对柑桔大实蝇进行亲缘关系和聚类分析的分子标记方法
【专利摘要】本发明一种对柑桔大实蝇进行亲缘关系和聚类分析的分子标记方法，属于分子标记【技术领域】。本发明利用7条RAPD引物和10对SRAP引物组合对柑桔大实蝇DNA进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并拍照记录结果，统计被检测材料的扩增带；用遗传分析软件进行分析，获得个体之间的遗传距离，根据个体间的遗传距离聚类结果，绘制不同地理种群柑桔大实蝇的聚类图，区分不同的类群。本发明反应稳定、扩增片段清楚、多态性高，构建了柑桔大实蝇种群遗传多样性的分子反应体系，能揭示其种群间的遗传多样性，能快速、准确地对柑桔大实蝇进行聚类分析，区分不同的种群，对于监测及防治柑桔大实蝇有重要意义。
【专利说明】对柑桔大实蝇进行亲缘关系和聚类分析的分子标记方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于分子标记【技术领域】，涉及一种分子标记方法，尤其涉及一种对柑桔大 实蝇进行亲缘关系和聚类分析的分子标记方法。 【背景技术】
[0002] 柑桔是世界第一大水果，年产量超过1亿吨，约占世界水果总产量的四分之一。目 前柑桔业已成为中国南方广大地区、贫困山区和三峡库区农村经济支柱产业之一。柑桔大 实妮Bactrocera (Tetradacus)minax (Enderlein)俗称"柑蛆"，又名柑桔大实妮，柑桔大果 蝇，被害果称"蛆果"、"柑蛆"，是国际国内植物检疫性有害生物。传统的柑桔大实蝇鉴定方 法一直是以形态学为主要依据，但该方法在幼虫期不能准确快速的检测与鉴定出柑桔大实 蝇。搞清楚柑桔大实蝇不同地理种群之间的遗传关系对柑桔大实蝇的系统鉴定很有必要， 因此需要发展一种能够快速、准确的对柑桔大实蝇进行亲缘关系分析和分类的方法。
[0003] RAPD(Random Amplified poloymorphic DNA)作为显性分子标记，具有操作简单、 快速，成本较低，对DNA的纯度要求不高等特点，在种属特异性鉴定等方面被广泛地应用。 而 SRAP(Sequence_Related Amplified Polymorphism)标记是基于 DNA 分子标记技术的优 缺点基础上发展起来的新的分子标记技术，其引物设计简单，尤其是正向引物的CCGG和反 向引物的AATT核心序列对基因的0RF进行扩增，显著提高了扩增结果与表型/基因型的相 关性，扩增产物因不同物种、不同基因型的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性， SRAP标记在物种种群遗传结构及亲缘关系分析中得到了广泛的应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种对柑桔大实蝇进行亲缘关系和聚类分析的分子标记方 法，有助于快速、准确地辨析区域间柑桔大实蝇种群的亲缘关系，对柑桔大实蝇进行聚类分 析，区分不同的种群。
[0005] 本发明解决其技术问题采用的技术方案：一种对柑桔大实蝇进行亲缘关系和聚类 分析的分子标记方法，包括如下步骤：
[0006] (1)提取待测柑桔大实蝇样品的DNA，保存备用；
[0007] (2)用7条RAPD引物对步骤1得到的DNA进行PCR扩增，所述的7条RAPD引 物名称和序列如下：1 :ACGCCAGAGG，2 :GAGCGAGGCT，3 :CAGGGGTGGA，4 :GGTCTGGTTG，S75 : GACGGATCAG, Y06 ：AAGGCTCACC, Y18 ：GCTGAGTCAG ；
[0008] (3)用10对SRAP引物组合对步骤1得到的DNA分别进行PCR扩增，所述的10 对 SRAP 引物组合名称为：3F-1R，3F-2R，9F-1R，9F-3R，9F-2R，9F-11R，4F-10R，12F-11R， 10F-3R，10F-10R;其中，所述各引物序列如下：
[0009]
【权利要求】
1. 一种对柑桔大实蝇进行亲缘关系和聚类分析的分子标记方法，其特征在于：包括如 下步骤： (1) 提取待测柑桔大实蝇样品的DNA，保存备用； (2) 用7条RAPD引物对步骤1得到的DNA分别进行PCR扩增，所述的7条RAH)引 物名称和序列如下：1 :ACGCCAGAGG，2 :GAGCGAGGCT，3 :CAGGGGTGGA，4 :GGTCTGGTTG，S75 : GACGGATCAG, Y06 ：AAGGCTCACC, Y18 ：GCTGAGTCAG ； (3) 用10对SRAP引物组合对步骤1得到的DNA分别进行PCR扩增，所述的10对SRAP 引物组合名称为：3F-1R，3F-2R，9F-1R，9F-3R，9F-2R，9F-11R，4F-10R，12F-11R，10F-3R， 10F-10R ;其中，所述各引物序列如下：
(4) 将步骤2、3得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并拍照记录结果，统计被检测材 料的扩增带，有带计为" 1"，无带计为"〇"，强带和弱带均计为" 1"，组成"0-1"数据矩阵；用 遗传分析软件进行分析，获得个体之间的遗传距离，根据个体间的遗传距离聚类结果，绘制 不同地理种群柑桔大实蝇的聚类图，区分不同的类群。
2. 根据权利要求1所述的对柑桔大实蝇进行亲缘关系和聚类分析的分子标记方法， 其特征在于：所述步骤2中的PCR反应体系为：总体积为25uL的PCR反应体系含1XPCR BufTer2.0yL、1.5mmol/yL MgCl21.5yL、500ymol/L dNTPsl.5yL、0.5ymoL/L 引物 1.(^1^、川了39酶0.4 4 1^、20叩/^1^0嫩模板1.(^1^补超纯水至25 4 1^。
3. 根据权利要求1所述的对柑桔大实蝇进行亲缘关系和聚类分析的分子标记方法， 其特征在于：所述步骤3中的PCR反应体系为：总体积为25uL的PCR反应体系含1XPCR Buffer2. 0 μ L> 1. 5mmol/ μ L MgCl2l. 5 μ L、500 μ mol/L dNTPsl. 5 μ L、0. 5 μ moL/L 的上下游 引物各1.(^1、川丁&9酶0.4以1^、20叩/^1^嫩模板1.(^1^补超纯水至25 4 1^
4. 根据权利要求1所述的对柑桔大实蝇进行亲缘关系和聚类分析的分子标记方法， 其特征在于：所述步骤2中的PCR扩增程序为：94°C预变性5min ;94°C 60s，38°C 60s， 72°C 90s，共 32 次循环；72°C延伸 lOmin。
5. 根据权利要求1所述的对柑桔大实蝇进行亲缘关系和聚类分析的分子标记方法， 其特征在于：所述步骤3中的PCR扩增程序为：94°C预变性3min ;94°C 40s，63°C 40s， 72°C 60s，循环15次，每次循环退火温度降低0. 5°C ;94°C 40s，55. 5°C 40s，72°C 60s，循环 25 次；72°C延伸 lOmin。
6. 根据权利要求1所述的对柑桔大实蝇进行亲缘关系和聚类分析的分子标记方法，其 特征在于：所述步骤4中的遗传软件分析采用DPS软件，按Nei的方法计算相似系数和遗传 距离，采用非加权配对算术平均法进行聚类分析。
【文档编号】C12Q1/68GK104087664SQ201410315887
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月3日
【发明者】刘浩强, 冉春, 李鸿筠, 丛林, 胡军华, 姚廷山 申请人:西南大学柑桔研究所