杂色曲菌素适配体以及相关的电化学生物传感器的制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种杂色曲菌素(Ver?A)适配体以及检测Ver?A的适配体电化学生物传感器。本发明所述的杂色曲菌素适配体为含有核心序列AAGCCGCAC的13～21个碱基的单链DNA探针。本发明所述的检测杂色曲菌素适配体的核酸适配体电化学传感器，包括所述的杂色曲菌素适配体。本发明建立了一种电化学适配体生物传感器检测Ver?A的方法，为Ver?A的检测提供了一种新的方法和途径，具有特异性强，简便灵活，分析速度快，检测成本低廉等优点。
【专利说明】【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明属于检测【技术领域】，涉及一种杂色曲菌素 （Ver A)适配体以及检测Ver A 的适配体电化学生物传感器。 杂色曲菌素适配体以及相关的电化学生物传感器 【背景技术】
[0002] 杂色曲菌素 （Ver A, versicolorin A)即1，6, 8-三轻基-2-轻甲基蒽醌，是黄曲 霉毒素 B1及杂色曲霉素（sterigmytocystin，ST)合成代谢过程中的重要前体物，其结构含 有与AFB1和ST相同的毒性基团一双呋喃环。研究表明对粮食在储藏过程中的Ver A进行 监测，有利于对尚未检出或仅低水平检出黄曲霉毒素污染的粮食起到预警的作用。此外，20 世纪80年代，Wong等初步研究了 Ver A的急性毒性和致畸变性，其LD50 (小鼠静脉注射） 为20mg/kg，致突变剂量（ames test)为800ng/皿，因而杂色曲菌素的毒性不容忽视。
[0003] 随着国内外对AFB1、ST的危害性重视程度日益加深，很多高灵敏性的分析检测方 法也随之成熟，但对Ver A的污染和检测关注仍然不足。目前主要的分析检测的Ver A方 法包括HPLC (高效液相色谱）和TLC (薄层色谱）。HPLC方法分辨率高、稳定性好、成本较 低，但是样品的预处理过程较繁琐，操作技术水平要求高，对样品的前处理要求苛刻，灵敏 度不够高；而TLC方法操作简单、无需复杂仪器，但其灵敏度不高，可靠性也不强。相比而 言，酶生物传感器具有耗时短，操作简单，特异性强等优点，但由于酶本身的不稳定性，可能 造成假阳性或假阴性结果。适配体电化学生物传感器是基于适配体的特异性作用，采用电 化学的检测手段实现对目标物的定量分析的装置。与蛋白质相比，适配体具有更优越的特 点：亲和力高，特异性强，稳定性好，易于修饰，生产成本低，靶分子范围广等。因此，利用适 配体电化学生物传感器检测目标物，不仅具有耗时短，操作简单、特异性强、灵敏度高、可在 线和易于微型化等优点，还避免了酶本身的影响，因此受到了人们高度重视。目前，利用适 配体电化学生物传感器检测 Ver A尚未见报道。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有Ver A检测技术单一，检测方案复杂，检测时间过长的缺点，本发明 的第一个目的在于提供一种杂色曲菌素适配体，对于杂色曲菌素 （Ver A)具有高灵敏度、高 选择性，可用于制备检测Ver A的核酸适配体电化学传感器。
[0005] 本发明所述的杂色曲菌素适配体为含有核心序列AAGCCGCAC的13?21个碱基的 单链DNA探针，即XnAAGCCGCACYm，其中，X和Y表示任意核酸碱基，η和m表示整数。
[0006] 根据本发明所述的杂色曲菌素适配体的进一步特征，所述适配体的5'端进行氨基 修饰。优选地，所述5 '端氨基修饰基团为-(CH2) 6-NH2-。
[0007] 适配体5'端修饰的目的是为了引入固定端，本领域所熟知，不同的支撑基质直接 固定适配体所采用的修饰方式是不同的，金电极多采用巯基修饰或生物素修饰，玻碳电极 常采用5'氨基修饰，目前公开文献未见有在金电极上采用5'氨基修饰的方式进行适配体 固定。本发明所述的适配体是采用5'端氨基的修饰方式，经实验表明，既可用于玻碳电极， 也可用于目前公开文献未有报道的金电极。而且，本发明进一步确定了采用-(〇12)6-册1 2-的 氨基基团修饰的最佳方案。
[0008] 本发明的第二个目的在于提供一种检测杂色曲菌素适配体的核酸适配体电化学 传感器，能实现对Ver A的高灵敏度、高选择性的快速检测。
[0009] 本发明所述的检测杂色曲菌素适配体的核酸适配体电化学传感器，包括根据本发 明所述的杂色曲菌素适配体。
[〇〇1〇] 本发明进一步提供了所述的核酸适配体电化学传感器的制备方法。
[〇〇11] 本发明所述的核酸适配体电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤：
[0012] i)金电极预处理：将金电极用氧化铝粉末水溶液打磨抛光处理后，用超纯水及 无水乙醇超声清洗，去除电极表面的氧化铝粉末，将清洗好的金电极浸入新鲜配制的热的 Piranha溶液（浓硫酸：30% H202 = 7:3, V:V)中活化lOmin，即得到活化的金电极；
[0013] ii)电极修饰：将活化后的金电极浸入到lumol · Γ1适配体组装液中（含 lmol · PNaCDdr：下密封组装22h，得到所述的适配体电化学生物传感器。
[0014] 本发明的第三个目的是提供了根据本发明所述的核酸适配体电化学生物传感器 在检测Ver A方面的应用。
[0015] 例如，本发明所述的适配体电化学生物传感器可用于检测真菌毒素等用途。
[0016] 本发明的第四个目的是提供了一种基于本发明所述的适配体传感器检测VerA的 方法。
[0017] 本发明所述的基于本发明所述的适配体传感器检测Ver A的方法，包括以下步 骤：
[0018] i)适配体传感器对Ver A标准品的检测及其标准曲线的绘制：
[0019] 将所述的适配体电化学生物传感器用ddH20冲洗，去除未结合的适配体，将所述适 配体电化学生物传感器作为工作电极，钼丝电极作为对电极，Ag/AgCl (饱和KC1)电极作为 参比电极，在5m mol · Γ1的K3[Fe(CN)6]，含0· lmol · llCl的电解液中进行微分脉冲伏安 分析，记录适配体传感器的DPV图及其峰电流值IP(I。电化学参数：工作电位300mV-700mV， 扫速为20mV/s，振幅为50mV，静息时间为2s ;
[0020] 将所述适配体电化学生物传感器依次置于浓度为：0· 01、0· 05、0· 1、0· 5、1、5、10、 50、100ng/ml的Ver Α标准溶液中，室温下反应15min，反应后用ddH20冲洗去除非特异性 吸附的Ver A。在5m mol ?Γ1的K3[Fe(CN)6]，含0· lmol Ο?α的电解液中进行微分脉冲 伏安（DPV)分析。电化学参数：工作电位300mV-700mV，扫速为20mV/s，振幅为50mV，静息 时间为2s ;
[0021] 记录各个Ver A浓度下对应的DPV图谱及其峰电流值Ιρη (η = 1，2··· 9)，计算各 标准品相对初始的适配体传感器的峰电流变化值Λ Ip。以各Ver Α标准液浓度的对数为横 坐标，以其对应的Λ Ip为纵坐标作图，建立标准曲线；
[0022] ii)实际样品检测：
[0023] 玉米样品处理：取0. lg优质玉米粉，加入含4ml80%的甲醇溶液的EP管中，然后 分别加入不同浓度的Ver A标准品，振荡萃取45min，以5000r/min转速离心15min，上清用 ddH20稀释100倍后用于电化学检测；
[0024] 微分脉冲伏安法检测：根据权利要求5标准曲线绘制检测参数及检测方法，对分 别含0· 03ng/ml，0· 3ng/ml，0· 8ng/ml，50ng/ml的Ver A玉米样品进行DPV分析，通过建立 的标准曲线，计算出对应的Ver A的浓度即为实际玉米样品中Ver A的浓度。
[0025] 本发明所述的适配体电化学生物传感器是以本发明所述的适配体为分子识别元 件来检测Ver A的，其原理是：在Ver A存在的情况下，本发明所述的适配体与Ver A特异 性结合，引起所述适配体空间构象发生变化，进一步影响电解液中铁氰化钾与电极界面的 电子转移速率，即阻抗发生变化。通过建立Ver A浓度的对数与Λ Ip之间的线性关系，就 可以达到检测Ver A的作用。
[0026] 本发明的有益效果是：本发明基于适配体与Ver A的特异性识别作用，采用DPV为 电化学检测技术,建立了一种电化学适配体生物传感器检测Ver A的方法，为Ver A的检测 提供了一种新的方法和途径。
[0027] 与目前的Ver A检测方法相比较，本发明具有如下优点：
[0028] (1)该传感器的制备是基于适配体与Ver A的特异性识别作用所构建的，相比蛋 白质而言，适配体具有亲和力高，特异性强，稳定性好，易于修饰，生产成本低，靶分子范围 广，长时间暴露不易变性，对周围环境要求不高等特点。
[0029] (2)采用金电极为工作电极，利用Au-N键的作用实现了对适配体的一步修饰，大 大简化了适配体的修饰过程。
[0030] (3)适配体电化学传生物感器制备过程试剂用量极少，检测仪器为电化学工作站， 与传统的检测手段相比，该方法具有特异性强，简便灵活，分析速度快，检测成本低廉等优 点。 【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1为Ver A的适配体电化学生物传感器在不同浓度Ver A标准溶液中检测的 DPV图谱。
[0032] 图2为Ver A的适配体电化学生物传感器在不同浓度Ver A标准溶液中检测的信 号变化趋势图。
[0033] 图3为Ver A标准溶液检测得到的标准曲线图。 【具体实施方式】
[0034] 实施例一：Ver A的适配体电化学生物传感器的构建
[0035] (一）试剂与仪器
[0036] 杂色曲菌素（本实验室制备，纯度99. 96%，待检测VA均为含1%。甲醇的水溶 液。），文中所述的Ver A的核酸适配体由上海生物工程有限公司合成。Na2HP04*12H20、 NaH2P04 · 2H20、NaCl、KCl、K4[Fe(CN)6] · 3H20、K3[Fe(CN)6]、30% H202、浓硫酸、无水乙醇、甲 醇均为分析纯，购自广州化学试剂厂。实验用水为超纯水（电阻率：18. 2MQ/cm)。
[0037] Epsilon电化学工作站（美国BAS公司）。实验采用三电极系统：以钼丝电极为对 电极，Ag/AgCl (饱和KC1)电极为参比电极，以金电极（Au,内径Φ = 2mm)或修饰电极为 工作电极。
[0038] Ver A核酸适配体序列为：CCCCAAGCCGCACATAT长度为17个碱基的单链DNA探针， 且 5' 端进行氨基修饰即：-(ch2)6-nh2-ccccaagccgcacatat。
[0039] Ver A核酸适配体组装液的配制：组装液为lu mol · Γ1的5'端修饰了氨基 艮P :-(CH2)6-NH2-CCCCAAGCCGCACATAT 的单链 DNA 适配体溶液，用 lmol · Γ1 的 NaCl 溶液溶 解配制。
[0040] (二）适配体电化学生物传感器的构建
[0041] 1.金电极预处理
[0042] 将待修饰金电极分别用1. 0 μ m、0. 3 μ m、0. 05 μ m的A1203粉末打磨至镜面。超纯 水超声清洗2次（5min/次）。将处理后的电极浸入新鲜配制的Piranha热溶液（浓硫酸： 30% H202 = 7:3, V:V)活化lOmin ;再分别用超纯水和无水乙醇超声清洗2次（5min/次）。
[0043] 2.电极修饰
[0044] 处理后的电极用超纯水冲洗，浸入到lumol · Γ1适配体组装液中，4°C下密封组装 22h，得到所述的适配体电化学生物传感器。
[0045] Ver A核酸适配体序列从5'端到3'端的核酸序列如：（SEQ ID NO. 1)，5'端修饰 了 氨基即-(ch2) 6-nh2-ccccaagccgcacatat。
[0046] 浓度100 μ mol/L的Ver A适配体溶液是5'端修饰了氨基 即-(CH2)6-NH2-CCCCAAGCCGCACATAT 的 DNA 适配体探针溶液。
[0047] 实施例二：适配体传感器对Ver A标准品的检测及其标准曲线的绘制
[0048] 将所述的适配体电化学生物传感器用ddH20冲洗，去除未结合的适配体，将所述适 配体电化学生物传感器作为工作电极，钼丝电极作为对电极，Ag/AgCl (饱和KC1)电极作为 参比电极，在5m mol · Γ1的K3[Fe(CN)6]，含0· lmol · llCl的电解液中进行微分脉冲伏安 分析，记录适配体传感器的DPV图及其峰电流值IP(I。电化学参数：工作电位300mV-700mV， 扫速为20mV/s，振幅为50mV，静息时间为2s。
[0049] 将所述适配体电化学生物传感器依次置于浓度为：0· 01、0· 05、0· 1、0· 5、1、5、10、 50、100ng/ml的Ver Α标准溶液中，室温下反应15min，反应后用ddH20冲洗去除非特异性吸 附的Ver A。在5m mol · Γ1的K3 [Fe (CN) 6]，含0· lmol · llCl的电解液中进行微分脉冲伏 安分析。电化学参数：工作电位300mV-700mV，扫速为20mV/s，振幅为50mV，静息时间为2s。
[0050] 记录各个Ver A浓度下对应的DPV图谱及其峰电流值Ιρη (η = 1，2··· 9)，计算各 标准品相对初始的适配体传感器的峰电流变化值△ Ip。以各VA标准液浓度的对数为横坐 标，以其对应的Λ Ip为纵坐标作图，建立标准曲线。如图1和图2所示，随着Ver A浓度的 增加，响应信号Ip呈现先增后降的趋势。在1.0Xl(T2ng/ml-L0X102ng/ml浓度范围内， Δ Ip随VA浓度的增加而增大，Λ Ip与VA浓度的对数呈现很好的线性关系（R2 = 0. 9864)， Λ Ip (uA) = -4. 741gC (ng/ml)-6. 92 (图 3)，检测限为 0· 01ng/ml (S/N = 3)。
[0051] 实施例三：实际样品检测
[0052] 将本发明所述的适配体传感器用于实际样品测定及检测其回收率，所述的样品可 以是农副产品和粮食作物包括玉米、花生、大米、小麦等，也可以是其它可能含有Ver A的产 品如饲料、饮料、食用植物油等。
[0053] 本实施例中选用玉米样品进行检测。
[0054] 玉米样品处理：取0. lg优质玉米粉，加入含4ml80%的甲醇溶液的EP管中，然后 分别加入不同浓度的、定量的Ver A标准品，振荡萃取45min，以5000r/min转速离心15min， 上清用ddH20稀释100倍后用于电化学检测。
[0055] 微分脉冲伏安法检测：DPV检测参数及检测方法如实施例二所示，对分别含 0· 03ng/ml，0· 3ng/ml，0· 8ng/ml，50ng/ml Ver A 的玉米样品进行 DPV 分析，通过实施例二 建立的标准曲线，计算出对应的Ver A的浓度即为实际玉米样品中Ver A的浓度。测定 结果如表1所示，所测得样品的相对标准偏差在之间2. 34% -14. 55%之间，加标回收率在 81. 4% -104. 3%之间，平均回收率为94. 625%。
[0056] 表1 :玉米样品中Ver A含量的测定结果
[0057]
【权利要求】
1. 一种杂色曲菌素适配体，其特征在于，所述适配体为含有核心序列AAGCCGCAC的 13?21个碱基的单链DNA探针，S卩XnAAGCCGCACYm，其中，X和Y表示任意核酸碱基，η和m 表示整数。
2. 根据权利要求1所述的杂色曲菌素适配体，其特征在于：所述适配体的5'端进行氨 基修饰。
3. 根据权利要求1所述的杂色曲菌素适配体，其特征在于：所述5'端氨基修饰基团 为-(ch2)6-nh 2-。
4. 一种检测杂色曲菌素适配体的核酸适配体电化学传感器，其特征在于，所述的核酸 适配体电化学传感器包括根据权利要求要求1至3之一所述的杂色曲菌素适配体。
5. 根据权利要求4所述的核酸适配体电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以 下步骤： i) 金电极预处理：将金电极用氧化铝粉末水溶液打磨抛光处理后，用超纯水及无水乙 醇超声清洗，去除电极表面的氧化铝粉末，将清洗好的金电极浸入新鲜配制的热的Piranha 溶液（浓硫酸：30% H202 = 7:3, V:V)中活化lOmin，即得到活化的金电极； ii) 电极修饰：将活化后的金电极浸入到lumol · Γ1适配体组装液中（含 lmol · PNaCDdr：下密封组装22h，得到所述的适配体电化学生物传感器。
6. 根据权利要求4所述的核酸适配体电化学生物传感器在检测Ver A方面的应用。
7. -种基于权利要求4所述的适配体传感器检测Ver A的方法，其特征在于，包括以下 步骤： i) 适配体传感器对Ver A标准品的检测及其标准曲线的绘制： 将所述的适配体电化学生物传感器用ddH20冲洗，去除未结合的适配体，将所述适配体 电化学生物传感器作为工作电极，钼丝电极作为对电极，Ag/AgCl (饱和KC1)电极作为参比 电极，在5m mol ?Γ1的K3[Fe(CN)6]，含0· lmol ?Γ1!^的电解液中进行微分脉冲伏安分析， 记录适配体传感器的DPV图及其峰电流值ΙΡ(Ι。电化学参数：工作电位300mV-700mV，扫速 为20mV/s，振幅为50mV，静息时间为2s ; 将所述适配体电化学生物传感器依次置于浓度为：〇. 〇l、〇. 05、0. 1、0. 5、1、5、10、50、 100ng/ml的Ver A标准溶液中，室温下反应15min，反应后用ddH20冲洗去除非特异性吸附 的Ver A。在5m mol · Γ1的K3 [Fe (CN) 6]，含0· lmol · llCl的电解液中进行微分脉冲伏安 (DPV)分析。电化学参数：工作电位300mV-700mV，扫速为20mV/s，振幅为50mV，静息时间为 2s ； 记录各个Ver A浓度下对应的DPV图谱及其峰电流值Ipn(n = 1，2···9)，计算各标准品 相对初始的适配体传感器的峰电流变化值Λ Ip。以各Ver Α标准液浓度的对数为横坐标， 以其对应的Λ Ip为纵坐标作图，建立标准曲线； ii) 实际样品检测： 玉米样品处理：取0. lg优质玉米粉，加入含4ml80%的甲醇溶液的EP管中，然后分别 加入不同浓度的Ver A标准品，振荡萃取45min，以5000r/min转速离心15min，上清用ddH20 稀释100倍后用于电化学检测； 微分脉冲伏安法检测：根据权利要求5标准曲线绘制检测参数及检测方法，对分别含 0· 03ng/ml，0. 3ng/ml，0. 8ng/ml，50ng/ml的Ver A玉米样品进行DPV分析，通过建立的标准 曲线，计算出对应的Ver A的浓度即为实际玉米样品中Ver A的浓度。
【文档编号】C12N15/115GK104109676SQ201410334093
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】刘大岭, 蒋海兰, 姚冬生, 谢春芳 申请人:暨南大学