用于快速鉴定小麦主效抗病害基因的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于快速鉴定小麦主效抗病害基因的方法，包括下述步骤：1)利用小麦苗期分小种鉴定和抗病基因分子检测筛查抗病基因的存在性；2)在步骤1的基础上，结合小麦成株期抗病表型进行对比验证。本发明公开的鉴定方法将小麦品种的宏观表型和微观检测相结合，能够有效确定小麦品种的抗病性。
【专利说明】用于快速鉴定小麦主效抗病害基因的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及小麦抗病害基因的准确鉴定，属于生物育种和农业生物学领域。
【背景技术】
[0002]小麦条锈病、白粉病等是常见的小麦病害，近年来各种常见小麦病害在我国的发生有不断上升趋势，成为影响我国小麦生产可持续发展的限制因素。对于常见的小麦病害，种植抗病的小麦品种是控制最经济、有效和环保的方法。在这种情况下，小麦品种(系)抗病性水平和携带何种抗病基因，决定着其育种价值和生产利用价值，对小麦安全生产有着
重要影响。
[0003]因此，建立小麦品种(系)抗病害及其相关基因(例如抗条锈性及抗条锈基因)的规模化鉴定技术体系，快速地评价小麦品种(系)抗病害水平并准确分析其抗病基因型，不仅可以避免抗条锈基因资源的浪费，而且对有效评估新品系生产利用价值和开展抗病基因合理布局也具有重要意义。 [0004]目前，对小麦抗病害的鉴定主要包括如下几种方法:
[0005]1.对小麦材料进行田间表型鉴定是当前最普遍的鉴定方法，这种方法可以直观地发现小麦材料的农艺性状以及抗病性好坏，但客观表型并不能反映抗病的本质属性。
[0006]2.利用常规杂交分析的方法评价材料抗病性，该方法通常是将抗病材料与感病材料杂交后得到的Fl代、F2代、F3代以及回交的BCl代，菌系接种对其进行抗病性鉴定。这种常规杂交分析的方法尽管可以对小麦品系进行抗性分析，但遗传分析研究的周期比较长，工作量繁琐，在分析含有多基因的抗病材料时存在困难，其实际应用受到很大限制。
[0007]3.利用已知的病源菌系接种含有抗性基因的材料对小麦抗性基因进行快速的鉴定，基于植物一病原菌相互作用产生的表型推测双方可能的基因型。此法用于抗性基因分析归类，简单快速，不受生长季节限制，能在短期内分析大量品种，但是基因表达受基因间互作、基因连锁、遗传背景和环境因素等方面的影响，容易出现推导误差；在测试菌株选择失误时不能检出小麦品种所具有的抗病基因。
[0008]4.利用与抗病基因紧密连锁的分子标记进行抗病基因鉴定，在不受环境条件影响的情况下可快速确定待测品种是否含有特定抗病基因，对抗病基因进行精确定位，确定抗病基因在遗传图谱上的位置，但此种方式存在盲目性，由于DNA交换的存在，部分含有该抗病基因且抗性良好的材料却检测不到该基因片段。
[0009]因此，已有的方法在检测小麦抗病害基因方面均存在一定的缺陷，本领域依旧存在快速准确检测并对小麦抗病性进行评价的需要。
【发明内容】
[0010]针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种用于快速鉴定小麦主效抗病害基因的方法，所公开的方法结合了传统的表型鉴定和现代生物学中的分子标记，通过将二者结合，能够克服表型鉴定时人为和环境影响导致的误差，而且可以有效追踪系谱来源，为小麦品种(系)的有效利用提供帮助，避免个别材料因农艺性状不佳而被淘汰所造成的抗性资源浪费。
[0011]为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的:
[0012]用于快速鉴定小麦主效抗病害基因的方法，包括下述两个阶段:1)利用小麦苗期分小种鉴定和抗病基因分子检测筛查抗病基因的存在性；2)在步骤I的基础上，结合小麦成株期抗病表型进行对比验证。
[0013]其中，上述所称的小麦病害包括目前常见的小麦病害，包括但不限于条锈病、白粉病、赤霉病等，主要是针对条锈病，这是目前小麦生长过程中面临的最普遍病害之一；因此，在本发明中，所述的小麦抗病害基因包括小麦抗条锈病基因、小麦抗白粉病基因或小麦抗赤霉病基因，主要针对的是小麦抗条锈病基因。
[0014]其中，所述小麦苗期分小种鉴定包括下述步骤:种植鉴别寄主对所选病害小麦小种进行鉴定；确认后将所选材料进行接种，以感病品种和已知的抗病害基因的单基因系为对照。接种后待感病对照充分发病时重复进行多次鉴定，并记载反应型。
[0015]通过对比 感病品种并参照已知的抗条锈病单基因系，通过苗期分小种鉴定，能够用来确定和评价抗源抗病类型。
[0016]在上述方法中，对反应型的记载按照本领域常用的0-9级标准记载，本领域多年来已经形成了成熟的主要小麦病害反应型记载标准，以0、1%、5%、10%、30%、60%、80%和100%八级标准记载严重度，具体细节可参考国家标准GB/T15795-1995的记载；同样的，小麦白粉病、赤霉病的划分也采用本领域公知的方案。
[0017]当检测的对象是小麦抗条锈病基因品种的小麦时，采用的感病品种为铭贤169，已知抗条锈病基因为Yr5、Yr9、YrlO、Yrl5、Yrl7、Yrl8和Yr26的单基因系。
[0018]其中，所述抗病基因分子检测是选用已知的用于检测小麦抗病害基因的分子标记进行分子检测，首先提取小麦幼叶的DNA，然后用分子标记进行PCR扩增；最后，跑胶，观察分析得出结论。
[0019]当检测的对象是小麦抗条锈病基因品种的小麦时，所用分子标记为Yr5、Yr9、YrlO、Yrl5、Yrl7、Yrl8、Yr26 等 7 个基因标记。
[0020]目前，本领域对这七个基因作为分子标记的使用已经普遍掌握，对应的引物设计和使用也易于实现。
[0021]通过采用已知抗病基因分子标记检测和抗谱比较，能够检测和分析抗源是否携带抗病新基因，为新的具有抗病害基因的小麦培育提供定量支持。
[0022]其中，小麦成株期抗病表型的验证包括通过在田间对小麦进行人工接种统计发病表型的步骤和在小麦病害发生自然条件下进行成株期抗病害鉴定的步骤。
[0023]上述两种方式的结果相结合能够稳定、准确、定性评价小麦品种的抗病害性能，尤其是在检测小麦抗条锈病性能够提供非常明确的检测结果。
[0024]上述的人工接种是指在特定条件下种植多株小麦做为感病指不品种。以感病品种为诱发，然后接种小麦，并在合适的生长时间开始监测相关病害的流行状况，在盛发期记载各供试小麦品种顶三叶的抗病反应型和严重度。按0-9九级标准记载反应型(infectiontype, IT)，以 0、1%、5%、10%、30%、60%、80%和 100%八级标准记载严重度。
[0025]上述的小麦自然发病的田间鉴定是指在中国小麦条锈菌菌源易变区设置自然发病圃的鉴定工作，种植方式同上。待感病对照材料充分发病时，进行成株期抗条锈性鉴定，鉴定标准同上。
[0026]通过上述方案，本发明取得了如下技术进步:
[0027]1.利用苗期分小种鉴定和分子标记检测有效追踪系谱来源，为小麦品种(系)的有效利用提供帮助，既可以避免个别材料因农艺性状不佳而被淘汰所造成的抗性资源浪费，又为将来该材料的利用提供方便。
[0028]2.将微观检测与传统的宏观表征检测相结合，广泛适用于多种病害的抗性分析和评价。
[0029]3.采用分子标记辅助鉴定提高鉴定筛选效率，通过表型鉴定快速直观地推测材料的抗性，二者有效结合，既弥补了表型鉴定的时候由于个人见解上的差异以及环境条件的影响所造成的误差，也可以互相补充，从不同角度、不同层次进行全方位评价。这种基于现代生物技术手段与传统表型分析手段相结合的快速评价体系可以在短时间内对要筛选的抗病害小麦品种(系)的取舍以正确指导。
【具体实施方式】
[0030]下面以小麦 条锈病为例，说明本发明的方法。
[0031]1.人工接种病圃设置与田间鉴定
[0032]在适宜地区设置已知条锈菌小种的混合鉴定圃，如陕西杨凌等地区。每份供试小麦品种材料种植两行(行长100cm，行距25cm)，每隔20个品种种植两行小偃22做为感病指不品种，以感病品种铭贤169为诱发打。
[0033]三月中旬在田间接种CYR32和CYR33混合小种(中国小麦条锈菌当前优势小种)，从五月份开始监测条锈病流行状况，在条锈病盛发期记载各供试小麦品种顶三叶的抗病反应型和严重度。按0-9九级标准记载反应型(infection type, IT),以O、I %、5 %、10 %、30%、60%、80%和100%八级标准记载严重度(表1)。
[0034]表1小麦条锈菌反应型0-9级标准
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【权利要求】
1.用于快速鉴定小麦主效抗病害基因的方法，其特征在于包括下述两个阶段:1)利用小麦苗期分小种鉴定和抗病基因分子检测筛查抗病基因的存在性；2)在步骤I的基础上，结合小麦成株期抗病表型进行对比验证。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述小麦抗病害基因包括小麦抗条锈病基因、小麦抗白粉病基因或小麦抗赤霉病基因。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述小麦苗期分小种鉴定包括下述步骤:种植鉴别寄主对所选病害小麦小种进行鉴定；确认后将所选材料进行接种，以感病品种和已知的抗病害基因的单基因系为对照。接种后待感病对照充分发病时重复进行多次鉴定，并记载反应型。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述抗病基因分子检测是选用已知的用于检测小麦抗病害基因的分子标记进行分子检测，首先提取小麦幼叶的DNA，然后用分子标记进行PCR扩增；最后，跑胶，观察分析得出结论。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于小麦成株期抗病表型的验证包括通过在田间对小麦进行人工接种统计发病表型的步骤和在小麦病害发生自然条件下进行成株期抗病害鉴定的步骤。
6.根据权利要求3所述的方法,其特征在于所述小麦抗病害基因为小麦抗条锈病基因，感病品种为铭贤169和已知抗条锈病基因为Yr5、Yr9、YrlO、Yrl5、Yrl7、Yrl8和Yr26的单基因系。
7.根据权利要求所述的方法，其特征在于所述小麦抗病害基因为小麦抗条锈病基因，所用分子标记为Yr5, Yr9, YrlO, Yrl5, Yrl7, Yrl8, Yr26等7个基因标记。
【文档编号】C12Q1/68GK104004834SQ201410202259
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月14日 优先权日:2014年5月14日
【发明者】韩德俊, 康振生, 薛文波, 王琪琳, 吴建辉, 许鑫, 穆京妹, 詹刚明, 王保通, 黄丽丽 申请人:西北农林科技大学