子组生物单元的选择性释放的制作方法

子组生物单元的选择性释放的制作方法
【专利摘要】提供了一种从包括在异质组生物单元中的子组生物单元的实体一个或多个成员单独释放的方法。该方法包括通过连接体将包括所述子组生物单元的所述组生物单元结合至所述实体。结合之后，确定在所述实体上的所述一个或多个成员的位置。一旦位置被确定，则就将局部物理脉冲施加至所述一个或多个成员。通过分离连接体，局部物理脉冲将一个或多个成员从实体单独释放。
【专利说明】子组生物单元的选择性释放

【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从包括在异质组生物单元中的子组生物单元的实体一个或多个成员单独释放的方法、一种通过检测从受试者获得的子组生物单元来检测所述受试者疾病的方法、以及一种将子组生物单元的一个或多个成员从一组生物单元中分离的方法。

【背景技术】
[0002]用于分析细胞生物学的现代技术已经创建了日益增加的制备由同质群体细胞或者检测或分离单个细胞或者小颗粒构成的样品的需求。基因组和蛋白质组的研究、遗传克隆、干细胞研究、以及基于细胞的筛选都将从增强的能力中获益，以获得单个细胞或小同质生物样品用于随后的分析。这些样品包括各种分子，比如DNA或RNA以及细胞或生物体。
[0003]在从混合群体中选择细胞的情况下，必须分析具有所需特征的各个细胞，之后识别和分离所需的子群。用于哺乳动物细胞的标准分类方法需要细胞分散在单细胞悬浮液中，并且采用以此方式自然生长的造血细胞是最成功的。这些方法不太适用于贴壁细胞，目前最常见的细胞表型。
[0004]通常，通过将贴壁细胞电镀在生长表面上然后使用显微镜寻找它们而对它们进行分析。用于将所关注的细胞与混合群体细胞分离的传统分选技术通常需要将贴壁细胞从它们的不利于细胞健康的生长表面酶或机械释放，或者涉及用于基于有限稀释或对选择性环境的基因工程抗性的选择的扩展协议。
[0005]分离提供适于下游分析的完好细胞或颗粒的异质群体的单个细胞或颗粒或其中的低数量的有效方法仍不见踪影。


【发明内容】

[0006]本发明提供了用于将适于下游分析和诊断的单细胞或颗粒分离的新方法。
[0007]提供了一种从包括在异质组生物单元中的子组生物单元的实体一个或多个成员单独释放的方法。该方法包括通过连接体将包括所述子组生物单元的所述组生物单元结合至所述实体。结合之后，确定在所述实体上的所述一个或多个成员的位置。一旦位置被确定，则就将局部物理脉冲施加至所述一个或多个成员。通过分离连接体，局部物理脉冲将一个或多个成员从实体单独释放。
[0008]一种通过检测从受试者获得的子组生物单元来检测所述受试者疾病的方法，其中，所述子组生物单元是表示此外所提供的疾病。该方法包括提供包含至少一个子组生物单元的异质组生物单元，该组生物单元从受试者获得，且该组生物单元中的每个成员通过连接体被结合至实体，最好是固体支承。确定在实体上的子组生物单元的位置。然后，将局部物理脉冲施加至所述一个或多个成员。通过分离连接体，局部物理脉冲将一个或多个成员从实体单独释放。然后收获子组生物单元的一个或多个成员。通过收获子组生物单元的一个或多个成员，分离子组生物单元的一个或多个成员。然后对于存在表示该疾病的至少一个标记，分析所收获的一个或多个成员。
[0009]公开了一种将子组生物单元的一个或多个成员从一组生物单元中分离的方法。该方法包括:
[0010]提供包括至少一个子组生物单元的异质组生物单元，该组生物单元中的每个成员通过连接体被结合至实体，最好是固体支承；以及
[0011]确定子组生物单元的所述一个或多个成员的位置；
[0012]将局部物理脉冲施加至所述一个或多个成员，其中，通过分离所述连接体，所述局部物理脉冲将所述一个或多个成员从所述实体单独释放；
[0013]分离子组生物单元的所释放的一个或多个成员。

【具体实施方式】
[0014]描述了一种从包括在异质组生物单元中的子组生物单元的实体一个或多个成员单独释放的方法。该方法包括:通过连接体将包括所述子组生物单元的所述组生物单元结合至所述实体；确定在所述实体上的所述一个或多个成员的位置；将局部物理脉冲施加至所述一个或多个成员，其中，通过分离所述连接体，所述局部物理脉冲将所述一个或多个成员从所述实体单独释放。
[0015]术语“单独释放”是指可以释放子组的一个或多个成员，而不释放另一子组的任何其他成员。在一实施例中，可以单独释放子组的单个成员，而不释放该子组或任何其他子组的任何其他成员。
[0016]“实体”是指子组生物单元所结合至的对象。在一实施例中，该实体是结合基体。在一实施例中，该结合基体是固体支承。下面将对固体支承的实施例进行进一步说明。
[0017]术语“子组生物单元的成员”涉及子组的单独的部分。在其中生物单元是细胞的实施例中，成员可以是单个细胞。在其中生物单元是病毒颗粒的实施例中，成员可以是单个病毒颗粒。在其中生物单元是大分子的实施例中，成员还可以是属于子组大分子的单个大分子。除了已经列出的实施例之外，生物单元还可以是细胞、细胞器、细胞组分的一部分，比如蛋白质核酸、受体、标记、代谢物等。任何一个所述生物单元的成员将据此得出。
[0018]术语“异质组生物单元”涉及其中不是所有成员都相同的组。组的一个或多个成员在至少一个特征方面不同于该组的其他成员。子组的一个或多个成员相同的话称为同质子组对象。例如，异质组生物单元可以是细胞，且该组可以包括不同的细胞类型，例如表达不同表面标记的细胞。在一实施例中，这样的表面标记可以具有特定子类型的细胞比如癌细胞的特征。
[0019]如上所述,包括子组生物单元的一组生物单元通过连接体结合至实体。该连接体是能够结合该组生物单元的成员和该组生物单元的成员所结合至的实体的结构。因此，连接体形成了成员与实体之间的连接，从而允许成员被结合至实体。此外，连接体被形成为使得其可以在施加物理脉冲时被分解成多个部分。然后，这使得可以从实体释放成员。下面对连接体的具体实施例作进一步说明。
[0020]在一实施例中，生物单元通过使用离心被固定在实体上。离心以足以允许细胞更迅速地接触实体而不会对细胞造成损害的速度进行。在一实施例中，细胞与实体直接接触。在另一实施例中，细胞与连接至实体的连接体接触。这种方法的优点在于可以更迅速地固定细胞。本文将对用于实施该方法的示例性装置进行说明。
[0021]在上述方法中，确定所述一个或多个成员的位置。所述一个或多个成员的位置的确定可以采用本领域技术人员所公知的任何合适的装置来完成。在一实施例中，该位置的确定通过采用显微镜、扫描显微镜或光学扫描仪观察来进行。在一实施例中，采用特别结合至子组生物单元的一个或多个成员的荧光染料使所述一个或多个成员可见，并且光学荧光显微镜可用来定位。在一实施例中，显微镜是具有照相机和扫描或定位平台的自动显微镜，自动基于一个或多个成员的染色或它们的形状等，使用自动图像处理来找到一个或多个成员的位置。限定一个或多个成员的位置的坐标列表然后被转移至控制单元，用于定位物理脉冲来释放一个或多个成员。在另一实施例中，显微镜是手动显微镜。操作者选择子组生物单元的一个或多个成员。子组生物单元的所选择的一个或多个成员的坐标列表被转移至控制单元，用于定位物理脉冲来释放一个或多个成员。
[0022]一旦确定子组生物单元的一个或多个成员的位置，则就将局部物理脉冲施加至要被释放的一个或多个成员。因此，可以精确地施加局部脉冲。在一实施例中，局部脉冲被施加至子组生物单元的单个成员。这具有的优点是，可以单独或共同地释放并收获子组生物单元的每个成员。
[0023]在一实施例中，物理脉冲选自光子光源、热源及布置。布置是光源或热源与其他部件例如自由空间光学、光纤、机械布置的组合。具体的实施例集中于光源、光纤耦合光源、包括在每个交叉处具有光发射元件带有可寻址像素的矩阵的阵列光源；或包括在每个交叉处具有电阻加热元件带有可寻址像素的矩阵的阵列热源。
[0024]在一实施例中，光子光源选自LASER、LED、气体放电灯、金属蒸汽灯、或者其他种类的热或非热光源。LASER的波长可能是可见或不可见的。光源的波长可以在UV、可见光或IR的范围内。LED可以是高功率LED。LED或高功率LED可能是可见的、不可见的或UV。
[0025]在一实施例中，热源选自红外LASER、红外LED或者高功率LED或电阻加热器。
[0026]在一实施例中，该布置可以选自聚焦光源、光纤耦合光源、阵列光源、带有用于产生光的可寻址像素的矩阵或带有用于产生热的可寻址垫的矩阵。
[0027]局部物理脉冲单独释放将通过分离连接体被释放的子组生物单元的一个或多个成员，从而允许所述成员从实体中分离。然后可以收获所释放的成员。
[0028]本文所描述的方法具有若干优点。在将生物单元比如细胞从实体释放之前可以对其进行分析、操纵及处理。该方法允许非特定地结合至实体，即所有成员可被结合，独立于其所属的子组。这使得可以按顺序地定位、释放和收获不同子组的成员，及在第一轮中，具有特征I的子组I的一个或多个成员被定位、释放和收获。之后，通过使用具有结合生物单元的相同实体，具有特征2的子组2的一个或多个成员可以被定位、释放和收获等。剩余的细胞还可以被进一步操纵和观察，并且在该操纵后或基于另一特征，子组生物单元的新的一组成员可以被观察、选择、释放及收获。
[0029]在一实施例中，可以采用本文所述的方法来选择、释放和收获单个的生物单元，比如细胞。还可以选择、释放和收获多个细胞或批量的细胞。
[0030]本文所述的方法的特别优点在于，由于用于分离连接体分子的物理脉冲可以被定位，所以可以采用显微镜、扫描显微镜或光学扫描仪观察成员，单独地选择和分离。
[0031]由于精确的定位和分辨率，并且由施加物理脉冲的短时间，一个或多个成员的收获应该提供闻纯度。
[0032]通过使用例如流动、重力、光镊、机械或磁力、微移液器或操纵器，收获可以包括用于下游分析的进入收集容积的细胞的收集。这样的装置对本领域技术人员来说是公知的。
[0033]采用本方法，可以实现在实体上的生物单元的高组装密度，由于因减少浪费区域的物理脉冲的精确定位。
[0034]由于同样的连接体分子用于结合所有的生物单元，所以可以获得高产，独立于成员所属的子组。
[0035]本方法的一个特别的优点是，由于用于释放成员的平缓的方法，可以获得高细胞完整性。不会施加可能损害生物单元的划痕或高力。生物单元的生理环境在成员的处理和收获过程中保持不变。这保存所收获的生物单元的完整性。进一步的优点是，子组生物单元的一个或多个成员可以被收获得比使用其它机械方法要快得多，特别是如果必须释放大量细胞的话。
[0036]通过本文描述的方法所收获的一个或多个成员可以被直接送入下游分析，而不需要复杂的洗涤程序或附加的处理。此外，还不能污染可能影响生物单元完整性的环境液体。
[0037]在使用热脉冲代替光脉冲的情况下，优点在于，对可用于定位要被释放并收获的生物单元的一个或多个成员的荧光染料的光学性能没有干扰。此外，如果使用热脉冲，则在光学检测时对结合生物单元没有干扰。
[0038]在一实施例中，光脉冲与试剂的组合可以用来释放生物单元的一个或多个成员。这将允许在不存在试剂而不会影响结合至实体的情况下光学检测这些成员。然后，在存在试剂的情况下，将会出现子组生物单元的一个或多个成员的释放。在一实施例中，该试剂是光酸产生剂。
[0039]根据本发明，生物单元通过连接体结合至实体。连接体可以是任何合适的域(domain), (i)能够将生物单元结合至实体，以及(ii)能够采用物理脉冲来释放子组生物单元的一个或多个成员。连接体的选择将取决于(i)生物单元的种类，(ii)实体，以及(iii)用于释放子组生物单元的一个或多个成员的物理脉冲。本领域技术人员要知道用于将化学化合物、核酸、蛋白质、细胞、细胞器或其他生物单元连接至实体的不同方案。连接体可以共价或非共价地结合至实体。可以实现连接至实体的表面，如本文所公开。用于结合生物单元的连接体可以在结构上相同或不同。在一具体实施例中，所述连接体是相同的。
[0040]连接体可以根据用于释放子组生物单元的一个或多个成员的物理脉冲来限定。连接体可以包括:
[0041](i)光子可裂解部分，用于由从光源产生的物理脉冲释放；
[0042](ii)热可裂解部分，用于由从热源产生的物理脉冲释放；
[0043](iii)连接体的一部分，其可由电荷激活，以及光敏感试剂，其在由光激活时产生然后激活连接体的电荷。在本实施例中，由光脉冲所触发的分离不会发生在加入试剂之前。
[0044]在一实施例中，连接体包括部分a和部分b，其中，在将该组生物单元结合至实体的过程中部分a结合部分b，并且部分a在施加局部物理脉冲时与部分b分离。因此，部分a和部分b是包括在连接体分子中的结合配体。取决于部分a和部分b的性质以及它们的结合机理，部分a通过特定类型的物理脉冲与部分b分离。在一实施例中，部分a通过由物理脉冲产生的热与部分b分离。在一实施例中，部分a在被结合的成员的位置在高达50°C的温度与部分b分离。本实施例的优点在于，不会损害被释放的生物单元的成员。这是如果生物单元是活细胞的特别情况。在一实施例中，所述部分a通过光子引起的构象变化与部分b分离。
[0045]在一实施例中，所释放的一个或多个成员在释放后被收获。然后，所收获的一个或多个成员可以经受特定的处理或分析。在收获从实体释放的一个或多个成员之后，进一步的一个或多个成员从实体释放。进一步的一个或多个成员可以属于相同的子组，或者它们可以属于通过连接体结合至实体的不同的子组生物单元。
[0046]在一实施例中，该组生物单元是包括子组细胞的异质组细胞。细胞的一个或多个成员在至少一个特征方面不同于细胞的另外一个或多个成员。因此，一子组细胞也在至少一个特征方面不同于另一子组细胞。在一实施例中，子组细胞包括一个或多个成员，其中所述一个或多个成员是稀有细胞。稀有细胞是在异质组细胞内低频出现的细胞。异质组细胞内的稀有细胞的比例为至多5%。在一具体实施例中，该比例为1%。在进一步的具体实施例中，该比例为至多0.1%。在进一步的具体实施例中，该比例为至多0.01%。该方法特别用于识别和收获稀有细胞，因为该方法允许识别单个细胞，并且从异质组细胞释放这些单个细胞，随后收获以及进一步分析。稀有细胞可以是癌细胞。在一实施例中，稀有细胞可以是循环肿瘤细胞。在另一实施例中，稀有细胞可以是在患者血液中的循环肿瘤微栓子。通过使用本方法来识别稀有肿瘤细胞，可以在肿瘤本身可通过标准装置检测很早之前检测出肿瘤，并且患者可以在非常早的阶段得到治疗，从而提高存活率。另外，通过使用此方法，还可以监测治疗的进展。此外，可以分析肿瘤细胞的类型。
[0047]在一实施例中，在所述组细胞中，同质子组细胞对总细胞的比例为至多50%，尤其是在5%至50%的范围内，特别是在10%至30%的范围内。该方法可用于检测更大子群的细胞，例如特定类型的细胞比如特定的血细胞。
[0048]在该方法的一实施例中，子组细胞表不疾病。在一实施例中，所述疾病是癌症。在一实施例中，所述子组包括一种类型的细胞。
[0049]癌细胞的特征在于特定的标记。可提及的示例是:特别是致癌基因和肿瘤抑制基因比如 p53, ras 家族基因 erb-B2, c-myc, mdm2, c-fos, DPC4, FAP，nm23, RET, WTl 等，LOHS,例如关于p53，DCC，APC，Rb等，以及遗传性肿瘤中的BRCAl和BRCA2，MSH2，MLHl，WTl等的微随体不稳定性；以及肿瘤的RNA比如CEA，细胞角蛋白，例如CK20，BCL-2, MUC1，特别是本文的具体肿瘤的结合变体，MAGE3, Muc 18,酪氨酸酶，PSA, PSM, BA46, Mage-1等，要不然就是形态的 RNA 比如 maspin, hCG，GIP, motilin, hTG，SCCA-1, AR，ER，PR，各种激素等；此外，特别是影响转移性更新的RNA和蛋白，即涉及血管生成、运动性、粘附性以及基质降解的表达分子，比如 bFGF，bFGF-R, VEGF, VEGF-R 比如 VEGF-Rl 或 VEGF-R2，E-钙粘蛋白(cadherin)，整合素(integrins),选择素(selectins), MMP, TIMP, SF, SF-R等,细胞周期分布或扩散分布，比如细胞周期蛋白(cyclins)(例如，细胞周期蛋白D，E和B的表达比)，Κ?67, pl20, p21，PCNA 等,或凋亡更新，比如 FAS (L+R), TNF (L+R),穿孔素(perforin),粒酶(granzyme) B,BAX, bcl-2,胱天蛋白酶(caspase) 3 等。
[0050]还可以针对另一种疾病。
[0051]可替代地，子群细胞包括一种细胞类型。例如，这些细胞可以是心血管细胞或血管细胞或由炎症过程所释放的血管细胞，或者胎儿细胞，例如母体血液中的胎儿细胞，干细胞(例如癌性干细胞)，表示微小残留疾病的细胞，癌细胞(比如白血病细胞)，白血细胞。在本上下文中，该方法可以用于基因分型、诊断、预后，监控治疗等。
[0052]在本方法的一实施例中，连接体包括寡核苷酸，其中部分a是第一寡核苷酸，部分b是部分地互补于第一寡核苷酸序列的第二寡核苷酸。
[0053]在一实施例中,连接体的部分b包括标记物b,其中所述实体涂有用于所述标记物b的结合配体(bpb)。因此,连接体的部分b可以结合至在实体上的结合配体bpb来固定连接体和生物单元。在一实施例中，标记物b是生物素，结合配体bpb是抗生物素蛋白。对于本领域技术人员来说，可以用于将连接体的部分b结合至实体的进一步的结合配体对是熟知的。
[0054]在所述连接体的一实施例中，连接体包括能够结合该子组的成员的细胞结合部分。此细胞结合部分应非特定地结合至成员。这确保没有特定子组生物单元的选择。该细胞结合部分在部分a与部分b分离时与部分b分离。因此，该细胞结合部分与连接体的部分a相关联。在一实施例中,连接体的细胞结合部分与连接体的部分a共价地相关联。这种实施例的示例示于图2b)中。在另一实施例中，细胞结合部分通过非共价结合与部分a相关联。在一具体实施例中，细胞结合部分包括标记物c,部分a包括标记物a。在该实施例中，标记物c和标记物a能够将结合配体bpa非竞争性地结合。这种实施例的示例示于图2a)中。bpa和bpb可以是相同类型的结合配体。然而，在一实施例中，部分a和c的标记物不同于部分b的标记物。在该实施例中，用于部分a和c的标记物的结合配体bpa不同于部分b的标记物的结合配体bpb。
[0055]在一进一步的实施例中，所述连接体包括细胞连接体，其包括能够以非竞争性的方式结合至部分a的结合配体的标记物。该细胞连接体还包括能够结合生物单元的生物单元结合部分。
[0056]因此，在一具体实施例中，连接体被设计成如图3所示。
[0057]连接体的可分离部分是部分a与部分b，如本文所述。
[0058]目前，可在连接体中用作标记物的许多亲和标记物是公知的。通常根据尺寸将这些分成3类:小标记物最多具有12个氨基酸，中等尺寸的标记物最多具有60个，大标记物具有60个以上。小标记物包括Arg-标记物、His-标记物、Strep-标记物、FLAG标记物、T7-标记物、V5-肽标记物、c-Myc-标记物，中等尺寸的标记物包括S-标记物、HAT-标记物、钙调蛋白结合肽、几丁质结合肽以及一些纤维素结合域。后者可以包含多达189个氨基酸，且然后同GST-和MBP-标记物一样被看作大亲和标记物。
[0059]可能的标记物和结合配体对包括但不限于生物素-抗生物素蛋白或链霉亲和素。进一步的示例性成对标记物和标记物结合配体包括:
[0060]6xHis/ 六-His 抗体
[0061]5xHis/ 五-His 抗体
[0062]RGSHHHH/RHS-His 抗体
[0063]4xHis/ 四-His 抗体
[0064]GST-标记物/GST-标记物抗体
[0065]链球菌标记物/链霉亲和素
[0066]生物素/链霉亲和素
[0067]GST-标记物/GST抗体
[0068]Flag-标记物(例如DYKDHK或DYKDDD) /Flag-标记物抗体
[0069]此外，可以使用半抗原及相应的抗体。半抗原是用于许多分子生物学应用中的具有高免疫原性的小分子。流行的半抗原包括地高辛DNP (二硝基苯酚)、生物素以及荧光素。
[0070]本发明进一步涉及一种通过分离和分析从受试者中所获得的子组生物单元来检测所述受试者的疾病的方法。该方法包括提供包含至少一个子组生物单元的异质组生物单元，所述组生物单元从受试者获得，且该生物单元的每个成员通过连接体结合至实体，最好是固体支承。此外，该方法包括确定所述子组生物单元的位置。一旦位置被确定，则该方法就包括将局部物理脉冲施加至所述一个或多个成员，其中所述局部物理脉冲通过分离所述连接体来将所述一个或多个成员从所述实体单独释放。从实体释放的子组生物单元的一个或多个成员被收获，从而分离子组生物单元的所述一个或多个成员。对于表示疾病的至少一个标记来说，分析子组生物单元的所收获的一个或多个成员。本文描述了用于此类标记的示例。
[0071]在一具体实施例中，所述疾病是癌症。然而，该疾病还可以是另一种疾病，其特征在于至少在疾病的早期阶段存在稀有细胞。
[0072]可以以各种方式从受试者获得该组生物单元。它们可以在样品的形式被获得。“样品”指的是怀疑含有子组生物单元的一些材料。如本文所用，该术语包括标本(例如活检或医学标本)或培养物(例如微生物培养物)。样品可以是液体、固体(例如粪便)或组织。样品可以包括取自患者的材料，包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊髓液、胸膜液、乳汁、淋巴液、痰、精液、针吸出物等。就人的样品或组织样品或患者样品或患者细胞或组织样品或标本来说，每个指的是从受试者或患者的组织所获得的相似或生物或生物化学的化合物的集合。组织样品的来源可以是固体组织，以及来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品或活检或吸出物；血液或任何血液成分；体液比如脑脊髓液、羊水、腹膜液、或间质液；或者来自在受试者的怀孕或发育中的任何时间的细胞。组织样品可以含有在性质方面不与组织自然混合的化合物，比如防腐剂、抗凝血剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等。例如，生物单元可以是细胞或其部分、细胞成分比如特定的蛋白质、核酸、受体、标记、代谢产物等、组织或器官的一部分，等等。
[0073]例如可以通过从受试者抽取体液样品来获得样品。血浆可以由血液制备。白细胞或其它血细胞成分比如淋巴细胞可以与从受试者所抽取的血液分离。
[0074]上述方法涉及一种通过检测表示疾病的子组生物单元来检测受试者疾病的方法。通常已知的是，体的生物单元表示该体的疾病。本文给出了众多的示例。因此，这些单元(例如特定的细胞、蛋白质、核酸、小分子化合物等)的检测表示疾病。
[0075]受试者可以是哺乳动物，更具体地是人或动物。
[0076]与生物单元通过连接体而被结合至的固体支承分离并且在分离之后被收获的子组生物单元可被进一步处理以确定其是否表示疾病。在一实施例中，可以分离生物单元的子成分。作为示例，如果该生物单元是细胞，则通过本领域人员所熟知的方法，比如免疫测定、PCR或其它扩增方法比如TMA、LCR、NASBA等、质谱法等，可对子组细胞的成分比如核酸或蛋白质或激素或其它分子进一步分析，以便确定它们是否表示疾病。
[0077]在一实施例中，对于表示疾病的至少一个标记来说，所收获的且由此分离的子组生物单元的一个或多个成员被分析。这种标记可以是对于在疾病中上调或下调所公知的核酸，或者它们可以是蛋白质或包含在子组生物单元的一个或多个成员中的其它成分。
[0078]在本发明的另一方面，提供了一种将子组生物单元的一个或多个成员与组生物单元分离的方法。该方法包括提供包含至少一个子组生物单元的异质组生物单元，该组生物单元的每个成员通过连接体结合至实体，优选的是固体支承。其还包括确定子组生物单元的所述一个或多个成员的位置。在确定位置后，其包括将局部物理脉冲施加至所述一个或多个成员，其中所述局部物理脉冲通过分离所述连接体，随后通过分离子组生物单元的一个或多个成员，来将所述一个或多个成员从所述实体单独释放。
[0079]该方法的进一步的具体实施例如本文所限定。
[0080]本文所用的术语“分离”指的是所分离的一个或多个成员从而与剩余的细胞分离。在本发明的具体实施例中，将子组对象与一组对象分离的方法进一步限定成在根据本发明的将子组对象与固体支承特别释放的方法的上下文中如上所述。可以加入对本领域技术人员来说所公知的额外的分离步骤。
[0081]还公开了一种在其中可以执行本文所述的方法的装置。这种装置包括由至少一个透明板所创建的具有一定宽度和长度的浅腔体。在一实施例中，所述板是玻璃板。该装置的腔体的深度可以是固定的，或者其可以由可移动的盖来调节。在一实施例中，根据所要求的表面来选择透明板的尺寸。在另一实施例中，该尺寸是标准化的尺寸，比如标准显微镜载片的或SBS标准多孔板的尺寸。腔体的深度可以在从几十个微米至数个毫米的范围内变化。在一实施例中，该深度在10微米与I毫米之间。在更具体的实施例中，该深度在50微米与I毫米之间。在进一步的具体实施例中，深度在大于50微米与小于I毫米之间。在更具体的实施例中，深度约为100微米。此深度的优点在于，对结合至连接体的细胞进行优化，连同所优化的细胞分布均匀性和所优化的沉降时间及所优化的消耗体积一起。这对于优化染色所需的以识别细胞的试剂的量特别有用。在一实施例中，该深度是可调节的。这具有其可根据特定的应用来进行选择的优点。
[0082]在一实施例中，该装置还包括在入口和出口的于板的宽度上的一个或多个通道。这些通道允许腔体的均匀流动分布和填充，而不封闭气泡。均匀的流动分布增强细胞的染色和洗涤。
[0083]腔体、透明板和通道可以封闭在具有侧壁和上下壁的模块中，存在两个或更多个流体端口，至少一个在腔体通道的每一侧，用于通过沿表面及自模块的腔体将液体、染色流体、试剂和乳剂或细胞悬浮液添加到通道中。可以选择这些端口的不同格式，比如流体通过其可以用针或连接管来吸取的开放端口、隔片。为了填充离心，可以使用移液或泵。为了离心，入口连接端口需要具有足够的体积，以在离心过程开始之前包含最初所移液的体积。可以通过光学扫描仪或显微镜物镜接近光学透明板来识别子组生物单元。
[0084]在另一实施例中，室的盖可被去除以机械地接近。
[0085]下面的非限制性示例说明了本发明的某些实施例。
[0086]示例
[0087]图1示出了通过连接体(3)而被结合至实体(2)的细胞(I)的示意图。
[0088]图2示出了用于将物理局部脉冲施加在连接至基体(2)的细胞上的布置(24、24a)的阵列(20)。阵列(20)可以包括导线(22)和交叉(23)，具有用于温度脉冲的电阻加热元件(24 )、或用于光脉冲的位于每个交叉(23 )的光元件(24a)。接触垫(25 )连接至用户或计算机控制的电源，以便施加所需的电功率。
[0089]图3a)和b)示出了结合至细胞(I)和实体(2)的连接体(3)的两个不同实施例。图3a)中的连接体(3)包括带有标记物b (9)的部分(8)。标记物b (9)与结合配体bpb(10)相关联。结合配体bpb (10)连接至实体(2)。连接体(3)还包括与部分b (8)相关联的部分a (7)。部分a (7)包括标记物a (12)。标记物a (12)结合至结合配体bpa (14)。结合至细胞(I)的细胞结合部分(I I)包括标记物c (13)。标记物c (13)还结合至结合配体a (14)。图3b)示出了连接体(3)的另一实施例。部分b (8)包括结合至结合配体bpb
(10)的标记物b (9)。结合配体bpb (10)结合至实体(2)。部分b (8)与部分a (7)相关联。部分(7)包括结合至细胞(I)的细胞结合部分(11)。
[0090]图4示出了用于在图3a)中所示的示例性实施例的部分a和部分b的分离的过程。相同的原理应用于图3b)所示的示例性实施例。
[0091]图4a)示出了结合至细胞(I)和实体(2)的图3a)的相同的连接体(3)。热(15)被施加至部分a (7)和b (8)。这导致在图4b)中所示的连接体(3)的部分a (7)和部分b (8)的分离。结果，细胞(Ia)从实体(2)释放。
[0092]在图5中，部分a (7)和部分b (8)通过来自光源(16)的光脉冲(36)分离，导致细胞(Ia)的脱离。
[0093]图6示出了通过物理脉冲(36)来单独分离细胞(I)的示意图。a)通过使用聚焦光源(16)将物理脉冲(36)施加到细胞(I)上。b)细胞(Ia)被选择性地且单独地释放，然后可以通过液体(18)的流动(17)而被收获。
[0094]图7示出了其中在光脉冲(36)后通过使用移液设备(19)(图7a))来移除被选择性地释放或分离的细胞(Ia)的实施例，该移液设备允许分配包括要被分配到新表面或容器(2a)上(图7b))的分离的细胞(Ia)的被抽吸的液体(18a)。然后可以对分离的细胞(la)作进一步分析，例如通过确定特别用于待测试的疾病的至少一种标记是否存在于分离的细胞(Ia)中。
[0095]图8a)示出了其中磁性粒子(26)与部分a (7)相关联且随分离的细胞(la)—起分离的实施例。然后通过使用磁铁(27)(图8b))可以收获被释放的或分离的细胞(la)。
[0096]图9是流过室(30)的实施例，其包括承座(31)、显微镜载片(32)和用于承受液体
(18)的隔室(33)、用于将液体(18)添加至隔室(33)的入口(34)以及用于从隔室(33)除去液体(18 )的出口( 35 )。每个隔室(33 )由密封件(21)包围，以确保液体(18 )只能流过入口(34)和出口(35)。
[0097]图10是离心室(40)的实施例。离心室(40)适于将生物单元(I)固定在实体(2)上。实体(2)可以包括生物单元(I)所连接至的连接体(3)，如图1所示。室(40)包括流体入口端口(41)。液体(18)可以通过流体入口端口(41)而被添加至室(40)。室(40)还包括用于均匀流动分布(42)的通道。液体(18)从流体入口端口(41)流过用于均匀流动分布(42)的通道。室(40)包括主室(43)。通过允许包括细胞(I)的液体(18)至流体入口端口(41)并且允许其流过用于均匀流动分布(42)的通道至主室(43)，生物单元(I)比如细胞
(I)可被添加至主室(43)。室(43)还包括下部透明板(44)，其用作基座和构成主体的上部支架(45)。这种设计的优点在于，包括细胞(I)的液体(18)可以均匀地流入主室(43)。下部透明板(44)可以用作用于固定细胞(I)的基体(2)。在一具体实施例中，主室(43)的深度的变化范围为从10微米至5毫米。在一更具体的实施例中，主室(43)的深度在50微米与150微米之间。主室(43)的深度的最具体的实施例是100微米。由此，细胞分布是最佳的。所公开的室具有的优点在于，确保了可重现、完全均匀的填充，而没有气泡。
[0098]图11示出了室(40)的分解视图。流体入口端口(41)还可以用作出口端口。室
(40)包括高度可调盖(46)。入口端口(41)形成在该高度可调盖(46)中。插入件(48)安装在盖(46)上。插入件(48)包括盖密封件(47)和形成在插入件(48)的底部中的用于均匀流动分布(42)的通道。当组装时，插入件(48)被装配到形成主通道壁(45)的支座中。主室(43)(未示出)的下壁由底板(44)形成。组件安装在底座(49)上。
[0099]在将细胞(I)固定在底板(44)上后，可以去除室(40)，并且固定的细胞可以通过选择性的物理脉冲或如本文所述的其它适当的方法被单独地释放。
[0100]离心可以用来填充室。其还可以用来促进将细胞结合至表面(不论是否具有连接体化学)，加速沉降时间，并且可用于促进释放和输送所选择的、分离的细胞。在本文所述的方法的一实施例中，通过连接体将包括所述子组生物单元的所述组生物单元结合至所述实体通过离心而得以促进。在一具体实施例中，离心是在如本文所述的室中进行的。在一实施例中，所分离的生物单元的收获通过在如本文所述的室中的离心而得以促进。
[0101]示例1:可热裂解的分子
[0102]通过使用可热裂解的分子，实验示例示出了该方法的可行性。为了容易分析可行性的目的，所使用的连接体分子包括染料。该染料对于本方法不是必需的。
[0103]在该示例中的分离基于包含在连接体中的两个杂交的寡核苷酸的变性。变性温度取决于寡核苷酸的设计，并应当高于环境温度以确保稳定的结合且低于细胞可能会被损坏或颗粒分离的温度。在一具体实施例中，连接体的寡核苷酸的变性温度在35°C与50°C之间。对于某些应用来说，如果寡核苷酸不是自杂交的，则其可能是有利的。
[0104]如果使用IR光源来产生热脉冲，则波长应该适于通过高吸收系数来加热液体。在水溶液的情况下，应该使用SOOnm以上的光源。在一具体实施例中，波长接近当地吸收最大值(例如1470毫米、1550纳米、1900纳米、2870纳米)。
[0105]在该示例中所使用的连接体分子是可以彼此杂交的两种寡核苷酸。分子Sll标记有绿色荧光染料并且具有序列5’(CY3)-TTT-GCGAAGCGAAGCGTTTTTTTT-3’-(TEG-生物素)。分子S12标记有红色荧光染料并且具有序列5’ (ATT0647N) -TTT-CGCTTCGCTTCGCTTTTTTTT-3’(TEG-生物素)。实体是涂有抗生物素蛋白的载玻片(Arraylt Corp, Sunnyvale, USA)。流室连接在载玻片上，用于起作用和培养。荧光扫描仪用于载片成像。
[0106]实验Ia):分子与实体之间的结合的稳定性
[0107]对形成在分子Sll与涂有抗生物素蛋白的载玻片、以及分子S12与涂有抗生物素蛋白的载玻片之间的结合的稳定性进行了测试。
[0108]分子S12以1uM PBS,0.05% Tween-20和IM NaCl在42°C下培养在涂有抗生物素蛋白的载玻片上达60分钟。带有所结合的分子S12的涂有抗生物素蛋白的载玻片通过采用PBS，0.05% Tween-20冲洗而被洗涤。测量红色荧光。为了测试结合的稳定性，带有所结合的分子S12的涂有抗生物素蛋白的载玻片在55°C的温度下通过采用PBS洗涤而被加热，随后检测红色荧光染料。确定没有减少荧光，表明由于连接体与涂有抗生物素蛋白的玻璃表面之间的稳定结合，加热和洗涤没有去除连接体。
[0109]分子Sll以1uM PBS,0.05% Tween-20和IM NaCl在42°C下培养在涂有抗生物素蛋白的载玻片上达60分钟。带有所结合的分子Sll的涂有抗生物素蛋白的载玻片通过采用PBS，0.05% Tween-20冲洗而被洗涤。测量绿色荧光。为了测试结合的稳定性，带有所结合的分子11的涂有抗生物素蛋白的载玻片在55°C的温度下通过采用PBS洗涤而被加热，随后检测绿色荧光染料。确定没有减少荧光，表明由于连接体与涂有抗生物素蛋白的玻璃表面之间的稳定结合，加热和洗涤没有去除连接体。
[0110]示例Ib):热去除分子
[0111]分子S12以1uM PBS,0.05% Tween-20和IM NaCl在42°C下培养在涂有抗生物素蛋白的载玻片上达60分钟。带有所结合的分子S12的涂有抗生物素蛋白的载玻片通过采用PBS，0.05% Tween-20冲洗而被洗涤。
[0112]分子Sll以1uM PBS,0.05% Tween-20和IM NaCl在42°C下培养在带有所结合的分子S12的涂有抗生物素蛋白的载玻片上达60分钟。带有杂交的分子S12和Sll的涂有抗生物素蛋白的玻璃表面通过采用PBS，0.05% Tween-20冲洗而被洗涤。在该点测量红色和绿色荧光。然后，通过采用PBS，0.05% Tween-20冲洗，由加热带有连接体的载玻片来测试分子Sll的分离的去除。再次测量红色和绿色荧光。65%至70%的分子Sll从载玻片去除，同时可以检测到没有去除分子S12。
[0113]示例2:在没有空间分辨率的情况下去除荧光珠
[0114]连接体和实体如在示例I中所述。突光珠从Spherotech Inc., lakeForest, USA(TFP7052-5)获得。它们的直径为7至8微米，并且涂有生物素和荧光黄染料。使用如在图9中所示的流动室，连同光学荧光显微镜和采用均匀载片加热的电阻加热一起，即完整的载片被均匀地加热。
[0115]分子S12固定在如示例I中所述的载玻片上。通过以1uM PBS,0.05% Tween-20和IM NaCl在42°C下达60分钟，随后采用PBS，0.05% Tween-20冲洗，加入生物素用于在涂有抗生物素蛋白的载玻片上的结合位点的饱和。分子Sll以1uM PBS,0.05% Tween-20和IM NaCl在42°C下培养在带有所结合的分子S12的涂有抗生物素蛋白的载玻片上达30分钟。接着是在室温下培养达30分钟，随后采用PBS，0.05% Tween-20冲洗。通过以1uMPBS,0.05% Tween-20在室温下培养达30分钟，随后采用PBS，0.05% Tween-20冲洗，抗生物素蛋白结合到联接至分子Sll的生物素。然后，将生物素涂覆的荧光珠结合至所稀释的抗生物素蛋白，以0.lw/v%，通过在室温下在黑暗中培养达30分钟，随后采用PBS，0.05%Tween-20 冲洗。
[0116]在采用50mm/s冲洗且没有加热的前后进行成像。可以检测到没有去除。结合至载玻片的珠的数量保持不变(+/-6 % )。
[0117]成像同样是在冲洗前后进行，同时加热室中的液体达60°C和70°C。荧光珠的去除率为40%至60%，余下的珠被均匀地分布。直接结合至玻璃表面而无需连接分子的珠以100mm/s的冲洗速度和加热至超过60°C而保留在表面上。
[0118]加热温度是在热源附近的温度。希望在生物单元附近的温度较低。
[0119]示例3:在具有空间分辨率的情况下去除荧光珠
[0120]连接体分子Sll和S12、实体如在示例I中所述。荧光珠如在示例2中那样。设置包括如在示例2中的流动室和光学荧光显微镜。然而，比如图2中所示的局部电阻加热元件布置在流动室中，用于施加在载片上的局部加热脉冲。在该实验中，我们使用了单一的加热结点，代替加热元件阵列。
[0121]涂覆和杂交以及结合的过程如在示例2中所述。
[0122]在采用50mm/s冲洗且没有加热的前后进行成像。可以检测到没有去除。结合至载玻片的珠的数量保持不变(+/-6 % )。
[0123]成像在以100mm/s冲洗且至1.5W达30秒的局部加热脉冲的前后进行成像。在热源附近的珠被完全冲走，同时位于进一步远离热源的珠保持结合。热源周界内的所有珠被去除。直接结合至玻璃表面而无需连接分子的珠以100mm/S的冲洗速度并加热至1.5W达60秒而保留在表面上。
[0124]示例4:可光子裂解的连接体分子
[0125]代替使用具有可由热脉冲分离的部分a和部分b的连接体，部分a和部分b可以是可由光子裂解的分子。用于裂解这种连接体的适当光源取决于连接体的设计。分离波长的范围为从低于450纳米的可见光至低于200纳米的UV。具体的范围是280至350纳米和/或360至450纳米。通过连接体而结合至实体的生物单元的去除由离开连接体分子的光脉冲触发。这样的可光裂解的连接体的一示例示出在B1conjugate Chem.，Voll5, N0.5，2
004,pagel033, Scheme2:Photolysis of SSTN 中。在该示例中，297 纳米的 UV 光脉冲裂解分子SSTN。可光裂解的合适分子的其它示例公开在W02011/058721中。
[0126]不例5:依赖电荷的固定和米用光脉冲与试剂的结合释放
[0127]在本实施例中，分离过程必须首先由试剂激活，随后由光脉冲触发。在第一步骤中，该方法涉及采用阳离子连接体分子来培养细胞，以将电荷提供给细胞表面。然后，将细胞固定在带电表面(玻璃或改性的玻璃表面)上。随后进行细胞的分析、处理及选择。
[0128] 为了去除单个细胞，首先加入光酸产生剂作为激活试剂。然后，光脉冲(UV)被施加至所选的细胞。由此，光酸产生剂产生补偿表面电荷的电荷且从而降低结合力。局部光脉冲产生允许细胞选择性释放的离子浓度方面的局部变化。用于激活可光裂解的部分的光源的波长范围为从低于460纳米的可见光至低于200纳米的UV ;特定的范围是230至460纳米。
【权利要求】
1.一种从包括在异质组生物单元中的子组生物单元的实体一个或多个成员单独释放的方法，包括: -通过连接体将包括所述子组生物单元的所述组生物单元结合至所述实体， -确定在所述实体上的所述一个或多个成员的位置， -将局部物理脉冲施加至所述一个或多个成员，其中，通过分离所述连接体，所述局部物理脉冲将所述一个或多个成员从所述实体单独释放。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述确定通过采用显微镜、扫描显微镜或光学扫描仪观察来进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述连接体包括部分a和部分b，其中，所述部分a在将组生物单元结合至实体的过程中结合所述部分b，并且所述部分a在施加局部物理脉冲时与所述部分b分离。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述局部物理脉冲选自光子光源、热光源或其他布置。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述部分a通过由所述物理脉冲产生的热与部分b分离。
6.根据权利要求3 或4所述的方法，其中，所述部分a通过光子引起的构象变化与部分b分离。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述部分a在被结合的成员的位置在高达50°C的温度与部分b分尚。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个成员在释放后被收-M-犾。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，在收获所述一个或多个成员之后，进一步的一个或多个成员从所述实体释放。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述组生物单元是包括子组细胞的异质组细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述子组细胞包括一个或多个成员，其中，所述一个或多个成员是稀有细胞。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述子组细胞是 -表示疾病，或 -由一种类型的细胞构成。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述连接体分子包括寡核苷酸，其中，部分a是第一寡核苷酸，部分b是部分地互补于第一寡核苷酸序列的第二寡核苷酸。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，连接体的部分b包括标记物，并且其中，所述实体涂有用于所述标记物的结合配体。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，所述的通过连接体将包括所述子组生物单元的所述组生物单元结合至所述实体通过离心而得以促进。
【文档编号】C12N5/00GK104130968SQ201410177875
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2013年5月1日
【发明者】J.布兰德-梅尔, C.彻鲁比尼, A.德雷克斯勒, N.格沃德, M.科普, E.奥斯特布罗克, E.萨罗菲姆 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司