一种豇豆抗枯萎病的苗期鉴定方法
【专利摘要】本发明属于园艺作物抗病性检测领域，涉及一种豇豆抗枯萎病的苗期鉴定方法，包括豇豆种子催芽、播种与育苗；接种专用菌株的分离、培养，枯萎病菌孢子悬浮液制备；病原菌侵染；发病调查等步骤。采用菌液浸泡侵染幼苗根系方式使豇豆幼苗人工感染枯萎病菌，将豇豆种子在育苗基质中培养至二叶一心，再拔出侵染，故豇豆幼苗的长势、大小易于控制，容易拔起，保证了鉴定结果的一致性和可靠性。本发明采用了专用的指示菌株、合适的侵染时间、合适的枯萎病菌孢子悬浮液浓度，侵染效果较好，接菌均匀，发病迅速。本发明只需将长势一致的不同植株直接自然摩擦伤根后侵染病菌，操作简便、鉴定迅速、结果可靠，尤其适合大批量豇豆育种材料的枯萎病抗性鉴定。
【专利说明】一种豇豆抗枯萎病的苗期鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于园艺作物抗病性鉴定【技术领域】，具体涉及一种豇豆抗枯萎病的苗期鉴定方法，与作物抗病育种中抗性材料的早期快速鉴定【技术领域】有关。
【背景技术】
[0002]豇豆(学名Vigna unguiculata)俗称角豆、姜豆、带豆、挂豆角，属于豆科一年生植物，主要产于热带、亚热带和温带地区。豇豆在我国栽培历史悠久，种植分布面积广，除青海和西藏外，全国各省市区均有种植。近年来，我国豇豆种植面积维持在33万公顷以上。河北、河南、江苏、浙江、安徽、四川、重庆、湖北、湖南、广西等地每年栽培面积超过I万公顷，并形成了浙江丽水、江西丰城、湖北双柳等面积超过1000公顷的大型专业化豇豆生产基地。一般以春夏栽培为主，其次是秋季栽培。由于豇豆生长于高温湿热的环境，易诱发豇豆枯萎病的发生。
[0003]紅豆枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schl.)以菌丝体和厚垣孢子随病残体遗落在土中越冬(种子也能带菌)，能在土中营长时间的腐生生活。病菌借助灌溉水、农具、施肥等传播，从伤口或根冠部侵入，在维管束组织的导管中繁殖，并向上扩展。豇豆枯萎病多数从开花期开始，结荚盛期可造成植株大量枯死。初期病株下部叶片先变黄，逐渐向上发展，病叶叶脉变褐，近脉的叶肉组织变黄，终致叶片干枯、脱落，病株易被拔起。检视根部及茎基部，根部变褐腐烂，根茎维管束变红褐色至黑褐色。严重危害时，全田植株死亡，仅剩枯藤一片，相当触目。
[0004]培育抗病品种是防治豇豆枯萎病的重要方法之一，抗性资源的获得对于抗病育种意义重大，客观、快速地评价豇豆品种枯萎病抗性的强弱是豇豆抗枯萎病育种过程中最基础、最重要的环节。目前豇豆枯萎病抗性鉴定主要是通过人工病圃鉴定和室内苗期鉴定。人工病圃鉴定被认为是最接近自然实际，最为可靠的抗性鉴定方法，在抗病育种过程中应用最为普遍。但此鉴定方法过于依赖自然发病条件，如果环境条件不适合发病或者病圃病菌分布不均匀，容易造成抗性误判，历时太长，且具有较强的季节性。豇豆苗期鉴定方法简便、迅速、容易控制外界环境条件。常用的方法为，剪根幼苗浸根法(方木壬等.豇豆枯萎病抗原筛选研究，华南农业大学学报，1984，5 (4):57-61.)、胚根法(张衍荣等.豇豆枯萎病抗病性鉴定技术研究，华南农业大学学报，2005，26 (3):22-25.)。其中胚根法发芽率与成苗生长势的差异常造成结果不一致，不能准确反映苗期的抗性，并且胚根接种到苗期显症的周期比较长。剪根幼苗浸根法，虽然周期较短，简便可行，但剪根长短易不均匀，且剪根费时费力。两种鉴定方法均有一定的缺点，这是造成苗期鉴定结果与人工病圃鉴定存在显著差异的原因之一。因此探索一套发病迅速、育苗时间短、管理简便、适合大批量育种材料的豇豆枯萎病抗性快速鉴定方法对于评价豇豆种植材料的抗病性、培育抗病新品种、进行合理品种布局具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种豇豆抗枯萎病的苗期接种鉴定方法。该方法简便易行，所需设备较少，结果可靠，能较为准确地反映不同豇豆品种对枯萎病的抗性表现。
[0006]实现本发明的技术方案为:
[0007]一种豇豆抗枯萎病的苗期接种鉴定方法，包括以下步骤:
[0008]A、豇豆种子催芽:
[0009]选择市售和常用栽培的豇豆品种作为鉴定对象；
[0010]挑选籽粒饱满的豇豆品种种子，用纱布包好，在55°C恒温水浴锅中温汤浸种2小时，进行种子消毒，再将种子放在铺有吸水纸的培养皿中，最后33°C恒温处理，直至得到萌发种子。
[0011]B、播种与幼苗培育:
[0012]将萌发的种子播种于育苗基质(简称基质，配方见后)，进行培养，得到二叶一心的幼苗。
[0013]C、豇豆枯萎病菌孢子悬浮液的制备:
[0014]a.选择豇豆枯萎病田间典型病株，在发病植株茎基部病健交界处切取2mmX 2mm组织，用无菌水冲洗干净；
[0015]b.对上述组织进行消毒处理，用70%酒精消毒0.5min，再用0.1 %的升汞溶液消毒0.5-lmin，然后用无菌水冲洗3次，每次lmin，得到消毒处理后的病组织；
[0016]c.将消毒处理后的病组织接入PDA平板上，置25°C恒温条件下培养；
[0017]d.当接种后的PDA平板培养基的表面即植物病组织周围长出菌落后，将该菌落转入PDA斜面培养基中(在4°C冰箱内贮存备用，或可长期应用)，筛选得到鉴定豇豆枯萎病的指不菌即5[豆枯萎病菌JWS-1,Fusarium oxysporum Schl.JWS-1,于2014年7月3日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO:M2014314 ；
[0018]e.从转入菌落的PDA斜面培养基中取豇豆枯萎病菌JWS-1，转入PDA平板培养基中，25°C恒温培养7天，得到培养好的豇豆枯萎病菌；
[0019]g.将培养好的豇豆枯萎病菌，每皿加1mL灭菌水，用灭菌的盖玻片刮取表面菌丝层，用三层纱布过滤得到分生孢子滤液，用血球计数板调整孢子浓度，得到枯萎病菌孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度为3-7 X 16个/mL，优选为5 X 16个/mL。
[0020]D、病原菌侵染处理:
[0021]a.用铲子将二叶一心的幼苗从所述育苗基质中取出(在提苗过程使之自然摩擦伤根，不需人工剪根来伤根)轻轻提苗并抖动，进行清洗处理，无需进行伤根处理，得到自然伤根幼苗；
[0022]b.将自然伤根后的幼苗进行侵染豇豆枯萎病菌处理，放置到枯萎病菌孢子悬浮液中，浸泡1min得到侵染苗，然后将所述的侵染苗移植到装有消毒沙土基质的营养钵中，置于塑料大棚中培养，温度控制在28±2°C，相对湿度控制在85%或以上，进行正常栽培管理，10天后调查发病情况。
[0023]E、发病调查:
[0024]分别于侵染处理后的10d、15d、20d、25d，调查所述侵染苗的发病状况，根据豇豆枯萎病病情分级标准确定O、1、3、5、7、9共6个发病等级，再根据该发病等级计算病情指数，最后根据该病情指数判断所述豇豆品种的豇豆枯萎病抗性分级。
[0025]上述育苗基质及制备方法为:蛭石和干河沙按重量比为1:10混匀，再加入福尔马林溶液或将基质在阳光下高温焖晒消毒，得到育苗基质。
[0026]豇豆枯萎病病情分级标准见表1:
[0027]表I豇豆枯萎病分级标准
[0028]
病级苗期分级标准
0健株，无症状
1子叶出现轻微病症，但生长正常
3I片子叶黄化，影响生长
52片子叶黄化，或一片子叶枯死
72片子叶生长僵化，植株部分萎蔫或停止生长
9整株萎蔫、倒伏或枯死
[0029]病情指数(DI)计算方式为:
[0030]病情指数=Σ (级数X株数)/(最高级数X总株数)X 100。式中Σ为和
[0031]上述的的豇豆枯萎病抗性分级标准如下:
[0032]按病情指数(DI)分别划分为，高抗(HR):0 < DI彡15 ;抗(R): 15 < DI彡35冲等(M):35 < DI ^ 55 ;感⑶:55 < DI ^ 75 ;高感(HS):DI > 75。
[0033]本发明的试验材料的豇豆品种包括之豇28、宁豇三号、台湾七号豆角王、桂星101长豆角、雪龙888白玉豇豆、油白长豆角810以及美国无架豆和紫秋豇。
[0034]本发明的PDA平板培养基及制备方法为:去皮马铃薯200g，切成厚约2mm的片，力口入100mL水煮沸30min，用4层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g和琼脂20g，加热溶解后再补足水份至100mL ；自然pH(不调整)，于121°C高压蒸汽下灭菌30min ;之后在超净工作台上倒平板，得到PDA平板培养基。
[0035]作为优选方案，上述的枯萎病菌孢子悬浮液孢子浓度为3-7X 16个/mL，优选为5 X 16 个/mL。
[0036]作为优选方案，上述的浸泡豇豆枯萎病菌孢子悬浮液时间为lOmin。
[0037]本发明相比现有技术具有以下有益效果:
[0038]1、按步骤进行鉴定的方法与大田成株期接种相比，避免了气候条件不适宜、环境中其它病虫害等因素的影响，在室内进行苗期抗病性鉴定条件较易控制，鉴定周期短、操作简便、能节省大量人力物力，尤其适合大批量的豇豆材料的枯萎病抗性鉴定。
[0039]2、豇豆出苗好，根系发育完整。采用蛭石沙土做培养土吸水好，透气性强，有利于豇豆出苗整齐一致。苗期鉴定中，需要在豇豆两片真叶平展时，取出幼苗接种枯萎病菌孢子悬浮液，要求豇豆苗的根系发育良好。
[0040]3、由于将豇豆幼苗先统一在育苗基质中培养至二叶一心再进行侵染，豇豆幼苗的长势、大小易于控制，保证了鉴定结果的一致性和可靠性。
[0041]4、由于采取了合适的侵染时间、调整了枯萎病菌孢子悬浮液的浓度，因此侵染效果较好，接菌均匀，发病迅速。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1:在育苗基质培养的待接菌的豇豆幼苗。
[0043]图2:接菌后在PDA培养基中豇豆枯萎病菌菌落的显微结构图。
[0044]图3:侵染处理后15d，之豇28和桂星101长豆角的抗病性鉴定结果图。图3中的A图为未接菌只接种清水的对照(图3的A图的上图品种为桂星101长豆角，图3的A图的下图品种为之豇28)，图3中的B为接菌处理(图3的B图的上图品种为桂星101长豆角，图3的B图的下图品种为之豇28)。
【具体实施方式】
[0045]实施例1
[0046]豇豆抗枯萎病苗期接种鉴定方法步骤如下:
[0047]A、豇豆种子消毒催芽:
[0048]选择不同类型豇豆材料作为鉴定对象(豇豆的分类为常用方法)，本实施例的接菌的试验品种包括之豇28、宁豇三号、台湾七号豆角王、桂星101长豆角、雪龙888白玉豇豆、油白长豆角810、美国无架豆、紫秋豇(上述用于接菌品种为现有的常见栽培品种，作为抗病性鉴定试验，品种不限于此)；
[0049]挑选豇豆材料的籽粒饱满的种子，用纱布包好，在55°C恒温水浴锅中温汤浸种2小时，进行种子消毒，再将种子放在铺有吸水纸的培养皿中，最后33°C恒温处理，直至种子萌发露白。
[0050]B、播种与幼苗培育:
[0051]将萌发的种子播种于装有育苗基质的白色盒子中，进行培养，得到二叶一心的幼苗(见图1);
[0052]育苗培养基质及制备方法为:蛭石和干河沙按重量比1:10混匀，再加入福尔马林溶液消毒或将上述基质在阳光下高温焖晒消毒，得到育苗基质；
[0053]播种:将育苗白塑料盒(尺寸为650*450*165mm，不限于此)用质量浓度为1%高锰酸钾溶液消毒；再在塑料盒内装入约1cm厚的育苗基质，浇透水；再用小耙子耙出约2cm厚的小沟将萌发的种子放在沟内，再抚平育苗基质，盖住萌发种子；
[0054]培养是在大棚中常规管理育苗，将播种后的种子培养至二叶一心(见图1)，即为待接菌材料。
[0055]C、豇豆枯萎病菌孢子悬浮液的制备:
[0056]a.按照报道的柯赫氏法则进行分离鉴定，选择豇豆枯萎病田间典型病株，在发病植株茎基部病健交界处切取2mmX 2mm组织(本发明有时称之为病组织，二者为同一组织)，冲洗干净；
[0057]b.对上述病组织(或称组织、病健部组织)进行消毒处理:用70%酒精消毒
0.5min,再用0.1 %的升萊溶液消毒0.5_lmin,然后用无菌水冲洗3次,每次lmin,得到消毒处理后的病组织；
[0058]c.将消毒处理后的病组织接入PDA平板上，置25°C恒温条件下培养；
[0059]PDA平板培养基及制备方法为:去皮马铃薯200g，切成厚约2mm的片，加入100mL水煮沸30min，用4层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖20g和琼脂20g，加热溶解后再补足水份至100mL ;自然pH(即不调整培养基的pH，为本领域的常用方法之一)，于121°C高压蒸汽下灭菌30min ;之后在超净工作台上倒平板，得到PDA平板培养基；
[0060]d.当接种后的PDA平板培养基的表面即植物病组织周围长出菌落后，将该菌落进行镜检(结果见图2)，由图2所示:在图2中:A为分离后菌落，B为小型分生孢子，C为大型分生孢子，D为厚垣孢子。将镜检确认后的菌落转入PDA斜面培养基中保存，4°C冰箱内存备用；
[0061]e.从转入菌落的PDA斜面培养基中取豇豆枯萎病菌，转入PDA平板培养基中，25°C恒温培养7天，得到培养好的豇豆枯萎病菌；
[0062]f.将培养好的豇豆枯萎病菌，每皿加1mL灭菌水，用灭菌的盖玻片刮取表面菌丝层，三层纱布过滤得到分生孢子滤液，用血球计数板调整孢子浓度，得到枯萎病菌孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度为3-7 X 16个/mL，优选为5 X 16个/mL。
[0063]D、病原菌侵染处理:
[0064]a.将二叶一心的幼苗从培养育苗的基质中取出，轻轻提起幼苗并抖动再进行清洗处理，即用蒸馏水洗去二叶一心幼苗的根部的育苗基质，无需再伤根，得到自然伤根后的幼苗；
[0065]b.将自然伤根后的幼苗放置到豇豆枯萎病菌孢子悬浮液中，浸泡lOmin，然后移植到装好消毒过基质的营养钵中，置于塑料大棚中培养，温度控制在28±2°C，相对湿度控制在85%或以上，按正常的栽培管理，得到侵染苗。
[0066]E、发病调查:
[0067]分别于侵染处理后的10天、15天、20天、25天，调查所述侵染苗的发病状况，根据豇豆枯萎病病情分级标准确定0、1、3、5、7、9共6个发病等级，再根据该发病等级计算病情指数，最后根据该病情指数判断所述豇豆品种的豇豆枯萎病抗性分级。
[0068]豇豆枯萎病病情分级标准按表I。
[0069]病情指数(DI)计算方式为:
[0070]病情指数=Σ (级数X株数)/(最高级数X总株数)X 100。式中Σ为和。
[0071]公式说明:
[0072]级数:发病等级，0-9级；
[0073]株数:相同发病等级对应的株数；
[0074]最闻级数:最闻分级级别；
[0075]总株数:进行病情调查的所有豇豆植株数。
[0076]豇豆枯萎病抗性分级标准如下:
[0077]按病情指数(DI)分别划分为，高抗(HR):0 < DI彡15 ;抗(R): 15 < DI彡35冲等(M):35 < DI ^ 55 ;感⑶:55 < DI ^ 75 ;高感(HS):DI > 75。
[0078]结果见表2:侵染处理后10d，除桂星101长豆角外，其他试材出现轻微的黄叶；侵染处理后15d，各材料均不同程度的感病；侵染处理后25d，病情指数同侵染后20d相似，不同品种抗病性呈现明显不同。
[0079]表2不同豇豆品种的枯萎病抗性鉴定
[0080]
【权利要求】
1.一种豇豆抗枯萎病的苗期鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤: A、浸种催芽:以常用栽培豇豆品种为鉴定对象，挑选籽粒饱满的豇豆品种种子，用纱布包好，在55°C恒温水浴锅中温汤浸种2小时进行种子消毒，再将种子放在铺有吸水纸的培养皿中，最后用33°C恒温处理，直至得到萌发种子； B、播种与幼苗培育:将萌发的种子播种于育苗基质上进行培养，得到二叶一心的幼苗； C、豇豆枯萎病菌孢子悬浮液的制备: a.选择豇豆枯萎病田间典型病株，在发病植株茎基部病健交界处切取2mmX2mm组织，用无菌水冲洗干净； b.对上述组织用70%酒精消毒处理0.5min，再用0.1 %的升汞溶液消毒0.5_lmin，然后用无菌水冲洗3次，每次lmin，得到消毒处理后的病组织； c.将消毒处理后的病组织接入PDA平板上，置25°C恒温条件下培养； d.当接种后的PDA平板培养基的表面即植物病组织周围长出菌落后，将该菌落转入PDA斜面培养基中，筛选得到鉴定豇豆枯萎病的指示菌即豇豆枯萎病菌(Fusariumoxysporum Schl.) JffS-1，送中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO:M2014314 ； e.从转入菌落的PDA斜面培养基中取豇豆枯萎病菌JWS-1，转入PDA平板培养基中，于25°C下恒温培养7天，得到培养好的豇豆枯萎病菌； f.将培养好的豇豆枯萎病菌，每皿加1mL灭菌水，用灭菌的盖玻片刮取表面菌丝层，用三层纱布过滤得到分生孢子滤液，用血球计数板调整孢子浓度，得到豇豆枯萎病菌孢子悬浮液，孢子悬浮液浓度为3-7 X 16个/mL，优选为5 X 16个/mL。 D、病原菌侵染处理: a.用铲子将二叶一心的豇豆幼苗从育苗培养基质中取出，轻轻抖动，进行清洗处理，无需人为伤根，得到自然伤根幼苗； b.将自然伤根后的豇豆幼苗进行枯萎病菌的侵染处理； E、发病调查: 分别于侵染处理后的10d、15d、20d、25d，调查侵染苗的发病状况，根据豇豆枯萎病病情分级标准确定O、1、3、5、7、9共6个发病等级，再根据该发病等级计算病情指数，最后根据该病情指数判断所述豇豆品种的豇豆枯萎病抗性分级； 其中: 步骤B中育苗基质为蛭石和干河沙，按重量比为1:10混匀，加福尔马林溶液或采用高温焖晒方法消毒。 步骤D的b步骤中的所述的侵染处理，是将自然伤根的豇豆幼苗放到枯萎病菌的孢子悬浮液中浸泡lOmin，取出后定植于装有灭菌培养基质的营养钵中，放置于塑料大棚中培养，控制温度为28±2°C，控制相对湿度为85%或以上。
2.—种分离的适用于St豆枯萎病抗性鉴定的St豆枯萎病菌(Fusarium oxysporumSchl.) JWS-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:M2014314。
3.权利要求2所述的紅豆枯萎病菌(Fusariumoxysporum Schl.) JWS-1在紅豆枯萎病抗性鉴定中的应用。
【文档编号】C12R1/77GK104160846SQ201410334010
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年7月15日 优先权日:2014年7月15日
【发明者】吴仁锋, 杨绍丽 申请人:武汉市蔬菜科学研究所