一种猪瘟病毒c株est敏感细胞系的选育方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪瘟病毒C株EST敏感细胞系的选育方法，包括以下步骤：(1)EST细胞单克隆化：无外源微生物污染的EST细胞，以CSFV?C株感染，37℃5％CO2条件下培养48h后，经0.25％胰蛋白酶消化成分散的单个细胞后进行连续4倍梯度稀释，种于96孔细胞板，37℃5％CO2条件下培养，8小时后观察每孔，排除存在细胞团的培养孔，然后继续培养1周，挑选由单一细胞克隆化生长的细胞孔，将孔中细胞进行亚克隆筛选，连续以此方法亚克隆筛选3次后获得亚克隆细胞系。本发明简化传统细胞苗生产过程中的单次接毒程序，为猪瘟细胞苗的生产缩短周期和降低成本。
【专利说明】一种猪瘟病毒C株EST敏感细胞系的选育方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一种猪瘟病毒c株EST敏感细胞系的选育方 法。
【背景技术】
[0002] 猪癌（Classical swine fever，CSF)是一种由猪癌病毒（Classical swine fever virus，CSFV)引起的高致病性的接触性传染病，死亡率高达90%以上。该病以出血热、呼吸 消化道症状和神经系统紊乱为主要临床表现，被世界动物卫生组织（0ΙΕ)列为必须通报的 动物疫病之一，在我国归为一类动物疫病。目前我国各省市均有猪瘟流行，每年因猪瘟死亡 的猪约占病死猪的1/3以上，因此，至今猪瘟仍是危害我国养猪业发展的重大疫病之一。
[0003] 目前对猪瘟的预防主要采用疫苗免疫，由我国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗在预防猪 瘟方面具有很好的应用价值，一些欧美国家借助该疫苗已经成功将本地区的猪瘟扑灭。但 用于免疫预防的弱毒疫苗大多数是在活体动物上制得的，而不同动物个体对CSFV的反应 差别较大，造成疫苗不同批次之间甚至同一批次内含有活病毒的量不一致，直接影响疫苗 的质量。近几年细胞培养苗得到快速发展，使猪瘟疫苗的生产成本显著降低，细胞作为繁殖 病毒的载体可减少隐形感染的机会或通过预先检查克服隐形感染；无动物个体具有的免疫 力，利于病毒生长；可大量生产，还可较久地持续培养；成本低，来源方便，便于储存，且效 力均匀，易标准化等。因此，选择CSFV弱毒株以高滴度水平生长的细胞作为疫苗生产的载 体，将有效降低CSFV弱毒苗的缺点，提高疫苗的安全性和免疫效力。但目前用于生产CSFV 疫苗的细胞，其病毒滴度较低，导致最终产品中含有活病毒的量不高，再加上运输环节的影 响，免疫动物时实际供给活病毒的量已经不足以刺激机体产生坚实的免疫保护。因此，筛选 猪瘟病毒C株敏感细胞系，并在此基础上使其持续感染高滴度猪瘟病毒，这一细胞系的建 立将在猪瘟细胞苗的生产及应用方面具有现实意义和经济价值。
[0004] 现有技术中通过有限稀释法，将带有CSFV C株的EST细胞进行克隆及亚克隆，进 而通过基因扩增、荧光染色等方法，对获得的几株克隆细胞进行选育及鉴定，最终获得可高 滴度持续感染猪瘟病毒的EST细胞系（增强型猪睾丸细胞系）。存在以下缺陷：常规EST细 胞系不含有猪瘟病毒C株，每次生产需要接种猪瘟病毒C株；常规EST细胞系生产的猪瘟病 毒滴度低，疫苗效果差。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种猪瘟病毒C株EST敏感 细胞系的选育方法，该方法通过EST细胞单克隆化筛选对猪瘟病毒敏感的克隆细胞株，以 克服现今细胞培养CSFV病毒滴度较低导致疫苗终产品中活病毒量不高的问题。同时，简化 传统细胞苗生产过程中的单次接毒程序，为猪瘟细胞苗的生产缩短周期和降低成本。其具 体技术方案为：
[0006] 一种猪瘟病毒C株EST敏感细胞系的选育方法，包括以下步骤：
[0007] (l)EST细胞单克隆化
[0008] 无外源微生物污染的EST细胞，以CSFV C株感染，37°C 5% C02条件下培养48h 后，经0.25%胰蛋白酶消化成分散的单个细胞后进行连续4倍梯度稀释，种于96孔细胞板， 37°C 5% C02条件下培养，8小时后观察每孔，排除存在细胞团的培养孔，然后继续培养1周， 挑选由单一细胞克隆化生长的细胞孔，将孔中细胞进行亚克隆筛选，连续以此方法亚克隆 筛选3次后获得亚克隆细胞系；
[0009] (2)可高滴度繁殖猪瘟病毒C株细胞系的选育及鉴定
[0010] 将上述EST细胞各克隆细胞系分别接种于24孔细胞培养板内，37°C 5% C02条件 下培养48h，弃去培养液，用PBS (磷酸缓冲液）洗细胞2次，经0. 25 %胰蛋白酶消化后收集 细胞，利用RNAiso Plus (TAKARA)试剂提取总RNA (核糖核酸），经RT-PCR(反转录聚合酶链 式反应）后初步鉴定出持续感染有猪瘟病毒C株的细胞系；
[0011] RT-PCR鉴定CSFV C株的特异性引物：
[0012] Forward primer (上游引物）：TAACACGACTGTCAAGGTGC ;
[0013] Reverse primer (下游引物）：AACCATGAGCAATGCCACT ;
[0014] 将初步鉴定持续带毒的EST细胞系于35mm的培养皿内，待细胞长满单层后，利用 间接免疫荧光检测确定阳性细胞数，免疫荧光检测显示，几乎100%的细胞均带有CSFV抗 原；
[0015] 将确定以高滴度猪瘟病毒C株持续感染的EST细胞系进行传代培养，分别在3,9， 15代进行反复三次冻融收毒；病毒原液离心去除细胞碎片后，以DMEM (改良Eagle培养基） 液按10倍梯度稀释，将病毒稀释液接毒于铺满96孔板的PK15细胞，37°C，5% C02培养箱 培养48h后，用间接免疫荧光方法检测病毒感染细胞；按照Reed-Muench方法计算病毒半数 致死量TCID 5(I，以3次重复实验结果的算术平均值为培养病毒的感染滴度；TCID5(I测定结果 显示，细胞连续传代15代以上，其病毒低度维持在10 5_ 5TCID5(l/mL，比单次接种EST母细胞后 的病毒滴度高100倍。
[0016] 优选地，步骤（2)中所述利用间接免疫荧光检测确定阳性细胞数，具体步骤如 下：用PBS洗细胞2次，经4%多聚甲醛固定20min，用PBS洗细胞2次后加入透膜剂1% Tritonx-100透膜20min;用PBS洗细胞3次后，加入1 : 300稀释的兔抗CSFV血清，用 含5%新生牛血清PBS稀释，37°C湿盒孵育1小时后用PBS洗去未结合的一抗，180r/min， 5min/次，共3次，接着加入1 : 400稀释的羊抗兔IgG-FITC，稀释方法同一抗，37°C湿盒孵 育1小时；然后用PBS洗去未结合的二抗，180r/min，5min/次，共3次，加入含30%甘油PBS 溶液，置于荧光显微镜下观察绿色荧光情况。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0018] 1.本发明筛选的EST敏感细胞系长期含有猪瘟病毒C株，生产疫苗时只需传代培 养；
[0019] 2.本发明筛选的EST敏感细胞系的猪瘟病毒C株滴度高；
[0020] 3.本发明通过建立可高滴度持续感染猪瘟病毒的EST细胞系，有利于克服当前 CSFV细胞培养滴度较低的情况，同时减化细胞秒生产过程中的病毒单次感染过程，对于降 低猪瘟疫苗生产成本具有现实意义。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0022] -种猪瘟病毒C株EST敏感细胞系的选育方法，包括以下步骤：
[0023] (l)EST细胞单克隆化
[0024] 无外源微生物污染的EST细胞，以CSFV C株感染，37°C 5% C02条件下培养48h 后，经0.25%胰蛋白酶消化成分散的单个细胞后进行连续4倍梯度稀释，种于96孔细胞板， 37°C 5% C02条件下培养，8小时后观察每孔，排除存在细胞团的培养孔，然后继续培养1周， 挑选由单一细胞克隆化生长的细胞孔，将孔中细胞进行亚克隆筛选，连续以此方法亚克隆 筛选3次后获得亚克隆细胞系；
[0025] (2)可高滴度繁殖猪瘟病毒C株细胞系的选育及鉴定
[0026] 将上述EST细胞各克隆细胞系分别接种于24孔细胞培养板内，37°C 5% C02条件下 培养48h，弃去培养液，用PBS洗细胞2次，经0. 25%胰蛋白酶消化后收集细胞，利用RNAiso Plus (TAKARA)试剂提取总RNA，经RT-PCR后初步鉴定出持续感染有猪瘟病毒C株的细胞 系；
[0027] RT-PCR鉴定CSFV C株的特异性引物：
[0028] 上游引物：TAACACGACTGTCAAGGTGC ;
[0029] 下游引物：AACCATGAGCAATGCCACT ;
[0030] 将初步鉴定持续带毒的EST细胞系于35mm的培养皿内，待细胞长满单层后，利用 间接免疫荧光检测确定阳性细胞数，免疫荧光检测显示，几乎100%的细胞均带有CSFV抗 原；
[0031] 将确定以高滴度猪瘟病毒C株持续感染的EST细胞系进行传代培养，分别在3,9， 15代进行反复三次冻融收毒；病毒原液离心去除细胞碎片后，以DMEM液按10倍梯度稀释， 将病毒稀释液接毒于铺满96孔板的PK15细胞，37°C，5% C02培养箱培养48h后，用间接免 疫荧光方法检测病毒感染细胞；按照Reed-Muench方法计算病毒半数致死量TCID50,以3 次重复实验结果的算术平均值为培养病毒的感染滴度；TCID50测定结果显示，细胞连续传 代15代以上，其病毒低度维持在10 5_ 5TCID5(l/mL，比单次接种EST母细胞后的病毒滴度高100 倍。
[0032] 步骤（2)中所述利用间接免疫荧光检测确定阳性细胞数，具体步骤如下：用PBS洗 细胞2次，经4%多聚甲醛固定20min，用PBS洗细胞2次后加入透膜剂1 % Tritonx-100透 膜20min;用PBS洗细胞3次后，加入1 : 300稀释的兔抗CSFV血清，用含5%新生牛血清 PBS稀释，37°C湿盒孵育1小时后用PBS洗去未结合的一抗，180r/min，5min/次，共3次，接 着加入1 : 400稀释的羊抗兔IgG-FITC，稀释方法同一抗，37°C湿盒孵育1小时；然后用PBS 洗去未结合的二抗，18〇171^11，51^11/次，共3次，加入含30%甘油？85溶液，置于荧光显微 镜下观察绿色荧光情况。
[0033] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，本发明的保护范围不限于此，任何熟 悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简 单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1. 一种猪瘟病毒C株EST敏感细胞系的选育方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) EST细胞单克隆化 无外源微生物污染的EST细胞，以CSFV C株感染，37°C 5% C02条件下培养48h后， 经0. 25%胰蛋白酶消化成分散的单个细胞后进行连续4倍梯度稀释，种于96孔细胞板， 37°C 5% C02条件下培养，8小时后观察每孔，排除存在细胞团的培养孔，然后继续培养1周， 挑选由单一细胞克隆化生长的细胞孔，将孔中细胞进行亚克隆筛选，连续以此方法亚克隆 筛选3次后获得亚克隆细胞系； (2) 可高滴度繁殖猪瘟病毒C株细胞系的选育及鉴定 将上述EST细胞各克隆细胞系分别接种于24孔细胞培养板内，37°C 5% C02条件下培养 48h，弃去培养液，用PBS洗细胞2次，经0. 25%胰蛋白酶消化后收集细胞，利用RNAisoPlus 试剂提取总RNA，经RT-PCR后初步鉴定出持续感染有猪瘟病毒C株的细胞系； RT-PCR鉴定CSFV C株的特异性引物： 上游引物：TAACACGACTGTCAAGGTGC ; 下游引物：AACCATGAGCAATGCCACT ; 将初步鉴定持续带毒的EST细胞系于35mm的培养皿内，待细胞长满单层后，利用间接 免疫荧光检测确定阳性细胞数，免疫荧光检测显示，几乎100%的细胞均带有CSFV抗原； 将确定以高滴度猪瘟病毒C株持续感染的EST细胞系进行传代培养，分别在3,9,15代 进行反复三次冻融收毒；病毒原液离心去除细胞碎片后，以DMEM液按10倍梯度稀释，将病 毒稀释液接毒于铺满96孔板的PK15细胞，37°C，5% C02培养箱培养48h后，用间接免疫荧 光方法检测病毒感染细胞；按照Reed-Muench方法计算病毒半数致死量TCID50,以3次重 复实验结果的算术平均值为培养病毒的感染滴度；TCID 5(I测定结果显示，细胞连续传代15 代以上，其病毒低度维持在105 5TCID5(l/mL，比单次接种EST母细胞后的病毒滴度高100倍。
2. 根据权利要求1所述的鸡肠炎沙门氏菌感染相关miRNA的检测方法，其特征在于， 步骤（2)中所述利用间接免疫荧光检测确定阳性细胞数，具体步骤如下：用PBS洗细 胞2次，经4%多聚甲醛固定20min，用PBS洗细胞2次后加入透膜剂1% Tritonx-100透 膜20min;用PBS洗细胞3次后，加入1 : 300稀释的兔抗CSFV血清，用含5%新生牛血清 PBS稀释，37°C湿盒孵育1小时后用PBS洗去未结合的一抗，180rpm，5min/次，共3次，接着 加入1 : 400稀释的羊抗兔IgG-FITC，稀释方法同一抗，37°C湿盒孵育1小时；然后用PBS 洗去未结合的二抗，180印111，51^11/次，共3次，加入含30%甘油？85溶液，置于荧光显微镜 下观察绿色荧光情况。
【文档编号】C12R1/93GK104099292SQ201410334023
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】敬晓棋, 孙世琪, 郭慧琛, 魏衍全, 黄光东, 张琼, 陈生叶 申请人:陕西溯源农业发展有限公司