一种鉴别天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法
【专利摘要】本发明公开了一种鉴别天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法，是以天然蜂蜜在一定浓度下对大肠杆菌DH5α有杀菌作用，而人造蜂蜜对大肠杆菌DH5α没有杀菌作用为原理，该方法是将待测蜂蜜配成的检测样品加入大肠杆菌DH5α培养基中培养菌落，然后观察菌落生长情况；若检测样品的蜂蜜浓度为100％时，仍有菌落存活，则该待测蜂蜜是人造蜂蜜，若在某一蜂蜜浓度(＜100％)下菌落全部被杀灭，则该待测蜂蜜不是人造蜂蜜。本发明方法简单、易于操作、效率高、成本低，本发明对人造蜂蜜的鉴别具有较大的实际意义，应用前景广阔。
【专利说明】一种鉴别天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品检测【技术领域】，尤其涉及一种对天然蜂蜜和人造蜂蜜进行鉴别的方法。
【背景技术】
[0002]蜂蜜是一种成分复杂、营养丰富的过饱和糖溶液，具有极高的渗透压和较低的pH值，含有过氧化氢(hydrogen peroxide, H202)及丙酮醒类(Methylglyoxal, MG0)等杀菌成分，具有广谱的抗菌活性，且其抗菌活性不会产生耐药性。
[0003]一般微生物适宜生长在渗透压相当于3-6个大气压的溶液中，仅少数真菌和酵母菌能在渗透压相当于40-90个大气压中生长，而在常温下天然成熟的蜂蜜的渗透压相当于105个大气压，足以使细胞脱水而死亡。同时，蜂蜜呈现出强烈的酸度，pH介于
3.2-4.5之间，而细菌生长的最佳pH值位于7.2-7.4左右，故蜂蜜在未稀释时能够抑制大多数细菌生长。另外，当细菌持续暴露在H202气雾中，细菌生长受抑制的H202浓度只需0.02mM-0.05mM。虽然蜂蜜中H202浓度很低，但它仍然是蜂蜜中一种有效的抗微生物成分。研究发现MGO也是蜂蜜中的一种重要的抗菌成分，MGO对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌及绿脓杆菌等都具有很高的抗菌活性。基于蜂蜜以上的抗菌特性，蜂蜜对许多致病菌具有杀菌活性，包括沙门氏菌、志贺菌属及肠道内的致病菌如埃希氏菌属、霍乱弧菌和大肠杆菌等革兰氏阴性及阳性菌。
[0004]由于蜂蜜的主要成分是果糖和葡萄糖，两者都是很容易得到的工业产品，因此在利益的驱动下，有不少不法厂家及商贩用葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉等原料，再添加色素、蜂蜜香精等制作出人造蜂蜜来谋取暴利，因为人造蜂蜜根本不含有天然蜂蜜中的多种营养成分，仅是感官指标和部分理化指标与天然蜂蜜极为相似，并且难以辨别其真假，于是人造蜂蜜也叫做假蜂蜜。还有一些商家为了迷惑消费者，为了通过产品的质量检测，在天然蜂蜜里混入不同比例的人造蜂蜜。本发明中只将不含有天然蜂蜜成分的蜂蜜叫做人造蜂蜜。目前，鉴别天然蜂蜜和人造蜂蜜的手段主要是检测蜂蜜中人为加入的一些糖浆成分，而到现在为止还没有一种方法能对任何种类糖浆进行确证，若要得出可靠结论，需要结合一整套的方法，复杂的检测程序，不仅费时、效率低，而且成本高，不利于应用到大批量样品。因此急需建立一种鉴别方法来评价蜂蜜的真假。
【发明内容】
[0005]为了克服上述现有鉴别蜂蜜方法的缺陷，本发明的主要目的是提供一种效率高、成本低的鉴别天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法，具体操作为:将由待测蜂蜜配成的蜂蜜浓度不同的检测样品分别与 相同量的大肠杆菌DH5CI菌液混合后加入固体培养基中培养菌落，观察菌落是否能够在所述检测样品达到某一蜂蜜浓度后全部被杀灭；若检测样品达到该蜂蜜浓度后，菌落全部被杀灭，则该待测蜂蜜不是人造蜂蜜；当检测样品的蜂蜜浓度达到100%菌落仍然存活，则该待测蜂蜜是人造蜂蜜。[0006]所述检测样品是将所述待测蜂蜜用无菌液稀释成不同蜂蜜浓度得到的。
[0007]所述无菌液为无菌的LB液体培养基。
[0008]所述固体培养基为LB固体培养基，所述培养为在37°C恒温培养16_29h。
[0009]所述方法，包括以下步骤:
[0010](I)配制LB液体培养基:含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，用水配制，混合均匀后高压灭菌，即得；
[0011]配制LB固体培养基:含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，琼脂粉15g/L，用水配制，混合均匀后高压灭菌， 600C时倒板即得；
[0012](2)将大肠杆菌DH5a加入到按步骤(1)方法配制好的LB液体培养基中，37°C 200rpm摇菌10-12h，即得大肠杆菌DH5a菌液，其中所述大肠杆菌DH5 a与所述LB液体培养基的体积比为1:100 ;
[0013](3)用步骤(1)中配制好的LB液体培养基稀释待测蜂蜜得到蜂蜜浓度(体积百分含量)分布在100%-0%之间(不含端值)的多个检测样品，另取待测蜂蜜和LB液体培养基分别作为蜂蜜浓度(体积百分含量)为100%和0%的检测样品，即得多个不同蜂蜜浓度的检测样品；
[0014](4)将步骤(2)得到的大肠杆菌DH5a菌液分别加入到按步骤(3)方法配制好的检测样品中，37°C 200rpm摇菌16-20h混合均匀后，即得培养液样品，其中所述大肠杆菌DH5 a菌液与所述检测样品的体积比为1:100 ;
[0015](5)将步骤(4)得到的培养液样品接种在步骤(1)方法配制的LB固体培养基上37°C恒温培养16-29h ;优选37°C恒温培养16_20h ；
[0016](6)观察步骤(5)方法培养的菌落生长情况，菌落全部被杀灭的检测样品对应的最小蜂蜜浓度记为最低杀菌浓度，若该蜂蜜浓度数值小于100%，则该待测蜂蜜不是人造蜂蜜；若检测样品的蜂蜜浓度达到100%菌落仍然存活，则该待测蜂蜜是人造蜂蜜。
[0017]所述检测样品的蜂蜜浓度(体积百分含量)依次为100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、0%。
[0018]步骤(5)中是将步骤(4)得到的培养液样品接种在步骤(1)方法配制的LB固体培养基上划线培养。
[0019]步骤(5)中的恒温培养时间为16_20h。
[0020]本发明的另一目的在于提供一种鉴别人造蜂蜜的方法，具体操作为:将待测蜂蜜与大肠杆菌DH5a菌液混合后加入固体培养基中培养菌落，然后观察菌落生长情况；若有存活菌落，则该待测蜂蜜是人造蜂蜜，否则，该待测蜂蜜不是人造蜂蜜。
[0021]所述固体培养基为LB固体培养基，在37°C恒温培养16_29h。
[0022]本发明的方法不是通过检测蜂蜜中糖类、酶类等成分，而是利用天然蜂蜜和人造蜂蜜对大肠杆菌DH5a具有截然不同的灭菌效果，即天然蜂蜜对此菌有杀灭作用，而人造蜂蜜则没有的原理，以此数据对蜂蜜进行鉴别，本发明方法简单、易于操作、效率高、成本低，本发明对人造蜂蜜的鉴别具有较大的实际意义，应用前景广阔。
[0023]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】[0024]图1:天然蜂蜜HH培养大肠杆菌DH5 α培养板菌落生长情况；
[0025]图2:人造蜂蜜AH培养大肠杆菌DH5 α培养板菌落生长情况；
[0026]图3:商品蜂蜜A培养大肠杆菌DH5 α培养板菌落生长情况；
[0027]图4:商品蜂蜜B培养大肠杆菌DH5 α培养板菌落生长情况；
[0028]图5:商品蜂蜜C培养大肠杆菌DH5 α培养板菌落生长情况；
[0029]图6:商品蜂蜜D培养大肠杆菌DH5 α培养板菌落生长情况。
【具体实施方式】
[0030]本发明利用天然蜂蜜对大肠杆菌具有杀菌作用，而人造蜂蜜则没有的原理，实现对天然蜂蜜和人造蜂蜜的鉴别。本发明中，大肠杆菌确定为DH5ci，由于实验中发现人造蜂蜜也能够杀死其他大肠杆菌，唯独不能杀死这种大肠杆菌，因此用其它种类的大肠杆菌不能直观鉴别蜂蜜的真假。
[0031]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护 范围不限于下述的实施例。
[0032]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂粉均为现有试剂。
[0033]实施例1、天然蜂蜜(homemade honey, HH)培养大肠杆菌DH5 α
[0034]天然蜂蜜来自养蜂厂，为中华蜜蜂采集多种花源酿制的天然成熟蜂蜜，并经60Co- Y射线照射灭菌，照射剂量为25kGy，剂量率为2000cGy/min。
[0035](I)配制LB液体培养基:含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，用水配制，混合均匀后高压灭菌，即得；
[0036]配制LB固体培养基:含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L,琼脂粉15g/L，用水配制，混合均匀后高压灭菌，600C时倒板即得；
[0037](2)将液体大肠杆菌DH5 α 100 μ L加入到IOmL按步骤⑴方法配制好的LB液体培养基中，37°C 200rpm摇菌12h，即得大肠杆菌DH5 α菌液；
[0038](3)用步骤⑴中配制好的LB液体培养基稀释待测蜂蜜得到蜂蜜浓度(体积百分含量)分布在100% -O%之间的多个检测样品，体积至2mL，再另取2mL蜂蜜和LB液体培养基分别作为蜂蜜浓度(体积百分含量)为100%和0%的检测样品，即得蜂蜜浓度为100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、0%的 11 个检测样品；
[0039](4)将步骤(2)得到的大肠杆菌DH5 α菌液20 μ L分别加入到2mL按步骤(3)方法配制好的检测样品中，37°C 200rpm摇菌16h混合均匀后，即得培养液样品；
[0040](5)用接种环分别挑取少许步骤(4)得到的培养液样品，分别接种在11个步骤(I)方法配制的同样的LB固体培养基上,37°C恒温划线培养16h ；
[0041](6)观察步骤(5)方法培养的各LB固体培养基上的菌落生长情况。
[0042]结果示于图1，蜂蜜浓度在0% -40 %的检测样品均出现菌落，蜂蜜浓度在50%-100%的检测样品均未出现菌落，表明该待测蜂蜜(HH)具有杀菌作用，不是人造蜂
處虫ο
[0043]另外，数据还显示无菌落生长的最低蜂蜜浓度为50%，将无菌落生长的最低蜂蜜浓度定义为该蜂蜜的最低杀菌浓度(体积百分含量)(minimum bactericidalconcentration，MBC)，则表明HH对大肠杆菌DH5 α的MBC为50%，该数据可作为鉴定该天然蜂蜜掺假程度的指标:已知本实施例的待测蜂蜜为天然蜂蜜，没有混入人造蜂蜜成分，得到的MBC值为50%，分别取等量的该天然蜂蜜，向其中分别加入不同量的人造蜂蜜(ΑΗ，人造蜂蜜是用果糖40.5g、葡萄糖33.5g、麦芽糖7.5g和蔗糖1.5g溶于17g去离子水中再经灭菌得到)，按照上述步骤(1)-(6)的方法找出各比例的混合蜂蜜的最低杀菌浓度(体积百分含量)(MBC)，结果如表1所示，可以看出天然蜂蜜和人造蜂蜜混合得到的混合蜂蜜的MBC均高于该天然蜂蜜本身的MBC值，因此可以利用这个原理来判断此种天然蜂蜜中掺入人造蜂蜜的程度，并以此数据作为评价蜂蜜真假的指标之一，MBC值越高，表明人造蜂蜜的掺入比例越高，MBC值越低，表明人造蜂蜜的掺入比例越低；在表1的情形下，当人造蜂蜜的掺入比例高于天然蜂蜜时，检测不出该混合蜂蜜的MBC值(即MBC值超过100% )。
[0044]表1混合蜂蜜的杀菌效果
[0045]
【权利要求】
1.一种鉴别天然蜂蜜和人造蜂蜜的方法，其特征在于，将由待测蜂蜜配成的蜂蜜浓度不同的检测样品分别与相同量的大肠杆菌DH5 a菌液混合后加入固体培养基中培养菌落，观察菌落是否能够在所述检测样品达到某一蜂蜜浓度后全部被杀灭；若检测样品达到该蜂蜜浓度后，菌落全部被杀灭，则该待测蜂蜜不是人造蜂蜜；当检测样品的蜂蜜浓度达到100 %菌落仍然存活，则该待测蜂蜜是人造蜂蜜。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述检测样品是将所述待测蜂蜜用无菌液稀释成不同蜂蜜浓度得到的。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述无菌液为无菌的LB液体培养基。
4.根据权利要求1-3任一所述方法，所述固体培养基为LB固体培养基，所述培养为在37 °C恒温培养16-29h。
5.根据权利要求1-4任一所述方法，其特征在于:所述方法，包括以下步骤: (1)配制LB液体培养基:含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，用水配制，混合均匀后高压灭菌，即得； 配制LB固体培养基:含胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉15g/L，用水配制，混合均匀后高压灭菌，60°C时倒板即得； (2)将大肠杆菌DH5a加入到按步骤(1)方法配制好的LB液体培养基中，37°C200rpm摇菌10_12h，即得大肠杆菌D H5 a菌液，其中所述大肠杆菌DH5 a与所述LB液体培养基的体积比为1:100 ; (3)用步骤(1)中配制好的LB液体培养基稀释待测蜂蜜得到蜂蜜浓度(体积百分含量)分布在100%-0%之间(不含端值)的多个检测样品，另取待测蜂蜜和LB液体培养基分别作为蜂蜜浓度(体积百分含量)为100%和0%的检测样品，即得多个不同蜂蜜浓度的检测样品； (4)将步骤(2)得到的大肠杆菌DH5a菌液分别加入到按步骤(3)方法配制好的检测样品中，37°C 200rpm摇菌16_20h混合均匀后，即得培养液样品，其中所述大肠杆菌DH5 a菌液与所述检测样品的体积比为1:100 ; (5)将步骤(4)得到的培养液样品接种在步骤(1)方法配制的LB固体培养基上37°C恒温培养16-29h ;优选37°C恒温培养16-20h ； (6)观察步骤(5)方法培养的菌落生长情况，菌落全部被杀灭的检测样品对应的最小蜂蜜浓度记为最低杀菌浓度，若该蜂蜜浓度数值小于100%，则该待测蜂蜜不是人造蜂蜜；若检测样品的蜂蜜浓度达到100%菌落仍然存活，则该待测蜂蜜是人造蜂蜜。
6.根据权利要求1-5任一所述方法，其特征在于:所述检测样品的蜂蜜浓度(体积百分含量)依次为 100%,90%,80%,70%,60%,50%,40%,30%,20%U0%,0%o
7.根据权利要求5所述方法:其特征在于:步骤(5)中是将步骤(4)得到的培养液样品接种在步骤(1)方法配制的LB固体培养基上划线培养。
8.根据权利要求5或7所述方法:其特征在于:步骤(5)中的恒温培养时间为16-20h。
9.一种鉴别人造蜂蜜的方法，其特征在于，将待测蜂蜜与大肠杆菌DH5 a菌液混合后加入固体培养基中培养菌落，然后观察菌落生长情况；若有存活菌落，则该待测蜂蜜是人造蜂蜜，否则，该待测蜂蜜不是人造蜂蜜。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述固体培养基为LB固体培养基，在37°C恒温培 养16_29h。
【文档编号】C12Q1/10GK103952460SQ201410175536
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】张成岗, 耿爱香, 王广舜, 徐向英, 李伟光, 李军怀, 韩恩崑, 杨志敏, 刘伯芬, 齐秀会, 刘英男 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所, 天津市宝坻区人民医院, 苏州科景生物医药科技有限公司