人疱疹病毒hsv-1、hsv-2和hcmv三联检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种人疱疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV三联检测试剂盒，由定量PCR反应液、HSV-1标准品、HSV-2标准品、HCMV标准品、阴性对照品、HSV-1阳性对照品、HSV-2阳性对照品、HCMV阳性对照品、说明书和盒体组成，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物、HSV-1荧光探针、HSV-2荧光探针和HCMV荧光探针。本发明试剂盒采用实时荧光定量PCR技术和三色特异性荧光探针，对样品中的常见人疱疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV能进行同时分型检测，对阳性病毒能实时准确定量，节约生产成本和检测成本，提高检测效率，可满足诊断需求，有助于及时制定针对性治疗方案。
【专利说明】人疱疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV三联检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，涉及荧光定量PCR检测试剂盒，具体涉及一种三探针实时荧光定量PCR检测患者血液、尿液、脑脊液等样本中单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)和人巨细胞病毒(HCMV)三种常见人疱疹病毒的新型试剂盒，能同时对HSV-U HSV-2和HCMV进行分型和定量检测。
【背景技术】
[0002]疱疹病毒科是一群中等大小、有包膜的DNA病毒，现已发现100种以上。已知与人类疾病相关的疱疹病毒包括单纯疱疹病毒I型和2型(HSV-1、HSV-2)、水痘一带状疱疹病毒(VZV)、爱泼斯坦一马尔病毒(EBV)、人巨细胞病毒(HCMV)、人疱疹病毒6型、7型和8型(HHV-6、HHV-7、HHV-8)，临床上最常见的为HSV-1、HSV_2和HCMV感染。当机体免疫功能低下或受抑制时，易引起疱疹病毒感染，导致严重致死性疾病，而早期诊断和及时抗病毒治疗可明显改善预后，降低病死率。因疱疹病毒感染的临床表现多样，且不同病毒感染的症状和体征多无特异性，因此早期诊断和及时治疗需依赖实验室检测。
[0003]传统的疱疹病毒检测方法主要包括病毒分离培养和血清学检测，前者曾为疱疹病毒的诊断“金标准”，但存在需时长(3-30天)、敏感性低(尤其在抗病毒药物治疗后)、分型困难等缺陷；后者又分为抗原直接检测法和抗体间接检测法，抗原直接检测法由于某些病毒不产生可检测的抗原而导致敏感性低，抗体间接检测法由于疱疹病毒感染后需I周左右才产生有效浓度的抗体而无法进行早期诊断，且不同疱疹病毒间存在交叉反应，抗体特异性不闻。
[0004]随着分子生物学技术的迅速发展，聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术，特别是近几年兴起的实时荧光定量PCR技术为病原微生物的检测提供了新方向。实时荧光定量PCR技 术的基本原理是利用Taq酶的5’_3’外切酶核酸活性，在普通PCR基础上设计荧光双标记探针，两端分别标记荧光报告基团(R)和淬灭基团(Q);探针保持完整时R基团的荧光信号被Q基团抑制，一旦探针被切断，Q基团的抑制作用消失，R基团的荧光信号就可被检测到。该技术通过对荧光信号的检测实现对PCR过程中产物量的实时监测，并可精确计算初始模板量，除具有定量准确、检测快速等优点外，最大的优势是采用完全闭管检测，省去了对PCR产物的后处理，避免了交叉污染。
[0005]目前的实时荧光定量PCR技术随着材料和仪器的进一步发展，通过在荧光探针的5’端标记不同的荧光染料(FAM、HEX、R0X等)及多通道荧光定量PCR仪，可以实现基因分型、基因突变检测、SNP分析等研究。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种人疱疹病毒HSV-1、HSV_2和HCMV三联检测试剂盒，是一种同时检测常见人疱疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV的三联实时荧光定量PCR试剂盒，由定量PCR反应液、HSV-1标准品、HSV-2标准品、HCMV标准品、阴性对照品、HSV-1阳性对照品、HSV-2阳性对照品、HCMV阳性对照品、说明书和盒体组成，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物、HSV-1荧光探针、HSV-2荧光探针和HCMV荧光探针。
[0007]PCR扩增弓丨物序列为:
【权利要求】
1.一种人疱疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV三联检测试剂盒，由定量PCR反应液(I)、HSV-1标准品(2 )、HSV-2标准品(3 )、HCMV标准品(4 )、阴性对照品(5 )、HSV-1阳性对照品(6)、HSV-2阳性对照品(7)、HCMV阳性对照品(8)、说明书(9)和盒体(10)组成； 其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2, dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物、HSV-1荧光探针、HSV-2荧光探针和HCMV荧光探针； 上游扩增引物序列:5’ -TCATCTACGGGGACACGGAC-3’ ； 下游扩增引物序列:5’ -CGCACCAGATCCACGCCCTT-3’ ；
HSV-1 荧光探针:5’ FAM-GCGGCACAGCACAAAGATG-BHQ-1-3’ ；
HSV-2 荧光探针:5’ HEX-GCGGCACAAAACGAAAATG-BHQ-1-3’ ；
HCMV 荧光探针:5’ ROX- GAAAGCGGACAAACACGCT-BHQ-2-3’ ； HSV-1 标准品序列为:TCATCTACGG GGACACGGAC TCCATCTTTG TGCTGTGCCG CGGCCTCACGGCCGCCGGGC TGACGGCCGT GGGCGACAAG ATGGCGAGCC ACATCTCGCG CGCGCTGTTT CTGTCCCCCATCAAACTCGA GTGCGAAAAG ACGTTCACCA AGCTGCTGCT GATCGCCAAG AAAAAGTACA TCGGCGTCATCTACGGGGGT AAGATGCTCA TCAAGGGCGT GGATCTGGTG CG ； HSV-2 标准品序列为:TCATCTACGG GGACACGGAC TCCATTTTCG TTTTGTGCCG CGGCCTCACGGCCGCGGGCC TGGTGGCCAT GGGCGACAAG ATGGCGAGCC ACATCTCGCG CGCGCTGTTC CTCCCCCCGATCAAGCTCGA GTGCGAAAAA ACGTTCACCA AGCTGCTGCT CATCGCCAAG AAAAAGTACA TCGGCGTCATCTGCGGGGGC AAGATGCTCA TCAAGGGCGT GGATCTGGTG CG ； HCMV 标准品序列为:TCATCTACGG GGACACGGAC AGCGTGTTTG TCCGCTTTCG TGGCCTGACGCCGCAGGCTC TGGTGGCGCG TGGGCCCAGC CTGGCGCACT ACGTGACGGC CTGTCTTTTT GTGGAGCCCGTCAAGCTGGA GTTTGAAAAG GTCTTCGTCT CTCTTATGAT GATCTGCAAG AAACGTTACA TCGGCAAAGTGGAGGGCGCC TCGGGTCTGA GCATGAAGGG CGTGGATCTG GTGCG。
2.根据权利要求1所述的一种人疱疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV三联检测试剂盒，其特征在于，阴性对照为无菌注射用水样品，HSV-1阳性对照、HSV-2阳性对照、HCMV阳性对照分别为HSV-1、HSV-2、HCMV灭活病毒株样品。
3.根据权利要求1所述的一种人疱疹病毒HSV-1、HSV-2和HCMV三联检测试剂盒，其特征在于，本发明试剂盒保存于-20°C，减少反复冻融。
【文档编号】C12Q1/68GK103773898SQ201410026783
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】陶然, 尚世强, 杜立中, 舒强, 李伟 申请人:浙江大学