec-15的非人亲本抗体（例如，小鼠抗 体）的人源化抗体。
[0035] 在一个实施例中，杂交抗体或其片段可例如包含一种非人抗体的一个轻链可变区 和一种人源化抗体的一个重链可变区。
[0036] 在另一个实施例中，杂交抗体或其片段可例如包含一种非人抗体的一个重链可变 区和一种人源化抗体的一个轻链可变区。
[0037] 本发明的人源化抗体或杂交抗体可包含一个重链可变区，该重链可变区可包括一 种天然人抗体的非人互补决定区氨基酸残基和人框架区氨基酸残基；以及一个互补轻链。
[0038] 本发明的人源化抗体或杂交抗体可包含一个轻链可变区，该轻链可变区可包括一 种天然人抗体的非人互补决定区氨基酸残基和人框架区氨基酸残基；以及一个互补重链。
[0039] 术语"杂交抗体"是指包含至少一个人源化或人重链或轻链可变区（对Siglec-15 具有亲和力）和至少一个非人重链或轻链可变区（例如来自小鼠、大鼠、兔）的抗体。
[0040] 被选择用于人源化非人亲本抗体的天然人抗体可包含一个可变区，该可变区具有 与该非人亲本抗体的一个（建模的）可变区类似（可重叠）的三维结构。因此，该人源化 抗体或杂交抗体在具有与该非人亲本抗体类似的三维结构方面有较大的机会。
[0041] 根据本发明，该人源化抗体或杂交抗体轻链的这些人框架区氨基酸残基是来自一 个天然人抗体轻链框架区。被选择用于人源化目的的该天然人抗体的轻链框架区可例如与 该非人亲本抗体的一个轻链框架区具有至少70%-致性。优选地，被选择用于人源化目的 的该天然人抗体可在它的轻链互补决定区中具有与该非人亲本抗体的一个轻链互补决定 区相同数量或大致上相同数量的氨基酸。
[0042] 在本发明的其他实施例中，该人源化抗体或杂交抗体轻链的这些人框架区氨基酸 残基是来自一个天然人抗体轻链框架区，该天然人抗体轻链框架区与该非人亲本抗体的该 轻链框架区具有至少70%、75%、80%、85%-致性（或更多）。
[0043] 还根据本发明，该人源化抗体或杂交抗体重链的这些人框架区氨基酸残基是来自 一个天然人抗体重链框架区，该天然人抗体重链框架区与该非人亲本抗体的一个重链框架 区具有至少70 %-致性。优选地，被选择用于人源化目的的该天然人抗体可在它的重链互 补决定区中具有与该非人亲本抗体的一个重链互补决定区相同数量或大致上相同数量的 氨基酸。
[0044] 在本发明的其他实施例中，该人源化抗体或杂交抗体重链的这些人框架区氨基酸 残基是来自一个天然人抗体重链框架区，该天然人抗体重链框架区与该非人亲本抗体的该 重链框架区具有至少70 %、75 %、80 %、85 % -致性。
[0045] 在本发明的一个实施例中，该人源化抗体或杂交抗体的该重链可变区可因此包含 至少一个非人互补决定区。
[0046] 可替代地，在本发明的其他实施例中，该人源化抗体或杂交抗体的该重链可变区 可包含至少两个非人互补决定区或甚至三个非人互补决定区。
[0047] 在本发明的一个另外实施例中，该轻链可变区可包含至少一个非人互补决定区。
[0048] 可替代地，在本发明的又另外实施例中，该轻链可变区包含至少两个非人互补决 定区或甚至三个非人互补决定区。
[0049] 因此，该人源化抗体可有利地包含该非人抗体的所有六个CDR。在二价人源化抗体 的情况下，所有十二个CDR均可来自该非人抗体。
[0050] 恒定区或其片段可来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4并且尤其来自人IgGl、IgG2、IgG3 或IgG4。在一个更具体的实施例中，该恒定区可来自IgG2(例如，人IgG2)。在一个优选实 施例中，该恒定区可来自IgGl(例如，人IgGl)。
[0051] 该轻链的恒定区可以是A恒定区或k恒定区。
[0052] 可特别有用的抗原结合片段包括例如FV(scFv)、Fab、Fab'或（Fab'）2。
[0053] 该抗体或抗原结合片段可在或从一种分离的哺乳动物细胞（除了杂交瘤细胞以 夕卜）中产生或在一种杂交瘤细胞中产生。分离的哺乳动物细胞的一个示例性实施例是人细 胞。
[0054] 在本发明的一个方面中，本发明的抗体或抗原结合片段可干扰（抑制）人破骨细 胞前体细胞分化成分化的人破骨细胞。
[0055] 在一个示例性实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段可干扰（抑制）原代人破 骨细胞前体细胞分化成分化的人破骨细胞。
[0056] 本发明的抗体和抗原结合片段还可用来通常祀向表达或过度表达Siglec-15的 细胞，包括骨细胞和乳癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌和肾癌细胞以及黑素瘤细胞和中 枢神经系统的癌细胞。
[0057] 更具体地说，这些抗体和抗原结合片段可用来靶向正经历分化的破骨细胞。
[0058] 本发明在其一个方面中提供一种可能够特异性结合SEQIDN0:2的抗体或抗原结 合片段（例如，分离的或大致上纯化的）。
[0059] 因此，本发明涵盖对SEQIDN0:2具有特异性的诊断性和/或治疗性抗体或抗原 结合片段。本发明还涵盖与本发明的抗体具有相同表位特异性的抗体或抗原结合片段。一 种候选抗体可通过确定它是否将结合在此描述的这些抗体所结合的表位和/或通过执行 与已知结合该表位的抗体或抗原结合片段的竞争测定来进行鉴定。
[0060] 因此，在另一方面本发明提供一种能够与在此描述的该抗体或抗原结合片段竞争 的分离的抗体或抗原结合片段。
[0061] 在另外方面中，本发明提供使用本发明的抗体或抗原结合片段治疗的方法和检测 的方法。
[0062] 术语"抗体"指完整抗体、单克隆抗体或多克隆抗体。术语"抗体"还涵盖多特异 性抗体如双特异性抗体。人抗体通常由各自包含可变区和恒定区的两条轻链和两条重链构 成。该轻链可变区包含3个⑶R，它们在此鉴定为由框架区侧接的⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3。 该重链可变区包含3个⑶R，它们在此鉴定为由框架区侧接的⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3。
[0063] 如在此所用，术语"抗原结合片段"是指保留结合抗原（例如，SEQIDN0:2或其变 体）的能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可以由完整抗体的片段 执行。涵盖于术语抗体的"抗原结合片段"内的结合片段的实例包括（i)Fab片段，一种由 \、VH、和CH1结构域组成的单价片段；（ii)F(ab'）2片段，一种包含由二硫桥联在铰链区连接 的两个Fab片段的双价片段；（iii)由V#PCH1结构域组成的Fd片段；（iv)由抗体单臂的 和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段（Ward(沃德）等人，（1989)Nature(自然）341:544-546);以及（vi)分离的互补决定区（CDR)，例如VHCDR3。另外，虽 然Fv片段的两个结构域 '和V独立基因编码，但是使用重组方法，可以将它们通过能够 使这两个结构域形成为单条多肽链的合成性接头连接，在该单条多肽链中 '区和VH区配 对以形成单价分子（称作单链Fv(scFv);参见例如Bird(布德）等人（1988)Science(科 学）242:423-426 ;和Huston(休斯顿）等人（1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院 院报）85:5879-5883)。这类单链抗体也意在涵盖于术语抗体的"抗原结合片段"内。此外， 这些抗原结合片段包括结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，这些蛋白包括：（i)融合至免疫 球蛋白铰链区多肽的结合结构域多肽（如重链可变区、轻链可变区、或经过接头肽融合至 轻链可变区的重链可变区融合至铰链区的免疫球蛋白重链CH2恒定区、以及（iii) 融合至CH2恒定区的免疫球蛋白重链CH3恒定区。可通过用丝氨酸残基替代一个或多个半 胱氨酸残基来修饰该铰链区，以便防止二聚化。这类结合结构域免疫球蛋白融合蛋白进一 步披露于US2003/0118592和US2003/0133939中。使用本领域技术人员已知的常规技术 获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式针对有用性来筛选这些片段。
[0064] 典型的抗原结合位点由可变区组成，这些可变区是由一个轻链免疫球蛋白和一个 重链免疫球蛋白的配对形成。这些抗体可变区的结构是非常一致的并且显示非常相似的结 构。这些可变区典型地由相对同源的以称作互补决定区（CDR)的3个高变区间插的框架区 (FR)组成。抗原结合片段的总体结合活性经常由⑶R的序列决定。这些FR经常在⑶R的 三个维度的正确定位和对齐方面起作用以获得最佳抗原结合。
[0065] 本发明的抗体和/或抗原结合片段可源自例如小鼠、大鼠或任何其他哺乳动物或 源自其他来源，如通过重组DNA技术。
[0066] 这些抗体或抗原结合片段可在骨丢失治疗上具有治疗用途。
[0067]激素消融疗法（用停止特定激素产生的药物治疗）由于骨丢失而增加骨折的风 险。用于患有乳癌的妇女的辅助激素疗法涉及抗雌激素药（例如，他莫昔芬）和芳香酶抑 制剂，已显示这些抗雌激素药和芳香酶抑制剂由于雌激素压制而加速骨丢失并且增加骨折 风险。另外，许多患前列腺癌的男性在他们的癌症进展时使用雄激素剥夺疗法（ADT)(例 如，促性腺激素释放激素[GnRH]激动剂）进行治疗。GnRH激动剂抑制睾酮产生，所述睾酮 充当前列腺癌细胞的生长因子。然而，这种治疗也导致骨质量减小，从而由于骨质疏松症而 增加骨折的风险。因此，本发明的抗体或抗原结合片段可在与癌症治疗相关联的骨丢失的 治疗上具有治疗用途。
[0068] 这些抗体或抗原结合片段还可在癌症治疗上具有治疗用途。在一个示例性实施例 中，这些抗体或片段可在癌症治疗诱导的骨丢失上具有治疗用途。在另一个示例性实施例 中，这些抗体或片段可在与骨疾病相关联的骨丢失上具有治疗用途，这些骨疾病例如为其 中存在破骨细胞的骨降解活性增加的病状。在某些情况下，这些抗体或抗原结合片段可与 表达SEQIDN0:2的细胞相互作用并且通过介导ADCC诱导免疫反应。在其他情况下，这些 抗体和片段可阻断SEQIDN0:2与它天然配体的相互相用。在又其他情况下，这些抗体和 片段可诱导该蛋白质的内化和/或该蛋白质的降解。
[0069] 本发明的抗体或抗原结合片段可与另一种药物一起（例如，同时、依次）给药，该 另一种药物有用于治疗骨丢失、骨再吸收或有用于治疗与骨丢失或骨再吸收相关联的疾 病。
[0070] 能够抑制骨丢失的抗体和抗原结合片段已描述于在2011年4月14日的TO 2011/041894下公开的国际申请号PCT/CA2010/001586和在2007年2月13日的TO 2007/093042下公开的PCT/CA2007/000210,这些专利的全部内容通过引用结合在此。
[0071] 抗体缀合物
[0072] 虽然并不总是必需的，但是出于检测或治疗目的，本发明的抗体或抗原结合片段 可与一个可检测部分（即出于检测或诊断目的）或与一个治疗性部分（出于治疗目的）缀 合。
[0073] 出于检测目的，一个未缀合的抗体（初级抗体）可用于结合抗原并且可添加带有 一个可检测部分并能够结合该初级抗体的二级抗体。然而，如上所指示，该抗SIGLEC15抗 体可与一个可检测标记缀合并且因此二级抗体可以不是必需的。
[0074] "可检测部分"是通过光谱的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、化学的和/或 其他物理学手段可检测的部分。可检测部分可使用本领域中众所周知的方法与本发明的抗 体及其抗原结合片段直接和/或间接（例如经过键联，如不限于D0TA或NHS键联）偶联。 可使用各种各样的可检测部分，其中该选择取决于所需要的灵敏度、缀合简易性、稳定性需 求以及可获得的仪器。适合的可检测部分包括但不限于荧光标记、放射性标记（例如不限 于 1251、In111、Tc99、I131以及包括用于PET扫描仪的正电子发射同位素等）、核磁共振活性标 记、发光标记、化学发光标记、发色团标记、酶标记（例如并且不限于辣根过氧化物酶、碱性 磷酸酶等）、量子点和/或纳米颗粒。可检测部分可引起和/或产生可检测信号，从而允许 检测到来自该可检测部分的信号。
[0075] 在本发明的另一个示例性实施例中，该抗体或其抗原结合片段可与一个治疗性部 分（例如药物、细胞毒性部分）偶联（修饰）。
[0076] 在一些情况下，出于治疗目的，一个未缀合的抗体可本身能够螯合抗原，可阻断该 抗原与另一个结合配偶体之间的重要相互作用，可募集效应子细胞等。然而，如上所指示， 该抗体可与一个治疗性部分缀合。
[0077] 在一个示例性实施例中，这些抗体和抗原结合片段可包含一种化学治疗剂或细胞 毒性剂。例如，这些抗体和抗原结合片段可缀合至该化学治疗剂或细胞毒性剂。此类化 学治疗剂或细胞毒性剂包括但不限于钇-90、钪-47、铼-186、碘-131、碘-125以及本领 域技术人员所认可的许多其他化学治疗剂或细胞毒性剂（例如镥（例如Lu177)、铋（例如 Bi213)、铜（例如Cu67))。在其他情况下，该化学治疗剂或细胞毒性剂可包含特别是本领域技 术人员所已知的5-氟尿啼陡、阿霉素（adriamycin)、伊立替康（irinotecan)、奥利他汀类 (auristatins)、紫杉烧类（taxanes)、假单胞菌内毒素（pseudomonasendotoxin)、菌麻毒 素（ricin)、卡奇霉素（calicheamicin)以及其他毒素。示例性细胞毒性剂可具体包含能够 杀死非增殖细胞的一种药剂（agent)。
[0078] 本发明的抗体或抗原结合片段可尤其与靶向DNA的药剂缀合。靶向DNA的药剂 的示例性实施例包括例如烧化剂如多卡米星（duocarmycin)和多卡米星衍生物，如阿多来 新（adozelesin)、比折来新（bizelesin)、卡折来新（carzelesin)等。革巴向DNA的药剂的 其他示例性实施例包括例如卡奇霉素、埃斯波霉素（esperamicin)和衍生物（参见例如 披露于美国专利号 5, 264, 586、5, 108, 192、4, 970, 198、5, 037, 651、5, 079, 233、4, 675, 187、 4, 539, 203、4, 554, 162、4, 837, 206和US2007213511中的化合物，每个文件的全部内容通 过引用结合在此）。
[0079] 本发明的一个具体实施例包括例如与多卡米星缀合的在此披露的抗体或抗原结 合片段。本发明的另一个具体实施例包括例如与卡奇霉素缀合的在此披露的抗体或抗原结 合片段。
[0080] 可替代地，为了进行本发明的方法，并且如在本领域中所知，可将本发明的抗体或 抗原结合片段（缀合的或未缀合的）与一种第二分子（例如，二级抗体等）组合使用，该第 二分子能够特异性地结合本发明的抗体或抗原结合片段并且可带有一个所希望的可检测 的、诊断性或治疗性的部分。
[0081] 抗体的药物鉬合物及其用涂
[0082] 本发明还涵盖这些抗体（缀合的或未缀合的）的药物组合物。该药物组合物可包 含一种抗体或一种抗原结合片段并且还可含有一种药学上可接受的载体。
[0083] 本发明的其他方面涉及一种组合物，该组合物可包含在此描述的该抗体或抗原结 合片段以及一种载体。
[0084] 本发明的又其他方面涉及在此描述的该分离的抗体或抗原结合片段在治疗或诊 断骨疾病或癌症中的用途。
[0085] 除了活性成分之外，药物组合物可含有药学上可接受的载体（这些载体包括水、 PBS、盐溶液、明胶、油、醇类）以及促进活性化合物加工成药学上可使用的制剂的其他赋形 剂和助剂。在其他情况下，此类制剂可以是灭菌的。
[0086] 如在此所使用，"药物组合物"通常包含治疗有效量的药剂连同药学上可接受的 稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。如在此所使用的"治疗有效量"是指对 于给定病状和给药方案而言提供治疗效果的量。此类组合物是液体或冻干的或以另外的 方式干燥的配制品并且包含：具有不同缓冲内容物（例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐）、 pH和离子强度的稀释剂；预防吸附至表面的添加剂，如白蛋白或明胶；洗涤剂（例如，吐温 〇^?^11)20、吐温80、普朗尼克（?1111'〇111(3)?68、胆汁酸盐）。增溶剂（例如甘油、聚乙二醇）、 抗氧化剂（例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠）、防腐剂（例如硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸 酯）、増量物质或张度调节剂（例如乳糖、甘露醇）、聚合物（例如聚乙二醇）与蛋白质的共 价附接、与金属离子的络合、或材料的结合，所述材料的结合为：该材料结合在聚合化合物 如聚乳酸、聚乙醇酸、水溶胶等的微粒制剂中或微粒制剂上或结合在脂质体、微乳液、胶束、 单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球上。此类组合物可影响物理状态、溶解度、稳定性、 体内释放速率以及体内清除速率。控制释放或持续释放组合物包括在亲脂性储库（例如， 脂肪酸、蜡、油）中的配制品。本发明还涵盖用聚合物（例如，泊洛沙姆（poloxamer)或泊洛 沙胺（poloxamine))包被的微粒组合物。本发明的组合物的其他实施例结合微粒形式、保 护性包衣、蛋白酶抑制剂或渗透促进剂以用于不同的给药途径，包括经肠胃外、肺、鼻、口、 阴道、直肠的途径。在一个实施例中，该药物组合物是经肠胃外、癌旁、经粘膜、透皮、肌内、 静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内以及瘤内给药的。
[0087] 此外，如在此所使用的"药学上可接受的载体"或"药用载体"是本领域中已知的， 并且包括但不限于0. 01-0. 1M或0. 05M磷酸盐缓冲液或0. 8%盐水。另外，此类药学上可接 受的载体可以是水溶液或非水溶液、混悬液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、 植物油类如橄榄油以及可注射有机酯类如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或 混悬液，包括盐水和缓冲的介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和 氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充物、电解质补充 物，如基于林格氏右旋糖的那些等。也可存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗 氧化剂、整理剂（collatingagent)、惰性气体等。
[0088] 对于任何化合物，可在细胞培养测定中或在动物模型如小鼠、大鼠、兔、狗或猪中 初步估算治疗有效剂量。还可使用动物模型来确定浓度范围和给药途径。然后可使用此种 信息来确定针对在人类中给药的有用剂量和途径。这些技术是本领域技术人员众所周知 的，并且治疗有效剂量是指改善症状或病状的活性成分的量。治疗功效和毒性可通过标准 药物程序在细胞培养物中或用实验性动物，如通过计算并对比ED5(I(在50%群体中治疗有 效的剂量）和LD5(I(对50%群体具致死性的剂量）统计来测定。可将以上所述的任何治疗 组合物应用至对此种治疗有需要的任何受试者，包括但不限于哺乳动物，如狗、猫、牛、马、 兔、猴以及人。
[0089] 可通过任何数目的途径给予在本发明中利用的药物组合物，这些途径包括但不限 于经口、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌 下或直肠的方式。
[0090] 本发明的药物组合物可进一步包含例如选自下组的至少一个药物成员，该组 由以下各项组成：双膦酸盐、活性维生素D3、降钙素及其衍生物、激素制剂如雌二醇、 SERM(选择性雌激素受体调节剂）、依普黄酮（ipriflavone)、维生素K2(四烯甲萘醌 (menatetrenone))丐制剂、PTH(甲状旁腺激素）制齐[|、非类固醇抗炎剂、可溶性TNF受体制 齐IJ、抗TNF-a抗体或这些抗体的功能片段、抗PTHrP(甲状旁腺激素相关的蛋白质）抗体或 这些抗体的功能片段、IL-1受体拮抗剂、抗IL-6受体抗体或这些抗体的功能片段、抗RANKL 抗体或这些抗体的功能片段以及0CIF(破骨细胞发生抑制因子）。
[0091] 出于本披露的目的，术语"治疗"是指治疗性治疗和防治性或预防性措施两者，其 中目的是为了预防或减缓（减轻）靶向的病理性病状或病症。有治疗需要的那些包括已经 患有该病症的那些以及倾向于患有该病症的那些或有待预防该病症的那些。
[0092] 这些抗体或抗原结合片段可在不同骨丢失或癌症的治疗上具有治疗用途。在一个 示例性实施例中，这些抗体或片段可在与骨疾病相关联的骨丢失上具有治疗用途，这些骨 疾病例如为其中存在破骨细胞的骨降解活性增加的病状。
[0093] 在某些情况下，这些抗Siglec-15抗体和片段可与表达Siglec-15的细胞相互作 用，这些细胞如破骨细胞或破骨细胞前体。在某些情况下，这些抗体或抗原结合片段可与表 达SEQIDN0:2的细胞相互作用并且通过介导ADCC诱导免疫反应。在其他情况下，这些抗 体和片段可阻断SEQIDN0:2与它天然配体的相互相用。
[0094] 这些抗Siglec-15抗体或抗原结合片段可在不同骨相关疾病背景下的骨丢失治 疗上具有治疗用途，这些疾病包括但不限于：骨质疏松症、骨质减少、骨软化症、甲状旁腺功 能亢进、甲状腺功能减退、甲状腺功能亢进、性腺功能减退症、甲状腺毒症、全身性肥大细胞 增多症、成人型低磷酸酯酶症、肾上腺皮质功能亢进、成骨不全、佩吉特氏病、库兴氏病/综 合征、特纳氏综合征、戈谢病、埃-当二氏综合征、马方氏综合征、门克斯综合征、范科尼氏 综合征、多发性骨髓瘤、高钙血症、低钙血症、关节炎、牙周病、软骨病（包括维生素D依赖性 I型和II型以及X连锁低血磷佝偻病）、骨成纤维发生不全、骨硬化病症如致密性成骨不全 症和由巨噬细胞介导的炎性过程引起的损害。在优选的实施例中，这些抗体和片段在其中 普遍存在严重骨丢失的病状、特别是向骨的转移性癌症中具有治疗用途。
[0095] 这些抗Siglec-15抗体及其抗原结合片段可在由不同骨重建病症引起的或与不 同骨重建病症相关联的癌症或骨丢失的治疗上具有治疗用途。具体地说，这些抗Siglec-15 抗体和其中的免疫功能片段在其中破骨细胞是活动过强并且促使骨表面降解的病状中具 有治疗用途。在某些情况下，这些抗Siglec-15抗体及其抗原结合片段可与针对相同病状 给定的其他治疗组合而同时给予。因此，可与本领域技术人员已知的抗再吸收剂（例如，双 膦酸盐）一起给予这些抗体。另外，可与以下各项一起给予这些抗体：抗有丝分裂剂（例如 紫杉烷类）、基于钼的药剂（例如顺钼）、DNA损伤剂（例如多柔比星（Doxorubicin))以及 本领域技术人员已知的其他细胞毒性疗法。在其他情况下，这些抗Siglec-15抗体和其中 的免疫功能片段可与其他治疗性抗体一起给予。这些包括但不限于靶向RANKL、EGFR、⑶-20 和Her2的抗体。
[0096] 通过下文给出的非限制性详细说明，本发明的另外范围、适用性和优点将变得清 楚。然而，应该理解，同时指示本发明的示例性实施例的此详细说明仅通过参考附图以举例 的方式给出。
[0097] 附图简要说明
[0098] 图1A.鼠25D8可变结构域的分子模型。用箭头将⑶R环指示为轻链中的L1、L2 和L3以及重链中的H1、H2和H3。
[0099] 图1B.鼠25E9可变结构域的分子模型。用箭头将⑶R环指示为轻链中的LI、L2 和L3以及重链中的H1、H2和H3。
[0100] 图2A. 25D8抗体的可变轻链（VL)结构域的小鼠、人源化和选择的人框架序列的序 列比对。这些⑶R用浅灰色高亮显示并且对应于SEQIDN0. 53、54和55。
[0101] 图2B. 25D8抗体的可变重链（VH)结构域的小鼠、人源化和选择的人框架序列的序 列比对。这些CDR用浅灰色高亮显示并且对应于SEQIDN0. 56、57和58。
[0102] 图3A. 25E9抗体的可变轻链（VL)结构域的小鼠、人源化和选择的人框架序列的序 列比对。这些⑶R用浅灰色高亮显示并且对应于SEQIDN0. 47、48和49。
[0103] 图3B. 25E9抗体的可变重链（VH)结构域的小鼠、人源化和选择的人框架序列的序 列比对。这些⑶R用浅灰色高亮显示并且对应于SEQIDN0. 50、51和52。
[0104] 图 4A?人源化全长IgG22?8(SEQIDN0. :23 和 27)和嵌合全长IgG2(SEQID NO. : 21和25) 25D8抗体的组装序列。
[0105] 图 4B?人源化全长IgG225E9(SEQIDN0. :7 和 29)和嵌合全长IgG225E9(SEQID NO. :5和30)抗体的组装序列。
[0106] 图5A.小鼠和人源化2?8IgG2抗体的SPR色谱图。
[0107] 图5B.小鼠和人源化25E9IgG2抗体的SPR色谱图。
[0108] 图6A示出25E9小鼠轻链可变结构域与25E9人源化轻链可变结构域变体1之间 的比对。通过使用ClustalW2程序进行比对；其中意指该列中的残基在比对的所有 序列中是一致的，"："意指已观察到保守取代并且"意指观察到半保守取代。（Larkin M.A.(拉金M.A.)等人，（2007)ClustalW和ClustalX第 2 版本，生物信息学（Bioinformat ics) 200723 (21): 2947-2948)。这些比对用来产生列于SEQIDNO. :33、34和35中的共有序 列。
[0109] 图6B示出25E9小鼠重链可变结构域与25E9人源化重链可变结构域变体1之间 的比对。通过使用ClustalW2程序完成比对；其中意指该列中的残基在比对的所有 序列中是一致的，"："意指已观察到保守取代并且"意指观察到半保守取代。（Larkin M.A.(拉金M.A.)等人，（2007)ClustalW和ClustalX第 2 版本，生物信息学（Bioinformat ics) 200723 (21): 2947-2948)。这些比对用来产生列于SEQIDNO. :36、37和38中的共有序 列。
[0110] 图7A示出25D8小鼠轻链可变结构域与25D8人源化轻链可变结构域之间的比 对。通过使用ClustalW2程序完成比对；其中意指该列中的残基在比对的所有序 列中是一致的，"："意指已观察到保守取代并且"意指观察到半保守取代。（Larkin M.A.(拉金M.A.)等人，（2007)ClustalW和ClustalX第 2 版本，生物信息学（Bioinformat ics) 200723 (21): 2947-2948)。这些比对用来产生列于SEQIDNO. :39、40和41中的共有序 列。
[0111] 图7B示出25D8小鼠重链可变结构域与25D8人源化重链可变结构域之间的比 对。通过使用ClustalW2程序完成比对；其中意指该列中的残基在比对的所有序列中 是一致的，"："意指已观察到保守取代并且"意指观察到半保守取代。（LarkinM.A.(拉 金M.A.)等人，（2007)ClustalW和ClustalX第 2 版本.生物信息学（Bioinformati cs) 200723 (21): 2947-2948)。这些比对用来产生列于SEQIDNO. : 42、43和44中的共有序 列。
[0112] 图8.指示25E9以浓度依赖性方式特异性结合在细胞表面上表达的人Siglec-15 的流式细胞计量术结果。
[0113] 图9.示出25E9能够抑制人破骨细胞的分化和再吸收活性的图像。
[0114] 图10A.示出在抗Siglec-15抗体存在下内化生物素化的Siglec-15的蛋白质印 迹。
[0115] 图10B.通过共聚焦显微镜进行的Siglec-15内吞作用的表征。
[0116] 图10C.示出Siglec-15蛋白水平的蛋白质印迹
[0117] 图10D.示出在存在或不存在抗Siglec-15抗体情况下RANK1刺激之后在 RAW264. 7中的Siglec-15蛋白表达的蛋白质印迹。
[0118] 图11.由Siglec-15群集诱导的细胞信号传导分析。在4C下，用初级抗体（抗 Siglec-15或对照人IgG)处理对照（C)或分化的（A)RAW264. 7细胞，接着在37C下用二级 交联抗体处理指定的时间。用指定的抗体通过蛋白质印迹法分析总裂解液。
[0119] 图12?示出人源化25E9LlHlIgGl(左图）与人源化25E9LlHlIgG2(右图）之间的 结合参数差异的SPR色谱图。固定纯化的Fc-Siglec-15(150RU)并且在指定浓度（100nM、 33. 3nM、ll.lnM、3. 70nM和1. 23nM)下注射人源化25E9。用1:1比率拟合这些曲线。
[0120] 图13.示出与人源化25E9IgG2相比，人源化25E9LlHlIgGl用于抑制破骨细胞分 化的效力增加的代表性图像。
[0121] 图 14A?人源化全长IgG12OT8(SEQIDN0. :23 和 46)和嵌合全长IgG12OT8(SEQ IDNO. : 21和45)抗体的组装序列。
[0122] 图 14B?人源化全长IgG125E9(SEQIDNO. :7和 13)和嵌合全长IgG125E9(SEQID NO. :5和11)抗体的组装序列。
[0123] 图15.指示25E9-ADC以与未缀合抗体非常类似的方式特异性结合在细胞表面上 表达的人Siglec-15的流式细胞计量术结果。
[0124] 图16.示出25E9-ADC对成熟多核破骨细胞的存活曲线。与未缀合的25E9非常不 同，该反应强烈抑制破骨细胞活性而不影响它们的存活。
[0125] 图17示出TRAP染色的破骨细胞的图像，说明25E9-ADC对成熟多核破骨细胞的细 胞毒性作用。与未缀合的25E9非常不同，该反应强烈抑制破骨细胞活性而不影响它们的存 活。对照ADC对破骨细胞没有作用。
[0126] 发明详细说明
[0127] 由本发明所涵盖的变体抗体或抗原结合片段是可包含一种插入、一种缺失或一种 氨基酸取代（保守性或非保守性）的那些。这些变体可去除它的氨基酸序列中的至少一个 氨基酸残基并且在该氨基酸残基的位置中插入一个不同的残基。
[0128] 用于取代诱变的感兴趣的位点包括高变区（CDR)，但也涵盖了在框架区中或甚至 在恒定区中的修饰。可以通过将来自以下列出的组（1到6组）中之一的（⑶R、可变链、抗 体等的）氨基酸用相同组的另一个氨基酸交换而产生保守性取代。
[0129] 通常，与框架区中的突变相比而言这些⑶R中的突变可对抗体或抗原结合片段的 抗原结合活性具有更大的影响。可进行框架区中的突变以增加抗体的"人性"。由本发明 所涵盖的变体抗体或抗原结合片段是具有与在此提出的那些大致上一致的抗原结合能力 (包括类似、一致或稍微小于）或具有比在此提出的那些抗原结合能力更好的那些。
[0130] 保守性取代的其他示例性实施例示于表1A中"优选的取代"标题之下。如果这样 的取代导致所不希望的特性，则可引入在表1A中命名为"示例性取代"的、或如下进一步参 考氨基酸类别所述的更多实质性改变，并且筛选产物。
[0131] 本领域中已知的是变体可通过取代诱变来产生，并且保留本发明的多肽的生物活 性。这些变体去除它的氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基并且在该氨基酸残基的位置中 插入一个不同的残基。例如，用于取代诱变的感兴趣的一个位点可包括这样一个位点：在该 位点中从不同物种获得的特定残基是一致的。鉴定为"保守性取代"的取代的实例示于表 1A中。如果这样的取代导致所不希望的改变，则可引入在表1A中命名为"示例性取代"的、 或如下进一步参考氨基酸类别所述的其他类型的取代，并且筛选产物。
[0132] 通过选择取代来完成在功能或免疫身份方面的实质性修饰，这些取代在它们对维 持以下各项的作用方面明显不同：(a)在取代区域中的多肽主链的结构，例如，如片层或螺 旋构象。（b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或（c)侧链的体积。基于共同的侧链特性将 天然存在的残基分组：
[0133] (第1组）疏水性：正亮氨酸、甲硫氨酸（Met)、丙氨酸（Ala)、缬氨酸（Val)、亮氨 酸（Leu)、异亮氨酸（lie)
[0134] (第2组）中性亲水性：半胱氨酸（Cys)、丝氨酸（Ser)、苏氨酸（Thr)
[0135] (第3组）酸性：天冬氨酸（Asp)、谷氨酸（Glu)
[0136] (第4组）碱性：天冬酰胺（Asn)、谷氨酰胺（Gin)、组氨酸（His)、赖氨酸（Lys)、 精氨酸（Arg)
[0137] (第5组）影响链取向的残基：甘氨酸（Gly)、脯氨酸（Pro);以及
[0138] (第6组）芳香族：色氨酸（Trp)、酪氨酸（Tyr)、苯丙氨酸（Phe)
[0139] 非保守性取代将需要将这些类别之一的一个成员用另一个交换。
[0140] 表1A.氨基酸取代
[0141]
【权利要求】
1. 一种抗体或其抗原结合片段，能够特异性地结合Siglec-15并且选自下组，该组由 以下各项组成： a. -种抗体或其抗原结合片段，具有与SEQ ID NO. :6至少80%-致的一个轻链可变 区和/或与SEQ ID NO. : 12至少80%-致的一个重链可变区，其中所述抗体或其抗原结合 片段包含与SEQ ID NO. :6或SEQ ID NO. : 12相比的至少一个氨基酸取代并且其中所述氨 基酸取代是在一个互补决定区（CDR)的外面以及； b. -种抗体或其抗原结合片段，具有与SEQ ID NO. : 22至少80 %-致的一个轻链可变 区和/或与SEQ ID NO. :26至少80%-致的一个重链可变区，其中所述抗体或其抗原结合 片段包含与SEQ ID NO. : 22或SEQ ID NO. : 26相比的至少一个氨基酸取代并且其中所述氨 基酸取代是在一个互补决定区（CDR)的外面。
2. 如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中该至少一个氨基酸取代是在该轻链 可变区中。
3. 如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含至 少三个氨基酸取代。
4. 如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在该轻 链可变区和/或重链可变区中包含从一至二十五个氨基酸取代。
5. 如权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其中该氨基酸取代是在该轻链可变区 中。
6. 如权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其中该氨基酸取代是在该重链可变区 中。
7. 如权利要求1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述氨基酸取代是保 守性的。
8. 如权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO. : 33的至少90个氨基酸。
9. 如权利要求8所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO. :34 的至少90个连续氨基酸。
10. 如权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO. : 35 的至少90个连续氨基酸。
11. 如权利要求10所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO. :8 或10的至少90个连续氨基酸。
12. 如权利要求11所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区是如在SEQ ID NO. : 8或在SEQ ID NO. : 10中所列出。
13. 如权利要求1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含 SEQ ID NO. : 36的至少90个连续氨基酸。
14. 如权利要求13所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含SEQ ID NO. :37的至少90个连续氨基酸。
15. 如权利要求14所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含SEQ ID NO. :38的至少90个连续氨基酸。
16. 如权利要求15所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含SEQ ID NO. : 14、SEQ ID NO. : 16、SEQ ID NO. : 18 或 SEQ ID NO. :20 的至少 90 个连续氨基酸。
17. 如权利要求15所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区是如在SEQ ID NO. : 14、SEQ ID NO. : 16、SEQ ID NO. :18 或在 SEQ ID NO. :20 中所列出。
18. 如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO. :33 的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ ID NO. :36的至少90个连续氨基 酸。
19. 如权利要求18所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO. :34的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ ID NO. :37的至少90个连 续氨基酸。
20. 如权利要求19所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含氨基酸SEQ ID NO. :35的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ ID NO. :38的至少90个连 续氨基酸。
21. 如权利要求20所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO. : 8 或SEQ ID NO. :10的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ ID NO. :14、SEQ ID NO. : 16、SEQ ID NO. : 18 或 SEQ ID NO. :20 的至少 90 个连续氨基酸。
22. 如权利要求21所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区是如在SEQ ID NO. :8或SEQ ID NO. :10中所列出并且其中该重链可变区是如在SEQ ID NO. : 14、SEQ ID NO. :16、SEQ ID NO. :18 或 SEQ ID NO. :20 中所列出。
23. 如权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含 SEQ ID NO. : 39的至少90个氨基酸。
24. 如权利要求23所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO. :40的至少90个连续氨基酸。
25. 如权利要求24所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO. :41的至少90个连续氨基酸。
26. 如权利要求25所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO. :24的至少90个连续氨基酸。
27. 如权利要求26所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区是如在SEQ ID NO. : 24中所列出。
28. 如权利要求1至7或23至27中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可 变区包含SEQ ID NO. : 42的至少90个连续氨基酸。
29. 如权利要求28所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含SEQ ID NO. :43的至少90个连续氨基酸。
30. 如权利要求29所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含SEQ ID NO. :44的至少90个连续氨基酸。
31. 如权利要求30所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含SEQ ID NO. :26的至少90个连续氨基酸。
32. 如权利要求31所述的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区是如在SEQ ID NO. : 26中所列出。
33. 如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO. : 39 的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ ID NO. :42的至少90个连续氨基 酸。
34. 如权利要求33所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO. :40的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ ID NO. :43的至少90个连 续氨基酸。
35. 如权利要求34所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO. : 41的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ ID NO. :44的至少90个连 续氨基酸。
36. 如权利要求35所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区包含SEQ ID NO. :24的至少90个连续氨基酸并且其中该重链可变区包含SEQ ID NO. :26的至少90个连 续氨基酸。
37. 如权利要求36所述的抗体或抗原结合片段，其中该轻链可变区是如在SEQ ID NO. :24中所列出并且其中该重链可变区是如在SEQ ID NO. :26中所列出。
38. 如权利要求1至37中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含一个 恒定区的氨基酸。
39. 如权利要求38所述的抗体或抗原结合片段，其中该恒定区的这些氨基酸是来自一 种人抗体。
40. 如权利要求1至40中任一项所述的抗体或抗原结合片段，包含一个人IgGl恒定 区。
41. 如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含如在SEQ ID NO. : 23中 所列出的一个轻链。
42. 如权利要求1或41所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含如在SEQ ID NO. :27中所列出的一个重链。
43. 如权利要求1或41所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含如在SEQ ID NO. : 46中所列出的一个重链。
44. 如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含如在SEQ ID NO. :7中 所列出的一个轻链。
45. 如权利要求1或44所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含如在SEQ ID NO. : 29中所列出的一个重链。
46. 如权利要求45所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含如在SEQ ID NO. : 13 中所列出的一个重链。
47. 如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是选自下组，该组由以下 各项组成： a. 包含如在SEQ ID NO. : 7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. : 13中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； b. 包含如在SEQ ID NO. : 7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. : 15中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； c. 包含如在SEQ ID NO. : 7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. : 17中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； d. 包含如在SEQ ID NO. :7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. :19中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； e. 包含如在SEQ ID NO. : 7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. : 29中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； f. 包含如在SEQ ID NO. : 7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. : 59中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； g. 包含如在SEQ ID NO. : 7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. : 60中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； h. 包含如在SEQ ID NO. :7中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. :61中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； i. 包含如在SEQ ID NO. : 9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. : 13中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； j. 包含如在SEQ ID NO. : 9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. : 15中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； k. 包含如在SEQ ID NO. : 9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. : 17中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； l. 包含如在SEQ ID NO. : 9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. : 19中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； m. 包含如在SEQ ID NO. : 9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. : 29中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； n. 包含如在SEQ ID NO. : 9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. : 59中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； 〇.包含如在SEQ ID NO. : 9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID NO. : 60中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； P.包含如在SEQ ID N0. :9中所列出的一个轻链和如在SEQ ID N0. :61中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段； q. 包含如在SEQ ID N0. : 23中所列出的一个轻链和如在SEQ ID N0. : 27中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段以及； r. 包含如在SEQ ID N0. : 23中所列出的一个轻链和如在SEQ ID N0. : 46中所列出的一 个重链的一种抗体或其抗原结合片段。
48. 如权利要求1至47中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗原结合片段是 一种 scFv、Fab、Fab' 或（Fab，）2。
49. 如权利要求1至48中任一项所述的抗体或抗原结合片段，与一个细胞毒性部分缀 合。
50. 如权利要求1至48中任一项所述的抗体或抗原结合片段，与一个可检测部分缀合。
51. 如权利要求1至50中任一项所述的抗体或抗原结合片段，用于在治疗骨丢失中使 用。
52. -种分离的抗体或抗原结合片段，能够与如权利要求1至50中任一项所述的抗体 或抗原结合片段竞争。
53. -种核酸，编码如权利要求1至48中任一项所述的抗体或抗原结合片段的一个轻 链可变结构域和/或一个重链可变结构域。
54. -种载体，包含如权利要求53所述的核酸。
55. 如权利要求54所述的载体，其中所述载体是一种表达载体。
56. -种分离的细胞，包含如权利要求53所述的核酸。
57. 如权利要求56所述的分离的细胞，其中所述细胞包含编码一个轻链可变结构域的 一种核酸和编码一个重链可变结构域的一种核酸。
58. 如权利要求57所述的分离的细胞，其中所述细胞能够表达、组装和/或分泌一种抗 体或其抗原结合片段。
59. -种分离的细胞，包含或表达如权利要求1至48中任一项所述的抗体或抗原结合 片段。
60. 如权利要求59所述的分离的细胞，其中所述细胞包含编码一个轻链可变结构域的 一种核酸和编码一个重链可变结构域的一种核酸。
61. 如权利要求60所述的分离的细胞，其中所述细胞能够表达、组装和/或分泌一种抗 体或其抗原结合片段。
62. -种药物组合物，包含如权利要求1至50中任一项所述的抗体或抗原结合片段以 及一种药学上可接受的载体。
63. -种组合物，包含如权利要求1至50中任一项所述的抗体或抗原结合片段以及一 种载体。
64. -种治疗骨丢失的方法，该方法包括向有需要的受试者给予如权利要求1至49中 任一项所述的抗体或抗原结合片段。
65. 如权利要求64所述的方法，其中骨丢失是与以下各项相关联：癌症、癌症治疗、骨 质疏松症、骨质减少、骨软化症、甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能减退、甲状腺功能亢进、性 腺功能减退症、甲状腺毒症、全身性肥大细胞增多症、成人型低磷酸酯酶症、肾上腺皮质功 能亢进、成骨不全、佩吉特氏病、库兴氏病/综合征、特纳氏综合征、戈谢病、埃-当二氏综合 征、马方氏综合征、门克斯综合征、范科尼氏综合征、多发性骨髓瘤、高钙血症、低钙血症、关 节炎、牙周病、软骨病（包括维生素 D依赖性I型和II型以及x连锁低血磷佝偻病）、骨成 纤维发生不全、骨硬化病症如致密性成骨不全症或由巨噬细胞介导的炎性过程骨引起的损 害。
66. -种试剂盒，包括如权利要求1至50中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
67. 如权利要求1至50中任一项所述的抗体或抗原结合片段在制造用于治疗骨丢失的 药剂中的用途。
68. 如权利要求67中所定义的用途，其中骨丢失是与以下各项相关联：癌症、癌症治 疗、骨质疏松症、骨质减少、骨软化症、甲状旁腺功能亢进、甲状腺功能减退、甲状腺功能亢 进、性腺功能减退症、甲状腺毒症、全身性肥大细胞增多症、成人型低磷酸酯酶症、肾上腺皮 质功能允进、成骨不全、佩吉特氏病、库兴氏病/综合征、特纳氏综合征、戈谢病、埃-当二氏 综合征、马方氏综合征、门克斯综合征、范科尼氏综合征、多发性骨髓瘤、高钙血症、低钙血 症、关节炎、牙周病、软骨病（包括维生素 D依赖性I型和II型以及x连锁低血磷佝偻病）、 骨成纤维发生不全、骨硬化病症如致密性成骨不全症或由巨噬细胞介导的炎性过程引起的 损害。
【文档编号】C12N5/10GK104507969SQ201380037901
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年7月17日 优先权日:2012年7月19日
【发明者】M·施图伊伯勒, G·B·特伦布莱, T·苏莱亚, A·N·莫雷蒂斯, M·菲利翁 申请人:阿莱斯亚生物疗法股份有限公司