草莓皱缩病毒的快速检测试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开了检测草莓皱缩病毒(Strawberry?crinkle?virus,SCV)的专用引物及其应用。检测草莓皱缩病毒(Strawberry?crinkle?virus,SCV)的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。利用本发明引物进行检测，检测过程快速、灵敏、操作简便，不需要其他贵重仪器和试剂，特别适合种苗繁育、脱毒培养、田间调查时快速检测和生产基层技术人员掌握应用。
【专利说明】草莓皱缩病毒的快速检测试剂盒及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及草莓皱缩病毒的RT-LAMP检测引物组、检测试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002]草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCV)分类学上隶属弹状病毒科(Rhabdoviridae)细胞质弹状病毒属(Cytorhabdovirus)。病毒粒体长约163_383nm,直径74-78nm，单分体基因组，-ssRNA，长2291bp。1932年在美国俄勒冈州草莓品种Marshall上首次被报道，1949年W.Prentice把草莓病毒3 (Strawberry virus3)改名为皱缩病毒。病毒外壳由3个主要的结构蛋白组成,大小分别为78、47、25kDa。病毒侵染寄主植物后,存在于寄主的叶肉、表皮、韧皮部组织及未成熟木质部中，并在内质网池中形成病毒粒子聚集体。主要通过蚜虫持久性方式和嫁接传播，植株相互接触、种子和花粉不传播。该病毒在世界各地广泛分布，并存在株系分化现象。
[0003]草莓皱缩病毒在草莓各栽培区分布较广，危害较重。由于姆虫传播等原因，病毒病害防治困难，因此，建立高效灵敏的检测技术，成为解决种苗检测、早期鉴定等问题的关键，为草莓栽培提供保障。草莓皱缩病毒的检测技术目前包括指示植物的小叶嫁接法和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)等。小叶嫁接法周期长、灵敏度较低，反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测病毒灵敏度高，但需要特殊的仪器和试剂，检测时间较长，很难在农业生产单位和技术推广部门应用检测。
[0004]逆转录环介导等 温扩增技术(Reversetranscript1n loop-mediated isothermalamplificat1n, RT-LAMP)检测病毒操作简便，不需要特殊的仪器和试剂，操作简单，可以在恒温条件下快速检测，不需要长时间的温度循环和昂贵的仪器，尤其是反转录和扩增反应都能在恒定温度下同时进行，降低了检测时间和成本。反应完成后，还可以通过荧光染色可以直接观察，能进一步减少时间。逆转录环介导等温扩增技术与其他病毒检测方法相比，快速、简便、灵敏，目前尚未有将逆转录环介导等温扩增技术在草莓皱缩病毒检测上的应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供检测草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCV)的专用引物以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的草莓皱缩病毒(Strawberry crinklevirus, SCV)的快速分子检测试剂盒及方法。
[0006]本发明所提供的检测草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCV)的专用引物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
[0007]本发明还提供一种检测草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCV)的试剂盒，包括所述的专用引物。
[0008]本发明所述专用引物在制备检测草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCV)的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围[0009]上述专用引物或试剂盒在鉴定草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCV)病毒病中的应用也是本发明的保护范围。
[0010]本发明还保护一种检测草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCV)或检测草莓草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCV)病害发生危害的方法,包括如下步骤:
[0011](I)提取待测生物样本的基因组RNA ；
[0012](2)以步骤(1)的基因组RNA为模板，用所述的专用引物进行逆转录环介导恒温扩增；
[0013](3)根据步骤(2)的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCV)或者是否感染草莓皱缩病毒(Strawberry crinklevirus, SCV)病害。
[0014]所述逆转录环介导恒温扩增的反应程序为:65°C 30分钟，80°C 10分钟。
[0015]所述逆转录环介导恒温扩增的反应体系中，序列表的序列I所示DNA和序列表的序列4所不DNA的浓度均为0.4 μ M,序列表的序列2所不DNA和序列表的序列3所不DNA的浓度均为0.2 μ Μ。
[0016]所述逆转录环介导恒温扩增的体系包括:0.4μΜ序列表的序列I所示DNA，0.4μΜ序列表的序列4所示DNA，0.2μΜ序列表的序列2所示DNA，0.2 μ M序列表的序列3所示DNA, 2.5 μ IlOXBst buffer, 4mM MgSO4,0.4mM dNTPs, 0.25M Betaine, 3mM DTT，5U AMV 逆转录酶(AMV Reverse Tra nscriptase), 25U RNase Inhibitor, 8U Bst DNA polymerase, DEPCddH20，基因组RNAl μ I，扩增体系总体积为25 μ I。
[0017]所述逆转录环介导恒温扩增产物的检测方法有两种:
[0018]1.扩增产物中加入0.1 μ I荧光染料Green DNA Dye,肉眼直接观察，染有草莓皱缩病毒的样本会有沉淀物形成并呈现黄绿色，无草莓皱缩病毒侵染的样本透明并呈橘红色；
[0019]2.常规凝胶电泳和紫外成像方法检测RT-LAMP扩增产物，感染有草莓皱缩病毒的样本能形成瀑布型条带。
[0020]本发明基于逆转录环介导等温扩增技术(Reverse transcript1n loop-mediatedisothermal amplificat1n, LAMP)的草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCV)检测试剂盒及方法，该试剂盒根据草莓皱缩病毒的基因保守区域设计了四个特异性引物，可以特异性的检测样品中草莓皱缩病毒。利用本发明试剂盒进行检测，检测过程快速、灵敏、操作简便，不需要其他贵重仪器和试剂，特别适合种苗繁育、脱毒培养、田间调查时快速检测和生产基层技术人员掌握应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0021 ] 图1为SCV RT-LAMP各反应温度扩增产物检测；(a)为RT-LAMP产物的电泳和凝胶成像技术检测；(b)为RT-LAMP产物加入Green DNA Dye检测；泳道I:60°C ;泳道2:61°C ；泳道 3:62°C ;泳道 4:63°C ;泳道 5:64°C ;泳道 6:65°C。
[0022]图2为SCV RT-LAMP不同反应时间扩增产物检测；(a)为RT-LAMP产物的电泳和凝胶成像技术检测；(b)为RT-LAMP产物加入Green DNA Dye检测；泳道I:30min ;泳道2:45min ;泳道 3:60min ;泳道 4:75min。
[0023]图3为SCV RT-LAMP引物FIP/BIP不同终浓度扩增产物检测；(a)为RT-LAMP产物的电泳和凝胶成像技术检测；(b)为RT-LAMP产物加入Green DNA Dye检测；泳道1:0.4 μ M ;泳道 2:0.8μΜ;泳道 3:1.2μΜ;泳道 4:1.6μΜ。
[0024]图4为SCV RT-LAMP弓丨物F3/B3不同终浓度扩增产物检测；(a)为RT-LAMP产物的电泳和凝胶成像技术检测；(b)为RT-LAMP产物加入Green DNA Dye检测；泳道1:0.10 μ M ;泳道 2:0.20 μ M ;泳道 3:0.30 μ M ;泳道 4:0.40 μ Μ。
[0025]图5为SCV RT-LAMP Mg2+不同终浓度扩增产物检测；(a)为RT-LAMP产物的电泳和凝胶成像技术检测；(b)为RT-LAMP产物加入Green DNA Dye检测；泳道1:2mM ;泳道2:4mM ；泳道3:6mM;泳道4:8mM。
[0026]图6为SCV RT-LAMP dNTPs不同终浓度扩增产物检测；(a)为RT-LAMP产物的电泳和凝胶成像技术检测；(b)为RT-LAMP产物加入Green DNA Dye检测；泳道1:0.4mM ;泳道2:
0.8mM ;泳道 3:1.2mM ;泳道 4:1.6mM ;泳道 5:2.0mM。
[0027]图7为SCV RT-LAMP betaine不同终浓度扩增产物检测；(a)为RT-LAMP产物的电泳和凝胶成像技术检测；(b)为RT-LAMP产物加入Green DNA Dye检测；泳道1:0.25M ;泳道
2:0.50M ;泳道 3:0.75M ;泳道 4:1.0M ;泳道 5:1.25M。
[0028]图8为SCV RT-LAMP DTT浓度扩增产物检测；(a)为RT-LAMP产物的电泳和凝胶成像技术检测；(b)为RT-LAMP产物加入Green DNA Dye检测；泳道I:1.0mM ;泳道2:2.0mM ；泳道 3:3.0mM ;泳道 4:4.0mM。
[0029]图9为SCV RT-LAMP灵敏度测定；(a)为RT-LAMP产物的电泳和凝胶成像技术检测；(b)为RT-LAMP产物加入Green DNA Dye检测；(c)为RT-PCR扩增产物电泳检测；泳道I =RNA原液做模板；泳道2-8依次为RNA原液稀释11UO2UO' ΙΟ4、105、16和17倍获得的稀释液。
[0030]图10为SCV RT-LAMP的特异性测定；其中，(a)为RT-LAMP产物的电泳和凝胶成像技术检测；(b)为RT-LAMP产物加入Green DNA Dye检测；泳道1:健康植株样品RNA ;泳道2-5依次为含SMoV, SVBV, SMYEV和SCV的植株样品RNA。
【具体实施方式】
[0031]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。
[0032]实施例1、草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCV)逆转录环介导引物及其应用
[0033]一、草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCV)逆转录环介导引物的获得
[0034] 根据美国NCBI中的GenBank发布的草莓皱缩病毒(Strawberry crinklevirus, SCV) RNA的cDNA序列(序列登录号分别为AY331390.1)，通过软件DNAMAN7.0进行同源性分析后找出草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus, SCV)分离蛋白mRNA可阅读区序列作为模板，使用在线软件 Primer3Input (http: //b1inf0.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)设计RT-LAMP引物，并对设计的引物进行筛选，序列调整，验证，最终获得一组敏感性和特异性很高的RT-LAMP引物。引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如下表1 ;[0035]表1SCV RT-LAMP检测引物组
[0036]
【权利要求】
1.检测草草莓皱缩病毒(Strawberrycrinkle virus)的专用引物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
2.—种检测草莓皱缩病毒(Strawberrycrinklevirus)的试剂盒,包括权利要求1所述的专用引物。
3.权利要求1所述专用引物在制备检测草莓皱缩病毒(Strawberrycrinkle virus)的试剂盒中的应用。
4.权利要求1所述专用引物或权利要求2所述试剂盒在鉴定草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus)病毒病中的应用。
5.一种检测草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus)或检测草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus)病毒病感染的方法,包括如下步骤: (1)提取待测生物样本的基因组RNA； (2)以步骤(1)的基因组RNA为模板，用权利要求1所述的专用引物进行逆转录环介导恒温扩增； (3)根据步骤(2)的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有草莓皱缩病毒或者是否感染草莓皱缩病毒病害。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于:所述逆转录环介导恒温扩增的反应程序为:650C 30 分钟，80°C 10 分钟。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述逆转录环介导恒温扩增的反应体系中，序列表的序列I所示DNA和序列表的序列4所示DNA的浓度均为0.4 μ M，序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA的浓度均为0.2 μ Μ。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述逆转录环介导恒温扩增的体系包括:0.4 μ M序列表的序列I所示DNA，0.4 μ M序列表的序列4所示DNA，0.2 μ M序列表的序列2所示 DNA, 0.2 μ M序列表的序列 3 所示 DNA, 2.5 μ IlOXBst buffer, 4mMMgS04,0.4mM dNTPs,0.25M Betaine, 3mM DTT, 5U 逆转录酶，25U RNase Inhibitor, 8U Bst DNA polymerase, DEPCddH20，扩增体系总体积为25 μ I。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:所述逆转录环介导恒温扩增产物的检测方法为下述I)或2)所述的方法: 1)扩增产物中加入0.1 μ I荧光染料Green DNA Dye,肉眼直接观察，染有草莓皱缩病毒的样本会有沉淀物形成并呈现黄绿色，无草莓皱缩病毒侵染的样本透明并呈橘红色； 2)凝胶电泳和紫外成像方法检测RT-LAMP扩增产物，感染有草莓皱缩病毒的样本能形成瀑布型条带。
【文档编号】C12Q1/70GK104032036SQ201410280094
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月20日 优先权日:2014年6月20日
【发明者】尚巧霞, 冉策, 陈柳, 陈笑瑜, 邢冬梅, 胡学军, 魏艳敏, 刘正坪, 韩成贵 申请人:北京农学院