一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法
【专利摘要】本发明提供了一种用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，以红豆杉种子为外植体，经灭菌、接种后，再经二次灭菌，培养一段时间后，挑取种子周围的内生真菌，置于PDA固体培养基进行培养，然后挑取部分菌斑置于PDA液体培养。用纱布过滤发酵物，将滤液部分用乙酸乙酯萃取。过滤后用旋转蒸发器在35℃下减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，得到含有紫杉醇的甲醇溶液。本发明应用真菌培养技术克服红豆杉植株生长缓慢、紫杉醇化学合成复杂的问题，为进行工厂化真菌发酵生产紫杉醇提供基础，环境友好，原料丰富，可很好缓解市场对紫杉醇供应缺口大的问题。
【专利说明】—种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及紫杉醇的产生，特别是一种通过红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法。
[0002]【背景技术】紫杉醇(Taxol),是从红豆杉属(Taxus spp.)植物中分离得到的一种具有独特抗癌作用的二萜类化合物，具有很高的开发利用价值，是目前世界主流的抗癌药物之一。化学名称:5 β , 20-环氧-1,2α , 4, 7 β , 10 β ,13α- TK羟基紫杉烧 _11_ 稀 _9~ 丽-4,10- 二乙酸酯-2-苯甲酸酯_13[ (2’R，3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]。化学式为C47H51NO14,分子量是853.92，白色结晶体粉末，无臭，无味，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂，熔点213~216°C。1967年美国北卡罗莱纳州三角研究所的Wall博士和Wani博士发现了紫杉醇。进一步研究发现紫杉醇能与微管紧密地结合，是已知的第一种能和微管蛋白聚合体相互作用从而抑制细胞有丝分裂的药物。美国国家癌症研究所和约翰霍普金斯大学医学院大量临床研究的数据表明，紫杉醇在治疗卵巢癌和乳腺癌方面效果显著。
[0003]1992年12月，美国国家食品与药品管理中心正式批准:紫杉醇为晚期卵巢癌的治疗药物。随后又批准用于治疗乳腺癌。目前紫杉醇是最好的治疗卵巢癌和乳腺癌的药物，价格非常昂贵，市场售价为4800美元/克。1994年紫杉醇创世界抗癌药物全球销量冠军。2000年紫杉醇销量创百亿(后受原料供应未有进一步上升)，但由于野生红豆杉资源濒危，2002年中央发文严禁砍伐野生红豆杉，鼓励人工种植。今天，紫杉醇已经被成功地用于对多种恶性肿瘤的治疗(包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、卡波氏肉瘤等)。
[0004]但是紫杉醇的自然资源一红豆杉和东非罗汉松(1999年测知含紫杉醇)数量有限且生长地十分缓慢。且其中有效成分的含量非常低(每公斤树皮仅能提取0.1g紫杉醇粗品)。最初，用于治疗的紫杉醇都来源于太平洋红豆杉，治疗一个病人需要6棵百年树龄的红豆杉。尽管现在紫杉醇以及它的抗癌同源衍生物可以通过其前体进行化学半合成制得。但是部分前体还需要从红豆杉中分离得到，产量受到制约。
[0005]目前，生产紫杉醇原料药有以下几种途径:①直接从红豆杉树皮或整株红豆杉植株中提取；②半合成法，即先从红豆杉中提取10-DAB等中间体，再经合成为紫杉醇成品；③培养能产生紫杉醇的红豆杉细胞；④全合成法，但由于步骤多，成本高尚未投入生产?’⑤发酵法:培养寄生在红豆杉树木身上的某些真菌来获取紫杉醇。其中发酵法属于“环境友好型”工艺，利用来源丰富的淀粉类原料，属于绿色农产品原料。而且对环境无污染，科学家普遍认为，真菌发酵法生产紫杉醇代表着紫杉醇生产的未来方向。
【发明内容】
[0006]针对紫杉醇原料药市场缺口较大的问题，本发明目的是提供一种通过红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法。
[0007]本发明的技术方案是:
一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，以红豆杉种子为外植体,经灭菌、接种、二次灭菌、接种，诱导红豆杉种子内生菌，再培养红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法。
[0008]前面所述的方法，优选的方案在于:步骤如下:
A、外植体的选择和灭菌处理:以‘曼地亚’红豆杉(Taxusmedia)种子为外植体，以洗洁精浸泡，摇床100-150转摇15-20分钟，再用清水冲洗，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1%的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗，备用；
B、外植体接种:将经过步骤A中准备的外植体种子，接种在含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8，培养，至在种子周围有菌丝形成；
C、二次灭菌:将步骤B中得到的种子用0.1%氯化汞二次灭菌，无菌水冲洗7-8次；
D、内生菌的诱导:将经过步骤C中得到的外植体种子，继续培养于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8，至出现红豆杉种子内生菌；
E、内生菌培养:将步骤D中得到的红豆杉种子内生菌置于PDA固体培养基进行培养，培养3天后再挑取部分菌斑置于PDA液体培养基中培养，培养3天后检测紫杉醇含量；
F、紫杉醇提取:将步骤E中的发酵物用纱布过滤，将滤液部分用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相，取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取I次，收集有机相，菌丝部分经液氮研碎，超声处理，静置过夜后用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相，重复处理I次，将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35°C下旋蒸至液体全部蒸发，残留物体用溶解于少量甲醇中，滤膜过滤，定容至1mL备用；
G、紫杉醇提取含量检测:经HPLC检测，真菌产生的发酵物中含有紫杉醇，平均含量为0.315mg/L。
[0009]前面所述的方法，优选的方案在于:所述的红豆杉为红豆杉科红豆杉属植物‘曼地亚，红豆杉(Taxus media)。
[0010]前面所述的方法，优选的方案在于:步骤A、外植体的选择和灭菌处理时:所用洗洁精浓度为2%~3%，浸泡和冲洗时间为15-30分钟，0.1%的氯化汞浸泡灭菌时间为9-14分钟，无菌去离子水冲洗次数为6-8次。
[0011]前面所述的方法，优选的方案在于:步骤B、外植体接种时:培养时间为3-5天。
[0012]前面所述的方法，优选的方案在于:步骤C、二次灭菌时:二次灭菌时间为8_12min，无菌水冲洗6_8次。
[0013]前面所述的方法，优选的方案在于:步骤D、内生菌的诱导时:培养温度为21±2°C，光照强度为1600Lux，光照时间为14小时，培养时间为7_10天。
[0014]前面所述的方法，优选的方案在于:步骤E、内生菌培养:液体培养时，每个三角瓶的接种量为2%，装液量为200mL / 500mL，摇床培养，培养温度为27°C，转速为150r /min。
[0015]前面所述的方法，优选的方案在于:步骤F、紫杉醇提取:超声处理时间为25-35min,滤膜过滤时用0.45 μ m滤膜。
[0016]前面所述的方法，优选的方案在于:步骤G、紫杉醇提取含量检测:色谱条件为:C18 柱:250mmX46mm ;流动相，甲醇:水(v/v) =60:40 ;压力:1506PSI=10.39MPa ;保护压力=10LO-Pr ;流速 0.7mL/ min，检测波长 228nm，灵敏度，0.1AUf S，柱温 35。。。
[0017]本发明提供的是一种利用红豆杉种子内生真菌产生紫杉醇的方法，以曼地亚红豆杉种子为材料，经75%酒精杀毒，0.1%氯化汞灭菌处理，置于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中。培养3天后，0.1%氯化汞二次灭菌，继续培养于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中。培养7天后，分离种子周围长出的真菌，置于PDA固体培养基进行培养，然后挑取部分菌斑置于PDA液体培养。用纱布过滤发酵物，将滤液部分用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相。取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取I次，收集有机相。菌丝部分经液氮研碎，超声30min，静置过夜后用等体积的乙酸乙酯萃取，重复处理I次，收集有机相。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35°C下减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，用0.45 μ m滤膜过滤，定容至5mL备用。经HPLC检测，真菌产生的发酵物中含有紫杉醇，平均含量为0.315mg/L。
[0018]具体包括下列步骤:
A)以‘曼地亚’红豆杉种子为材料，2%~3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗，经75%酒精杀毒，0.1%氯化汞灭菌处理，置于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉 7.5g/L，pH5.8 ；
B)培养3-5天后，取出培养的红豆杉种子用0.1%氯化汞二次灭菌，继续培养于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8。培养温度及光照条件:温度为21±2°C，光照强度为1600LUX，光照时间为14小时；
C)培养7-10天后，分离种子周围长出的真菌，置于PDA固体培养基进行培养，然后挑取部分菌斑置于PDA液体培养基中。每个三角瓶的接种量为2-4%，装液量为200mL /500mL，摇床培养，培养温度为27-30°C，转速为180r / min ;培养3_5天后检测紫杉醇含量;
D)用纱布过滤发酵物，将滤液部分用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相。取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取I次，收集有机相。菌丝部分经液氮研碎，超声30min，静置过夜后用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相。重复处理I次。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35°C下减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，用
0.45 μ m滤膜过滤,定容至1mL备用。
[0019]E)经HPLC检测，真菌产生的发酵物中含有紫杉醇，平均含量为0.315mg/L。
[0020]步骤A)所述的红豆杉基源植物为‘曼地亚’红豆杉(Taxus media),其种子去掉果肉，保留种皮。以带种皮的种子的外植体，2%~3%的洗洁精溶液进行浸泡和冲洗，外植体经75%酒精杀毒30秒，再经0.1%氯化汞灭菌处理10分钟，置于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8 ；
SH培养基为Schenk and Hildebrandt基本培养基，所述的SH培养基的成分按常规为:硝酸钾(KNO3) 2500.00 mg/L，硫酸镁(MgSO4) 195.05 mg/L，磷酸二氢铵[(NH4) H2PO4 ]300.00 mg/L，氯化钙(CaCl2) 151.00 mg/L，氯化钴(CoCl2.6H20) 0.10 mg/L，硫酸铜(CuSO4.5Η20)0.20mg/L，硼酸(H3BO3)5.0 mg/L，碘化钾(ΚΙ) 1.00 mg/L，硫酸锰(MnSO4H2O)10.00 mg/L，钥酸钠(Na2MoO4.2H20) 0.10 mg/L，硫酸锌(ZnS047H20) 1.00 mg/L，硫酸亚铁(FeS047H20) 27.8 mg/L, Na2-EDTA2H20 37.3mg/L,甘氨酸 2.00 mg/L,盐酸硫胺素(维生素BI) 0.10 mg/L,盐酸批P多醇(维生素 B6) 0.50mg/L, IVB 烟酸 0.5 mg/L,肌酉享 100 mg/L。
[0021]步骤B)培养3-5天后，取出培养的红豆杉种子用0.1%氯化汞二次灭菌，继续培养于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8 ；
步骤C)培养10天后，分离种子周围长出的真菌，置于PDA固体培养基进行培养，然后挑取部分菌斑置于PDA液体培养基中。其中PDA固体培养基由北京陆桥生物技术公司生产的马铃薯葡萄糖琼脂(成分g/L:马铃薯浸粉5.0g,葡萄糖20g，琼脂13.0g,氯霉素0.1g)19 g溶于500mL蒸馏水中，120°C灭菌15分钟，冷却后备用。将配制好的PDA培养基灭菌后倒皿，然后菌斑接于PDA平皿上培养，等平皿上长出菌落后，再配制PDA培养基进行纯化，3~5次后就能够得到纯化的内生真菌菌株。
[0022]PDA液体培养基制作方法:新鲜的土豆200g，去皮，切成小块放入锅中煮25min(煮到玻璃棒能够戳破即可)。用四层纱布趁热在量杯上过滤两次，过滤后在滤液中加入葡萄糖20溶解，溶解后加水定容至1000mL。120°C的条件下灭菌25min，灭菌完成后备用。
[0023]步骤D)用纱布过滤发酵物，将滤液部分用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相。取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取I次，收集有机相。菌丝部分经液氮研碎，超声30min，静置过夜后用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相。重复处理I次。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35°C下旋蒸至液体全部蒸发，残留物体用溶解于少量甲醇中， 用0.45 μ m滤膜过滤,定容至1mL备用。
[0024]步骤E)经HPLC检测，真菌产生的发酵物中含有紫杉醇，平均含量为0.315mg/L0其中色谱条件为:C18柱:250mmX46mm ;流动相，甲醇:水(v/v) =60:40 ;压力:1506PSI=10.39MPa ;保护压力:100L0-Pr ;流速 0.7mL/ min，检测波长 228nm，灵敏度，
0.1AUf s，柱温 35°C。
[0025]本发明利用红豆杉内生菌产生紫杉醇在以下四个方面具有重要意义:本发明应用真菌培养技术紫杉醇化学合成复杂的问题:
(I)内生真菌生长迅速，能够在发酵罐中工业化生产，本发明为进行工厂化真菌发酵生产紫杉醇提供技术基础，占用空间小、培养简单、成本相对较低；不受地区、季节、气候限制，一年四季均可生产；(2)克服红豆杉植株生长缓慢，可缓解红豆杉植物资源濒危及严重不足的问题；(3)环境友好、原料丰富，可很好缓解市场对紫杉醇供应缺口大的问题；(4)内生真菌育种和选育速度很高，可以通过基因工程等方法筛选高产菌株，提高内生真菌的生产能力，提闻紫杉醇的广量。
[0026]本发明所用培养基配制简单，诱发时间短、长菌快、紫杉醇含量高，易于操作、大规模生产。
[0027]本发明首次以‘曼地亚’红豆杉种子为材料，开展从红豆杉种子中分离真菌产生紫杉醇的工作，这为保护红豆杉种质资源，促进利用生物发酵方法获取紫杉醇提供了一条新途径，为解决紫杉醇生产中红豆杉原料的短缺、提高紫杉醇产量，开辟了微生物发酵生产的方法。
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施例详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。
[0029]实施例1
一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，包括下列步骤:
A)‘曼地亚’红豆杉果实，去除果肉，带皮种子用2%的洗洁精溶液进行浸泡，摇床100-150转摇15-20分钟，再用清水冲洗15-30分钟，再将冲洗后的外植体经75%酒精杀毒30s，置于浓度为0.1%的升汞中,浸泡灭菌9-11分钟,无菌去离子水冲洗6-8次,接种于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8 ；
B)培养3天后，取出培养的红豆杉种子用0.1%氯化汞二次灭菌lOmin，继续培养于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8。培养温度为21±2°C，光照强度为1600LUX，光照时间为14小时；
C)培养7天后，分离种子周围长出的真菌，置于PDA固体培养基进行培养，然后挑取部分菌斑置于PDA液体培养基中。每个三角瓶的接种量为2%，装液量为200mL / 500mL，摇床培养，培养温度为27°C，转速为150r / min ;培养3天后检测紫杉醇含量；
D)用纱布过滤发酵物，将滤液部分用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相。取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取I次，收集有机相。菌丝部分经液氮研碎，超声30min，静置过夜后用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相。重复处理I次。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35°C下旋蒸至液体全部蒸发，残留物体用溶解于少量甲醇中，用0.45 μ m滤膜过滤，定容至1mL备用,4°C冰箱中保存备用。
[0030]E)经HPLC检测，真菌产生的发酵物中含有紫杉醇，平均含量为0.19mg/L。
[0031]实施例2
一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，包括下列步骤:
A)‘曼地亚’红豆杉果实，去除果肉，带皮种子用3%的洗洁精溶液进行浸泡，在摇床上摇15min，自来水冲洗15min，经75%酒精杀毒30s，0.1%氯化汞灭菌处理9min，置于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，ρΗ5.8 ；
B)培养3天后，取出培养的红豆杉种子用0.1%氯化汞二次灭菌lOmin，培养于不含激素的0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L,琼脂粉7.5g/L，ρΗ5.8。
[0032]C)培养8天后，分离种子周围长出的真菌，置于PDA固体培养基进行培养，然后挑取部分菌斑置于PDA液体培养基中。每个三角瓶的接种量为3%，装液量为200mL /500mL，摇床培养，培养温度为28°C，转速为150r / min ;培养3天后检测紫杉醇含量；
D)用纱布过滤发酵物，将滤液部分用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相。取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取I次，收集有机相。菌丝部分经液氮研碎，超声30min，静置过夜后用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相。重复处理I次。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35°C下旋蒸至液体全部蒸发，残留物体用溶解于少量甲醇中，用0.45 μ m滤膜过滤，定容至1mL备用,4°C冰箱中保存备用。
[0033]E)经HPLC检测，真菌产生的发酵物中含有紫杉醇，平均含量为0.10mg/L。
[0034]实施例3
一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，包括下列步骤:
A)‘曼地亚’红豆杉果实，去除果肉，带皮种子用3%的洗洁精溶液进行浸泡，在摇床上摇15min，自来水冲洗15min，经75%酒精杀毒30s，0.1%氯化汞灭菌处理9min，置于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，ρΗ5.8 ；
B)培养3天后，取出培养的红豆杉种子用0.1%氯化汞二次灭菌lOmin，培养于不含激素的0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，ρΗ5.8。
[0035] C)培养8天后，分离种子周围长出的真菌，置于PDA固体培养基进行培养，然后挑取部分菌斑置于PDA液体培养基中。每个三角瓶的接种量为3%，装液量为200mL /500mL，摇床培养，培养温度为28°C，转速为150r / min ;培养3天后检测紫杉醇含量；D)用纱布过滤发酵物，将滤液部分用等体积的乙酸乙酯萃取。取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取I次，收集有机相；菌丝部分经液氮研碎，超声30min，静置过夜后用等体积的乙酸乙酯萃取，重复处理I次。将所有的乙酸乙酯萃取液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35°C下减压蒸馏，溶解于少量甲醇中，用0.45 μ m滤膜过滤，定容至10mL，4°C冰箱中保存备用。
[0036]E)经HPLC检测，真菌产生的发酵物中含有紫杉醇，平均含量为0.42mg/L。
[0037]实施例4
一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，包括下列步骤:
A)‘曼地亚’红豆杉果实，去除果肉，带皮种子用3%的洗洁精溶液进行浸泡，在摇床上摇15min，自来水冲洗101^11，经75%酒精杀毒308，0.1%氯化汞灭菌处理lOmin，置于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，ρΗ5.8 ；
B)培养4天后，取出培养的红豆杉种子用0.1%氯化汞二次灭菌lOmin，继续培养于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8。培养温度为21±2°C，光照强度为1600LUX，光照时间为14小时；
C)培养10天后，分离种子周围长出的真菌，置于PDA固体培养基进行培养，然后挑取部分菌斑置于PDA液体培养基中。每个三角瓶的接种量为2%，装液量为200mL / 500mL，摇床培养，培养温度为27°C，转速为150r / min ;培养3天后检测紫杉醇含量；
D)三角瓶中的发酵液进行抽滤，抽滤完成后在6000r min的速度下离心15min。离心后的上清液在50°C的温度下使用旋转蒸发仪进行旋转蒸发，旋蒸至原体积的I / 10，将旋蒸后的液体加入相同体积的乙酸乙酯-丙酮(体积比为1:1)进行萃取，萃取2~3次，收集有机相；抽滤、离心后试管底部的菌体用组织捣碎仪进行捣碎，处理时间为lOmin，然后加入菌体体积5倍的乙酸乙酯-丙酮(体积比为1:1)进行溶解，用细胞破碎仪进行破碎，处理时间为20min,然后用离心机在6000 r min的速度下离心10min。取从发酵液和菌体中得到的液体进行混合，在50°C下旋蒸至液体全部蒸发，残留物体用1mL的甲醇溶解，溶解后再用离心机在6000r min的速度下离心15min，离心完成后收集上清液在4 °C冰箱中保存备用。
[0038]E)经HPLC检测，真菌产生的发酵物中含有紫杉醇，平均含量为0.55mg/L。
[0039]本申请是基于聊城大学博士科研启动经费和山东省自然科学基金(ZR2011CL010)资助。
【权利要求】
1.一种利用红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法，其特征在于:以红豆杉种子为外植体，经灭菌、接种、二次灭菌、接种，诱导产生红豆杉种子内生菌，再培养红豆杉种子内生菌产生紫杉醇的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤如下: A、外植体的选择和灭菌处理:以‘曼地亚’红豆杉(Taxusmedia)种子为外植体，以洗洁精浸泡，摇床100-150转摇15-20分钟，再用清水冲洗，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1%的升汞中，浸泡灭菌，无菌去离子水冲洗，备用； B、外植体接种:将经过步骤A中准备的外植体种子，接种在含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8，培养，至在种子周围有菌丝形成； C、二次灭菌:将步骤B中得到的种子用0.1%氯化汞二次灭菌，无菌水冲洗； D、内生菌的诱导:将经过步骤C中得到的外植体种子，继续培养于含有赤霉素0.3mg/L的SH培养基中，其中蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L，pH5.8，至出现红豆杉种子内生菌； E、内生菌培养:将步骤D中得到的红豆杉种子内生菌置于PDA固体培养基进行培养，然后再挑取部分菌斑置于PDA液体培养基中培养，培养3天后检测紫杉醇含量； F、紫杉醇提取:将步骤E中的发酵物用纱布过滤，将滤液部分用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相，取水相部分再用等体积的乙酸乙酯萃取I次，收集有机相，菌丝部分经液氮研碎，超声处理，静置过夜后用等体积的乙酸乙酯萃取，收集有机相，重复处理I次，将所有的乙酸乙酯萃取 液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35°C下旋蒸至液体全部蒸发，残留物体用溶解于少量甲醇中，滤膜过滤，定容至1mL备用； G、紫杉醇提取含量检测:经HPLC检测，真菌产生的发酵物中含有紫杉醇，平均含量为0.315mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述的红豆杉为红豆杉科红豆杉属植物‘曼地亚’红豆杉(Taxus media)。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤A、外植体的选择和灭菌处理时:所用洗洁精浓度为2%~3%，浸泡和冲洗时间为15-30分钟，0.1%的氯化汞浸泡灭菌时间为9-14分钟，无菌去离子水冲洗次数为6-8次。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤B、外植体接种时:培养时间为3-5天。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤C、二次灭菌时:二次灭菌时间为8-12min,无菌水冲洗6_8次。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤D、内生菌的诱导时:培养温度为21±2°C，光照强度为1600Lux，光照时间为14小时，培养时间为7_10天。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤E、内生菌培养:液体培养时，每个三角瓶的接种量为2%，装液量为200mL / 500mL，摇床培养，培养温度为27°C，转速为150r/ min。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤F、紫杉醇提取:超声处理时间为25-35min,滤膜过滤时用0.45 μ m滤膜。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤G、紫杉醇提取含量检测:色谱条件为:C18 柱:250mmX46mm ;流动相，甲醇:水(v/v) =60:40 ;压力:1506PSI=10.39MPa ;保护压力:10LO- Pr ;流速 0.1mL/ min，检测波长 228nm，灵敏度，0.1AUf S，柱温 35。。。
【文档编号】C12P17/02GK104073529SQ201410269440
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】穆红梅 申请人:聊城大学