细胞体外收集方法及其应用、体外细胞材料及其应用的制作方法

细胞体外收集方法及其应用、体外细胞材料及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种细胞收集方法、细胞材料。针对现有Transwell迁移研究对实验结果提示的科学内容利用有限的缺陷，本发明首先提供了一种细胞体外收集方法。本方法在Transwell细胞迁移培养结束并去除Transwell上室、下室内培养液后，采用胰酶消化并结合机械振荡的方法分别对Transwell细胞迁移实验后上室、下室中的细胞进行消化、收集；胰酶细胞消化操作中，洗涤液为pH?7.35～7.45磷酸盐缓冲液，胰酶细胞消化液含0.25％胰酶和0.01％EDTA。本发明同时提供一种包括由相同趋化因子诱导下分离产生的高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料。本发明还提供上述收集方法与细胞材料在细胞生物学行为分析试验中的应用。本发明能够使Transwell体外迁移实验拓展到细胞迁移的细胞生物学行为与分子生物学研究。
【专利说明】细胞体外收集方法及其应用、体外细胞材料及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞收集方法、细胞材料，特别是涉及一种细胞体外收集方法，以及体外细胞材料。属于生物、医学细胞体外实验【技术领域】。
【背景技术】
[0002]细胞迁移是细胞在外源性信号刺激下产生的趋化移动，通常是细胞感受到某些物质的浓度梯度后从低浓度王高浓度区域移动。在生理状态下，细胞迁移在细细胞觅食、伤口愈合、胚胎发生、组织修复、免疫反应等过程中发挥着重要作用；在病理状态下，细胞迁移也推动了癌症转移、动脉粥样硬化和关节炎等疾病的发生和发展。因而，细胞迁移是当前生命科学的一个重要研究方向。
[0003]Transwell迁移技术是目前应用最广泛的研究体外细胞迁移的实验方法。实验所需Transwell迁移体系采用Transwell小室(Transwell insert)与普通多孔细胞培养板共同搭建完成。Transwell小室外形为一个可放置在普通细胞培养板孔板里的杯状装置，底部带通透性膜，膜上带有孔径大小0.1 - 12.0μπι的微孔。研究中根据不同的实验目的，选用不同的微孔直径。细胞迁移研究通常选用带8.0 μ m或12.0 μ m微孔的Transwell体系。实验中将Transwell小室放入普通细胞培养板中，Transwell小室内称上室或内室，细胞培养板内称下室或者外室。实验中，通过在下室添加各种趋化因子，诱导细胞从上室往下室迁移。根据生产厂商不同，Transwell小室又称Boyden Chamber或者Thincert小室。由于领域内一般采用美国Corning公司生产的Transwell小室，因而，目前这类体外细胞迁移研究方法广泛采用“Transwell法”作为其常规名称。Transwell迁移技术可靠性强、重复性好，是目前最广泛的细胞迁移研究方法。但是目前Transwell迁移研究中对实验结果采用的分析方法均比较简单，通常是单纯分析计算细胞迁移率，对实验结果提示的科学内容利用有限。
[0004]细胞体内研究中已经揭示细胞迁移活性高和低的细胞的各种细胞生物学行为，包括细胞黏附、增殖、分化、凋亡等均匀显著不同，国内外学者们对此已经进行了深入研究。然而受体内研究的限制，研究者很难获取具有不同迁移活性的细胞进行进一步研究。从Transwell迁移实验的设计原理分析，Transwell体外迁移实验能将细胞材料区分为迁移能力强和迁移能力弱的两群细胞，已为完成上述细胞体外行为研究创造了前提条件。但是，细胞在Transwell小室中的迁移是一个非常复杂的过程:细胞内部的蛋白质和离子在感知上下小室的浓度梯度后重新排列，并变性伸出极状足，形成粘着斑，牵拉细胞向前，从而穿过狭小的Transwell微孔,逐渐从Transwell膜的上室迁移到下室。由于真核细胞的直径一般在10 μ m~100 μ m之间，远大于Transwell迁移实验8.0 μ m~12.0 μ m的微孔直径。因而在Transwell细胞迁移实验中，细胞除了粘附在Transwell膜的上下两个底面上,还会有大量的细胞会“陷”在Transwell膜上的微孔内，难以有效收集用于后继研究。尤其Transwell小室面积较小，采用常规的化学消化方式无法进行批量化操作，细胞收集量较低，不足以用于后续细胞生物学和分子生物学研究。另外，在常规的细胞消化方法中细胞是从其培养平面上脱落，细胞消化时只需要破坏细胞之间的连接即可；而在Transwell迁移体系中，细胞要穿过孔径小于其直径的狭小的微孔，消化收集细胞时需要细胞从其嵌附的微孔中快速脱离，此过程很易损伤细胞，甚至导致细胞裂解、碎片化。因此，整体上，尽管体外细胞研究技术具有干预因素单纯、实验条件易控、经济快速、重复性好，且能够进行深入的机制研究等优点，但受现有技术条件的制约，使得体外细胞迁移实验通常只能简单地通过分析细胞迁移率来了解细胞的迁移能力，而研究者所希望的将迁移实验的结果细胞进一步利用，例如获取高迁移活性的细胞进一步研究，在细胞体外实验条件下比较迁移细胞与非迁移细胞的生物学行为的研究始终难以开展。

【发明内容】

[0005]本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种细胞体外收集方法，该方法针对性与细胞迁移实验相结合，对迁移实验结束后的细胞进行有效收集；收集到的细胞是在相同趋化因子诱导下具有不同迁移活性的细胞，可应用于细胞体外实验条件下迁移细胞与非迁移细胞的比较研究；该细胞体外收集方法可应用于细胞克隆、增殖，凋亡、基因和蛋白表达、形态学检测等试验。
[0006]为实现上述目的，本发明首先提供一种细胞体外收集方法，其技术方案如下: [0007]一种细胞体外收集方法，其特征在于:应用于Transwell细胞迁移实验；Transwell细胞迁移培养结束并去除Transwell上室、下室内培养液后，采用胰酶消化并结合机械振荡的方法分别对Transwell细胞迁移实验后上室、下室中的细胞进行消化、收集；胰酶细胞消化操作中，洗涤液为PH 7.35~7.45磷酸盐缓冲液，胰酶细胞消化液含0.25%胰酶和 0.01% EDTA。
[0008]本发明细胞体外收集方法技术基本技术原理是将Transwell体外迁移实验与体外细胞培养方法相结合。Transwell细胞迁移培养结束并去除TranswelI上室、下室内培养液后，残留并附着在Transwell通透性膜上层表面的细胞是非迁移细胞(迁移能力低)，而附着于Transwell通透性膜下层表面以及嵌附在Transwell通透性膜微孔内的细胞是迁移细胞(迁移能力高)，通过胰酶消化并结合机械振荡的方法可将附着于通透性膜表面以及镶嵌于微孔内的细胞消化并收集，从而获得Transwell体外细胞迁移实验条件下无迁移行为的细胞与有迁移行为的细胞而进行下一步研究。
[0009]在优选方式下，上述细胞体外收集方法可依照如下步骤实施:
[0010]步骤S1、初次洗涤
[0011]Transwell细胞迁移培养结束并去除Transwell上室、下室内培养液后，在上室、下室中分别加入磷酸盐缓冲液洗涤培养室，收集上室与下室中洗涤液分别存入二离心管中，分别标记为离心管A、离心管B ;
[0012]步骤S2、消化收集
[0013]向Transwell上室、下室中分别加入胰酶细胞消化液，待细胞分散悬浮，分别收集上室、下室中消化液对应加入离心管A、离心管B中，分别向离心管A、离心管B中加入牛血清终止细胞消化；
[0014]步骤S3、再次洗涤收集
[0015]分别向Transwell上室、下室中加入磷酸盐缓冲液，水平振荡，分别收集上室、下室中洗涤液对应加入离心管A、离心管B中；
[0016]步骤S4、离心收集细胞
[0017]将离心管A、离心管B离心，去除上清液，分别向离心管A、离心管B中加入磷酸盐缓冲液，重悬并收集离心管底部细胞团块，得收集细胞。
[0018]上述细胞体外收集方法，在必要时需重复步骤S3、再次洗涤操作一次，即在消化收集操作之后进行两次洗涤收集。
[0019]上述细胞体外收集方法共进行2~3次贴壁细胞的收集，只有第1次，即步骤S2中，在胰酶消化液中进行，其余均采用磷酸盐缓冲液洗涤结合水平摇床机械振荡的方法进行收集，这样的操作既能减少细胞暴露在胰酶中的时间，又能提高细胞的收集效率。
[0020]上述方法借助前后主要操作步骤间的配合能够最大程度提高收集效率。具体是:
[0021]在步骤SI中，向Transwell上室、下室中加入磷酸盐缓冲液洗涤，收集少量漂浮的非贴壁细胞。
[0022]在步骤S2中，向Transwell上室、下室中分别加入胰酶细胞消化液可以消化贴附在Transwell膜上下两侧的细胞，向收集有磷酸盐缓冲液和胰酶液的离心管中加入牛血清终止消化反应，而非直接在Transwell上室、下室中加入含牛血清的细胞培养基终止消化反应，可以避免在上室与下室中产生气泡，既减少对细胞的损伤，又提高细胞收集率。在常规的胰酶消化细胞的过程中，是将含牛血清的培养基加入胰酶中终止细胞消化反应，而在本方法中若照此操作，由于血清成分的存在，在吹打收集细胞过程中很容易产生气泡，直接产生3方面危害:第一，气泡在破裂时机械应力很容易损伤细胞；第二，气泡一旦产生会影响液体的收集，导致细胞收集不彻底；第三，气泡一旦产生影响视野的清晰度，不易在在倒置显微镜下观察细胞的消化程度。而在本发明方法步骤S2中，由于不需要吹打细胞，可以彻底避免气泡产生。同时，由于直接加入牛血清中和消化反应，而不是加入含少量牛血清的培养基，也可以减少整个收集液的体积，从而减少后续离心收集的时间。
[0023]在步骤S3中，通过向Transwell上室、下室中再次加入磷酸盐缓冲液洗涤并结合机械水平振荡，便于残留的细胞脱离，能够再次收集残留于Transwell膜两侧的细胞以及嵌于Transwell膜微孔内的细胞。洗漆中采用水平机械振荡使细胞从Transwell通透性膜上、上表面脱离而非常规的吸管吹打细胞致其脱离，可以有效减少对细胞的损伤、提高收集率，并可简化操作，提高操作效率。
[0024]在步骤S4中，经离心、重悬操作，分别收集得到目标细胞。
[0025]在优选条件下，上述细胞体外收集方法可以分别做如下优化:
[0026]优化一:方法中使用洗涤液为pH 7.4的磷酸缓冲溶液。
[0027]优化二:步骤S2中，在胰酶细胞消化液含0.25%胰酶和0.01 % EDTA条件下，胰酶细胞消化液加入量以分别覆盖Transwell上室与下室底部为宜。胰蛋白酶对细胞的分离作用与细胞的类型和细胞的性质关系密切，不同的组织或细胞系对胰蛋白酶的作用反应不一样，胰蛋白酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关。经前期试验确定，本发明方法中，在与Transwell细胞迁移实验相结合的条件下，Transwell上室、下室中胰酶细胞消化液的量是重要的细胞分散控制条件。针对常用Transwell培养室，建议的胰酶细胞消化液加入量为:24孔Transwell培养室(Transwell小室直径6.5mm)上室加0.1ml、下室加
0.6ml ； 12 孔 Transwell 培养室(Transwell 小室直径 12mm)上室加 0.5ml、下室加 1.5ml ；6孔Transwell培养室(Transwell小室直径24mm)上室加1.5ml、下室加2.6ml。
[0028]优化三:步骤S2中，使用100%牛血清终止消化反应，其目的是减少离心管中液体总体积，减少后续离心时间提高细胞收集量。由于步骤S2中采用向收集有磷酸盐缓冲液和胰酶液的离心管中加入牛血清终止消化反应，离心管中事先收集的磷酸盐缓冲液已对胰酶液起到分散作用，因此使用100%牛血清可以顺利终止消化反应，并在此基础上控制离心管中液体总体积，提高收集效率。
[0029]优化四:步骤S3中，水平振荡采用水平摇床振荡，条件为100r/min~150r/min、振荡5min。在细胞消化操作中，采用吸管吹打细胞是使贴壁细胞脱落分散的常规方式，但本发明经前期试验发现，由于Transwell小室底部通透性膜结构的特殊性，采用吸管吹打很难使嵌附在通透性膜微孔内的细胞完全脱落下来，并且容易产生气泡，对细胞损坏大，细胞收集效率不高。而采用水平摇床实现的轻微机械振荡并有效控制振荡幅度，避免吹打细胞时细胞受力不均，同时避免产生气泡，利于附着在微孔材料内与通透性膜表面的细胞均匀脱落。既能较少细胞损伤，又显著提高了收集率。
[0030]优化五:步骤S4中，将Transwell上室、下室离心管离心，离心条件为:转速200RCF(xg)~250RCF(xg)、时间 lOmin。 [0031]优化六:步骤S4中，向离心管中加入pH 7.35~7.45磷酸盐缓冲液0.5ml~1ml。
[0032]本发明细胞体外收集方法可应用于细胞生物学行为分析试验，包括但不限于细胞克隆、细胞增殖，细胞凋亡、细胞基因和蛋白的表达试验、细胞形态学检测试验等。
[0033]采用本发明体外细胞收集方法收集到的细胞是在相同趋化因子诱导下表现出高、低两种迁移活性的细胞，可作用理想的细胞材料应用于细胞迁移的细胞生物学行为与分子生物学研究，包括细胞克隆、增殖，凋亡、基因和蛋白的表达，以及形态学检测等。基于此，本发明提供一种体外细胞材料，其技术方案如下:
[0034]一种体外细胞材料，其特征在于:包括由相同趋化因子诱导下分离产生的高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料；所述体外细胞材料的制备首先采用Transwell迁移实验使原始细胞材料在趋化因子诱导下迁移培养，当Transwell细胞迁移培养结束后采用上述体外细胞收集方法收集细胞，自Transwell上室中收集得到的细胞材料是所述低迁移性活细胞材料，自Transwell下室中收集得到的细胞材料是所述高迁移性活细胞材料。
[0035]上述体外细胞材料可应用于细胞生物学行为分析试验，包括但不限于细胞克隆、细胞增殖，细胞凋亡、细胞基因和蛋白表达、细胞形态学检测试验等。
[0036]本发明体细胞收集方法可与多种细胞生物学行为实验方法相结合，包括细胞克隆实验、细胞增殖实验，细胞凋亡实验、基因和蛋白的表达实验，以及细胞形态学检测等。其技术方案如下:
[0037]—种细胞生物学行为分析方法，是一种细胞形态学检测方法，其特征在于:首先采用Transwell迁移实验使原始细胞材料在趋化因子诱导下迁移培养，当Transwell细胞迁移培养结束后采用上述体外细胞收集方法收集细胞，分别得到高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料；其次分别将所述高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料接种至细胞培养基进行细胞体外培养；当体外细胞培养结束分别检测高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料形态；所述细胞体外培养中选用的培养基及培养条件根据原始细胞材料特性确定。[0038]一种细胞生物学行为分析方法，是一种细胞骨架形态学检测方法，其特征在于:首先采用Transwell迁移实验使原始细胞材料在趋化因子诱导下迁移培养，当Transwell细胞迁移培养结束后采用上述体外细胞收集方法收集细胞，分别得到高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料；其次分别对所述高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料的细胞骨架染色；染色结束后观察检测细胞骨架形态；所述细胞骨架染色方法根据原始细胞材料特性确定。
[0039]一种细胞生物学行为分析方法，是一种细胞自我更新能力检测方法，其特征在于:首先采用Transwell迁移实验使原始细胞材料在趋化因子诱导下迁移培养，当Transwell细胞迁移培养结束后采用上述体外细胞收集方法收集细胞，分别得到高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料；其次分别对高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料进行细胞克隆培养；克隆培养结束后染色检测细胞自我更新能力；所述细胞克隆培养条件根据原始细胞材料特性确定。
[0040]一种细胞生物学行为分析方法，是一种细胞增殖能力检测方法，其特征在于:首先采用Transwell迁移实验使原始细胞材料在趋化因子诱导下迁移培养，当Transwell细胞迁移培养结束后采用上述体外细胞收集方法收集细胞，分别得到高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料；其次分别检测高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料的细胞增殖能力，检测方法根据原始细胞材料特性确定。
[0041]与现有技术相比，本发明的有益效果是:(I)本发明体外细胞收集方法将Transwell体外迁移实验与体外细胞培养方法相结合,对Transwell体外迁移以后的细胞进行消化与收集，分别收集得到高迁移活性与低迁移活性的细胞，使Transwell体外迁移实验从简单的分析细胞的迁移能力和迁移效率拓展到细胞迁移的细胞生物学行为与分子生物学研究；(2)本发明外细胞收集方法在各操作步骤中，通过设计不同细胞收集方法(在胰酶消化液中收集或在磷酸盐缓冲液中收集)、控制胰酶细胞消化液浓度与消化时间、选择加入牛血清终止细胞消化反应的步骤与环境、结合机械振荡辅助细胞从培养室中脱落分散的方法等六方面主要条件的优化，整体上保证了在Transwell迁移实验的精细条件下能够对迁移结果的微量细胞进行有效收集，保证收集到足量的细胞用于后继研究；(3)本发明提供了由相同趋化因子诱导下分离产生的高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料，该材料是理想的细胞迁移材料，能够应用于细胞生物学行为与分子生物学研究；(4)本发明提供了与体细胞收集方法相结合的多种细胞生物学行为实验方法；(5)本发明方法为体外细胞迁移机制与行为研究提供新的技术手段，且该技术手段建立在成熟的Transwell体外迁移实验之上，应用范围广。
【专利附图】

【附图说明】
[0042]图1-1:实施例1细胞接种-收集量曲线。结果显示细胞的收集量与接种量成正相关。
[0043]图l-2a、图l_2b显示细胞收集效率。图l_2a显示实施例1中细胞经过Transwell培养16h后，迁移至下室的人骨髓间充质干细胞结晶紫染色图片，可见迁移细胞良好铺展在小室的膜底面；图l_2b显示实施例1中采取本发明所用的细胞消化方法收集上室非迁移细胞和下室迁移细胞，Transwell膜表面结晶紫染色图片。可见Transwell膜上几乎没有细胞余留，说明本发明的细胞收集效率较高。
[0044]图2a、图2b显示实施例2中细胞材料分别培养24h后的倒置显微镜照片。图2a表示上室非迁移细胞，图2b表示下室迁移细胞。从图片中可见，与上室非迁移细胞不同，迁移的细胞中有大量细胞碎片，可见细胞在迁移过程中有一定程度的机械损伤。
[0045]图3a、图3b显示实施例3中细胞材料骨架染色结果。图3a表示上室非迁移细胞，图3b表示下室迁移细胞。可见细胞在迁移过程中细胞形态发生改变，使得上室非迁移细胞和下室迁移细胞呈现明显不同的细胞骨架形态特征。
[0046]图4a、图4b显示实施例4中细胞材料进行克隆形成实验的结果。图4a表示上室非迁移细胞，图4b表示下室迁移细胞。结果显示，上室非迁移细胞形成的细胞克隆较小而稀疏，下室迁移细胞形成的克隆较大而致密，说明不同迁移活性的细胞的自我更新能力不
O
[0047]图5显示CKK-8法检测实施例5中细胞材料的增殖曲线。从图中可以看出，不同迁移活性的细胞的增殖能力也明显不同。
【具体实施方式】
[0048]下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。
[0049]实施例一
[0050]如图1-1、图1-2所示，用本发明方法对Transwell体外迁移培养结束的细胞进行收集。
[0051]本实施例米用人骨髓来源的间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,以下简称hMSCs)作为研究对象，采用人来源的重组TOGF-BB(血小板衍生生长因子)作为趋化因子诱导细胞迁移。
[0052]1、实验材料及试剂
[0053]Transwell小室(即Transwell上室):Coring公司的适用于6孔细胞培养板的Transwell小室，小室面积4.67cm2，直径24mm ;货号:#3428、#354576 ;膜材料为聚碳酸脂(Polycarbonate, PC)或者聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene Terephthalate, PET),孔隙大小8.0um。
[0054]细胞培养板(即Transwell下室):Corning公司的6孔细胞培养板，货号CLS3516-50EA
[0055]DMEM低糖培养基:Gibco公司产品，货号11885-076
[0056]磷酸盐缓冲液:pH 7.35~7.45
[0057]预备趋化培养基:将血小板衍生生长因子(I3DGF-BB)以20ng/ml加入DMEM溶液制得，现用现配。
[0058]血小板衍生生长因子(I3DGF-BB):R&D公司产品，货号220_ΒΒ_050
[0059]胰酶细胞消化液:含0.25%胰酶和0.01% EDTA的磷酸盐缓冲液，Gibco公司产品，货号 R-001-100
[0060]牛血清:Gibco公司产品，货号10082147
[0061]结晶紫:Sigma公司产品，货号HT90132
[0062]离心机:Eppendorf公司产品，型号5810[0063]离心管:材料为聚碳酸酯，50ml, Corning公司产品
[0064]血球计数器:sigma公司产品，货号Z359629-1EA
[0065]移液枪:Eppendorf公司产品，规格Iml
[0066]Leica倒置显微镜(型号DMI3000B)
[0067]2、实验操作
[0068]2.1Transwell体外迁移培养(实验)
[0069]I)细胞预处理
[0070]进行细胞迁移实验前换DMEM低糖培养基让细胞饥饿24h。
[0071]2)制作细胞悬液，预备细胞迁移
[0072]饥饿培养的细胞弃去培养液，用PBS洗I遍，加入胰酶细胞消化液Iml~2ml，加入的量以覆盖细胞培养板底部为宜，待细胞变圆后加入含10% FBS的低糖DMEM培养基终止消化，采用血球计数器计数，离心收集细胞，转速200RCF(xg)~250RCF(xg),离心时间5min,用DMEM低糖培养基重悬，并调整细胞密度至2.5 X 105/ml得细胞悬液，待用。 [0073]3)接种细胞及培养
[0074]将Transwell小室加入细胞培养板内，构成Transwell培养室的上室与下室；向Transwell下室中加入预备趋化培养基,加入量2ml/孔；
[0075]取细胞悬液Iml加入Transwell上室,接种时注意动作缓慢,使细胞均匀接种，并避免产生气泡；
[0076]将细胞在37°C 95%二氧化碳培养箱中培养16h~24h。
[0077]2.2Transwell体外迁移培养细胞收集
[0078]步骤S1、初次洗涤收集
[0079]Transwell细胞迁移培养结束并去除Transwell上室、下室内培养液后，在上室、下室中分别加入磷酸盐缓冲液洗涤培养室，加入量为上室、下室各Iml ；
[0080]收集上室与下室中洗涤液分别存入两支50ml离心管中，标记为离心管A、离心管B0
[0081]步骤S2、消化收集
[0082]向Transwell上室、下室中分别加入37°C预热的胰酶细胞消化液，加入量为上室1.5ml/孔，下室2.6ml/孔^fTranswell培养室置于95 % 二氧化碳培养箱，37°C培养2min~5min ;期间可取出Transwell培养室于倒置显微镜下观察，待细胞呈圆形且分散悬浮后，分别收集上室、下室中消化液对应加入离心管A、离心管B中；若发现细胞在倒置显微镜下未呈圆形且分散悬浮，可放入碳培养箱中继续培养直至细胞呈圆形且分散悬浮。
[0083]分别向离心管A、B中加入100%牛血清终止细胞消化，加入量为胰酶细胞消化液的 10%~20%。
[0084]步骤S3、再次洗涤收集
[0085]分别向Transwell上室、下室中加入磷酸盐缓冲液洗涤培养室，加入量同步骤SI ；
[0086]将Transwell培养室(装有Transwell培养小室的Corning6孔细胞培养板)置于水平摇床，100r/min~150r/min、时间5min,
[0087]分别收集上室、下室中洗涤液对应加入离心管A、离心管B中；
[0088]重复以上操作。[0089]步骤S4、离心收集细胞
[0090]将离心管A、离心管B离心，转速200RCF(xg)~250RCF(xg)，时间IOmin ；
[0091]分别去除上清液，向离心管A、离心管B中加入磷酸盐缓冲液0.5ml~Iml ;分别收集并重悬离心管A、B底部细胞团块，收集到目标细胞。其中，离心管A中是以人来源的重组TOGF-BB为趋化因子诱导下分离产生的低迁移活性细胞，离心管B中是以人来源的重组TOGF-BB为趋化因子诱导下分离产生的高迁移活性细胞。
[0092]用血球计数器计数，计算上室、下室的细胞比率、细胞迁移率、以及细胞收集效率(图1-1);通过结晶紫染色分析细胞收集效率(图l-2a、图l-2b)。
[0093]本实施例中，结晶紫染色浓度0.1 %,时间10分钟；采用Leica倒置显微镜DMI3000 B进行拍照。
[0094]实施例二
[0095]相同趋化因子诱导下分离产生的高迁移性活细胞与低迁移活性细胞的形态学检测实验。
[0096]细胞培养基:含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基
[0097]DMEM低糖培养基:同实施例一
[0098]倒置显微镜:同实施例一
[0099]以实施例一收集所得离心管A、离心管B中细胞为材料，分别接种至细胞培养基，置于37°C、95%二氧化碳培养箱中，分别培养24h后在倒置显微镜下检测细胞形态学特征(图 2a、图 2b)。
[0100]实施例三
[0101]相同趋化因子诱导下分离产生的高迁移性活细胞与低迁移活性细胞的细胞骨架形态学检测实验。
[0102]四甲基罗丹明标记的鬼笔环妝(Phalloidin - Tetramethylrhodamine Bisothiocyanate:Sigma 公司产品，货号 P1951
[0103]倒置显微镜:同实施例一
[0104]以实施例一收集所得离心管A、离心管B中细胞为材料，分别采用四甲基罗丹明标记的鬼笔环肽对细胞染色，倒置显微镜下检测细胞骨架形态特征(图3a、图3b)。
[0105]本实施例中，鬼笔环肽染色方法参照Sigma产品说明书操作。
[0106]实施例四
[0107]相同趋化因子诱导下分离产生的高迁移性活细胞与低迁移活性细胞的自我更新能力检测实验。
[0108]细胞培养板、倒置显微镜、结晶紫均同实施例一
[0109]以实施例一收集所得离心管A、离心管B中细胞为材料，分别接种至细胞培养板，接种密度100个/孔，培养时间8d~IOd ;见到明显可见的细胞克隆后结束培养，采用结晶紫对细胞克隆进行染色采用倒置显微镜进行观察(图4a、图4b)。
[0110]本实施例中，细胞培养条件和结晶紫染色方法同实施例一。
[0111]实施例五
[0112]相同趋化因子诱导下分离产生的高迁移性活细胞与低迁移活性细胞的增殖能力检测实验。[0113]CCK-8 试剂:Sigma 公司产品，货号 96992-500TESTS
[0114]以实施例一收集所得离心管A、离心管B中细胞为材料，分别采用CCK-8法检测细胞增殖能力(图5)。
[0115]本实施例中，采用96孔板进行检测，细胞接种量为2000个/孔，检测时间点为1、
3、5、7、9天。检测时CCK-8加入量为IOul/孔，检测吸光度为450nm。
【权利要求】
1.一种细胞体外收集方法，其特征在于:应用于Transwell细胞迁移实验；Transwell细胞迁移培养结束并去除Transwell上室、下室内培养液后，采用胰酶消化并结合机械振荡的方法分别对Transwell细胞迁移实验后上室、下室中的细胞进行消化、收集；胰酶细胞消化操作中，洗涤液为PH 7.35~7.45磷酸盐缓冲液，胰酶细胞消化液含0.25%胰酶和0.01% EDTAo
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:依如下步骤实施: 步骤S1、初次洗涤 Transwell细胞迁移培养结束并去除Transwell上室、下室内培养液后，在上室、下室中分别加入磷酸盐缓冲液洗涤培养室，收集上室与下室中洗涤液分别存入二离心管中，分别标记为离心管A、离心管B ; 步骤S2、消化收集 向Transwell上室、下室中分别加入胰酶细胞消化液，待细胞分散悬浮，分别收集上室、下室中消化液对应加入离心管A、离心管B中，分别向离心管A、离心管B中加入牛血清终止细胞消化； 步骤S3、再次洗涤收集 分别向Transwell上室、下室中加入磷酸盐缓冲液,将Transwell培养室水平振荡，分别收集上室、下室中洗涤液对应加入离心管A、离心管B中； 步骤S4、离心收集细胞 将离心管A、离心管B离心，去除上清液，分别向离心管A、离心管B中加入磷酸盐缓冲液，重悬并收集离心管底部细胞团块，得收集细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述步骤S2中，胰酶细胞消化液加入量为分别覆盖Transwell上室与下室底部。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述步骤S2中，胰酶细胞消化液加入量是如下之一: 24孔Transwell培养室，上室加0.1ml、下室加0.6ml ； 12孔小室Transwell培养室，上室加0.5ml、下室加1.5ml ； 6孔小室Transwell培养室，上室加1.5ml、下室加2.6ml。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述步骤S2中，分别向离心管中加入100%牛血清终止细胞消化反应，加入量是胰酶细胞消化液加入量的10%~20%。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述步骤S3中，所述水平振荡是水平摇床振荡，100r/min ~150r/min、时间 5min。
7.根据权利要求1~6任一所述的细胞体外收集方法，其特征在于:应用于细胞生物学行为分析试验。
8.一种利用权利要求1~6任一所述的细胞体外收集方法实现的细胞生物学行为分析方法，是一种细胞检测方法，其特征在于:依如下步骤实施: 步骤S1、首先采用Transwell迁移实验使原始细胞材料在趋化因子诱导下迁移培养，当Transwell细胞迁移培养结束后采用上述体外细胞收集方法收集细胞，分别得到高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料； 步骤S2、实施如下检测方法之一之一、细胞形态学检测:分别将所述高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料接种至细胞培养基进行细胞体外培养；当体外细胞培养结束分别检测高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料形态；所述细胞体外培养中选用的培养基及培养条件根据原始细胞材料特性确定； 之二、细胞骨架形态学检测:分别对所述高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料的细胞骨架染色；染色结束后观察检测细胞骨架形态；所述细胞骨架染色方法根据原始细胞材料特性确定； 之三、细胞自我更新能力检测:分别对高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料进行细胞克隆培养；克隆培养结束后染色检测细胞自我更新能力；所述细胞克隆培养条件根据原始细胞材料特性确定； 之四、细胞增殖能力检测:分别检测高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料的细胞增殖能力，检测方法根据原始细胞材料特性确定。
9.一种体外细胞材料，其特征在于:包括由相同趋化因子诱导下分离产生的高迁移性活细胞材料与低迁移活性细胞材料；所述体外细胞材料的制备首先采用Transwell迁移实验使原始细胞材料在趋化因子诱导下迁移培养，当Transwell细胞迁移培养结束后采用上述体外细胞收集方法收集细胞，自Transwell上室中收集得到的细胞材料是所述低迁移性活细胞材料，自Transwell下室中收集得到的细胞材料是所述高迁移性活细胞材料。
10.根据权利要求9所述的体外细胞材料在细胞生物学行为分析试验中的应用。
【文档编号】C12N5/00GK104017768SQ201410280422
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】李娟 , 郝晋, 赵志河, 王娅婷, 方善宝 申请人:四川大学