一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其应用。该标志物为rs3827760，rs11570112，rs201130283，rs201477597，rs1264429，rs143989805，rs147592698，rs41269281，rs17217280，rs191127702，rs2793086，rs6446315，rs111909699，rs142508708，rs3733782，rs138921247，rs45611935，rs35683659等52个低频SNV的组合。该标志物可用于制备胃癌辅助诊断试剂盒。
【专利说明】一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物及其 应用 发明领域
[0001] 本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外 显性遗传标志物及其应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是危害人类健康重大疾病之一。据世界卫生组织国际癌症研究署（IARC) 最新估计，每年全球新发癌症病例达1200余万，约700万人死于恶性肿瘤。胃癌是全球最 常见的恶性肿瘤之一。据世界卫生组织（WHO)估计，2012年全球范围内大约63万胃癌新 发病例，占全部肿瘤发病的8. 5%，仅次于肺癌、前列腺癌和结直肠癌。在我国，恶性肿瘤是 仅次于心血管疾病的第二大死因，其中胃癌死亡率仅次于肺癌居我国恶性肿瘤第二位，每 年46. 4万人死于胃癌，约占全球胃癌死亡人数的47%。在我国，胃癌年龄标化发病率为 22. 7/10万，仅次于肺癌。尽管在全球范围内胃癌的发病率及死亡率均处于下降趋势，而我 国仍处于较高发病的及死亡水平。随着人口基数的不断增大和胃癌期望寿命的延长，胃癌 患病和死亡人数，将在未来相当长一段时期内给我国带来严重的负担，依旧是肿瘤预防及 控制的重点。
[0003] 恶性肿瘤是一种慢性复杂性疾病，是环境和遗传因素长期共同作用的结果。双生 子研究表明，遗传因素在胃癌等恶性肿瘤的发生中扮演极其重要角色。胃癌的形成是一个 多因素、多阶段、复杂的过程，从慢性萎缩性胃炎、肠化生、不典型增生等癌前病变最终进展 为胃癌。不过目前其确切发病机制还不是很清楚。在环境暴露诱导下，遗传因素将在一 定程度上决定个体对肿瘤的易感程度。幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori)感染已经在 1994年被世界卫生组织（WHO)确认为一级致癌物，是胃癌明确的危险因素之一。然而，相 同的环境危险因素暴露下仅有少数个体最终发展为胃癌，这说明不同个体对环境暴露的反 应存在不同的易感性，这种易感性目前认为是由个体的遗传因素所决定。例如，全球人群的 Helicobacter Pylori 感染率大约在 40%-80%，但其中只有 1 %的 Helicobacter Pylori 感染患者进而发展为胃癌，这说明遗传因素在胃癌的发生发展中起了重要作用。低频高外 显性遗传标志物是指较小等位基因频率（MF)小于0.05的遗传变异。遗传变异的存在被 认为赋予了个体不同的表型性状，以及对环境暴露、药物治疗等因素的不同反应，因此可能 是导致个体对常见疾病发病和预后易感性差异的重要遗传基础。
[0004] 目前，胃癌初步诊断的方法主要包括病史询问、体格检查、实验室检查、胃肠 X线 检查、纤维内窥镜检查、脱落细胞学检查、B超以及CT检查、肿瘤标记物检测等。鉴别诊断 主要依靠 X线钡餐造影、胃镜和活组织病理检查。但是现在临床常用的X线钡餐造影和纤 维内窥镜检查存在一些弊端。X线钡餐造影难以发现，或难以肯定局部粘膜上较小的肿瘤； 检查存在一定的盲区，可能会漏掉一些小的病变；不能确定病变的性质，可能存在假阳性或 假阴性。纤维内窥镜检查对胃壁整体蠕动情况及胃的形态观察欠完整；对肿瘤的浸润深度、 有无转移了解不清；对外压性肿物还是胃壁内肿物难以区别。目前临床所用胃癌标志物的 特异性不强，血清癌胚抗原（CEA)对诊断意义不大，虽半数患者的胃液中CEA有明显升高， 超过l〇〇ng/ml，但也与慢性萎缩性胃炎的胃液中含量有重叠。病理活组织检查作为胃癌诊 断的金标准，在临床胃癌确诊中居于重要地位，但由于需要做胃镜取尾部组织，不适宜作为 临床健康筛查的手段。
[0005] 通过疾病易感的遗传标志物来诊断疾病的发生，灵敏、准确和快速，具有广阔的应 用前景。近年来，疾病遗传标志物已经成为临床和科研工作者的研究热点，在肿瘤和心脑血 管疾病等常见重大疾病的应用价值已初见端倪。
[0006] 然而，目前还没有将低频高外显性遗传标志物应用于胃癌诊断的报道，若能筛选 出胃癌易感的低频高外显性遗传变异作为生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国 胃癌诊断现状将会是个有力的推动，也为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟了新的途 径。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显 性遗传标志物及其应用。
[0008] 本发明的第二个目的是提供上述遗传标志物的特异性引物。
[0009] 本发明的第三个目的是提供上述遗传标志物及其特异性引物在制备胃癌辅助诊 断试剂盒中的应用。
[0010] 本发明第四个目的是提供胃癌辅助诊断试剂盒。
[0011] 发明人通过分离和研究胃癌患者及与其年龄匹配的健康对照外周血DNA中的单 核苷酸多态性，寻找一组与胃癌高度相关的高特异性和敏感性的低频高外显性遗传标志 物，并研制出可便于临床应用的胃癌辅助诊断试剂盒，为胃癌的筛查和诊断提供数据支持， 为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
[0012] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
[0013] 一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物，该标志物为rs3827760， rsll570112, rs201130283, rs201477597, rsl264429, rsl43989805, rsl47592698, rs41269281, rsl7217280, rsl91127702, rs2793086, rs6446315, rslll909699, rsl42508708, rs3733782, rsl38921247, rs45611935, rs35683659, rsl47031025, rs200847762, rs78373056, rs3739757, rs679882, rsl41615048, rsl46021011, rs7769051, rs201854588, rs41302077, rsll571707, rs78738447, rs79153019, rs35511555, rsl90646764,rs76685516,rs61752940,rsl90958876,rs9475487,rs80358282,rs2305985, rs201287330, rsl88551104, rs202172344, rsll564258, rs2242527, rsl052690, rsll7207261, rsl40636259, rs2305710, rs61978639, rs3130257, rs34908836,和 rs56229136 的组合。
[0014] 所述的遗传标志物的特异性扩增引物，该引物为：
[0015] rs3827760 的引物序列为 SEQ ID No:l 和 SEQ ID No:2 ;
[0016] rsll570112 的引物序列为 SEQ ID No:4 和 SEQ ID No:5 ;
[0017] rs201130283 的引物序列为 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8 ;
[0018] rs201477597 的引物序列为 SEQ ID No: 10 和 SEQ ID No: 11 ;
[0019] rsl264429 的引物序列为 SEQ ID No:13 和 SEQ ID No:14 ;
[0020] rsl43989805 的引物序列为 SEQ ID No: 16 和 SEQ ID No: 17 ;
[0021] rs 147592698 的引物序列为 SEQ ID No :19 和 SEQ ID No :20 ;
[0022] rs41269281 的引物序列为 SEQ ID No:22 和 SEQ ID No:23 ;
[0023] rsl7217280 的引物序列为 SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ;
[0024] rsl91127702 的引物序列为 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No:29 ;
[0025] rs2793086 的引物序列为 SEQ ID No:31 和 SEQ ID No:32 ;
[0026] rs6446315 的引物序列为 SEQ ID No:34 和 SEQ ID No:35 ;
[0027] rs 111909699 的引物序列为 SEQ ID No :37 和 SEQ ID No :38 ;
[0028] rsl42508708 的引物序列为 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41 ;
[0029] rs3733782 的引物序列为 SEQ ID No:43 和 SEQ ID No:44 ;
[0030] rsl38921247 的引物序列为 SEQ ID No:46 和 SEQ ID No:47 ;
[0031] rs45611935 的引物序列为 SEQ ID No :49 和 SEQ ID No :50 ;
[0032] rs35683659 的引物序列为 SEQ ID No:52 和 SEQ ID No:53 ;
[0033] rs 147031025 的引物序列为 SEQ ID No :55 和 SEQ ID No :56 ;
[0034] rs200847762 的引物序列为 SEQ ID No:58 和 SEQ ID No:59 ;
[0035] rs78373056 的引物序列为 SEQ ID No:61 和 SEQ ID No:62 ;
[0036] rs3739757 的引物序列为 SEQ ID No:64 和 SEQ ID No:65 ;
[0037] rs679882 的引物序列为 SEQ ID No :67 和 SEQ ID No :68 ;
[0038] rsl41615048 的引物序列为 SEQ ID No:70 和 SEQ ID No:71 ;
[0039] rsl46021011 的引物序列为 SEQ ID No:73 和 SEQ ID No:74 ;
[0040] rs7769051 的引物序列为 SEQ ID No:76 和 SEQ ID No:77 ;
[0041] rs201854588 的引物序列为 SEQ ID No :79 和 SEQ ID No :80 ;
[0042] rs41302077 的引物序列为 SEQ ID No:82 和 SEQ ID No:83 ;
[0043] rsll571707 的引物序列为 SEQ ID No:85 和 SEQ ID No:86 ;
[0044] rs78738447 的引物序列为 SEQ ID No:88 和 SEQ ID No:89 ;
[0045] rs79153019 的引物序列为 SEQ ID No:91 和 SEQ ID No:92 ;
[0046] rs35511555 的引物序列为 SEQ ID No:94 和 SEQ ID No:95 ;
[0047] rs 190646764 的引物序列为 SEQ ID No :97 和 SEQ ID No :98 ;
[0048] rs76685516 的引物序列为 SEQ ID No: 100 和 SEQ ID No: 101 ;
[0049] rs61752940 的引物序列为 SEQ ID No: 103 和 SEQ ID No: 104 ;
[0050] rs 190958876 的引物序列为 SEQ ID No: 106 和 SEQ ID No: 107 ;
[0051] rs9475487 的引物序列为 SEQ ID No:109 和 SEQ ID No:110 ;
[0052] rs80358282 的引物序列为 SEQ ID No:112 和 SEQ ID No:113 ;
[0053] rs2305985 的引物序列为 SEQ ID No:115 和 SEQ ID No:116 ;
[0054] rs201287330 的引物序列为 SEQ ID No:118 和 SEQ ID No:119 ;
[0055] rsl88551104 的引物序列为 SEQ ID No:121 和 SEQ ID No:122 ;
[0056] rs202172344 的引物序列为 SEQ ID No: 124 和 SEQ ID No: 125 ;
[0057] rsll564258 的引物序列为 SEQ ID No:127 和 SEQ ID No:128 ;
[0058] rs2242527 的引物序列为 SEQ ID No: 130 和 SEQ ID No: 131 ;
[0059] rsl052690 的引物序列为 SEQ ID No: 133 和 SEQ ID No: 134 ;
[0060] rsll7207261 的引物序列为 SEQ ID No:136 和 SEQ ID No:137 ;
[0061] rsl40636259 的引物序列为 SEQ ID No:139 和 SEQ ID No:140 ;
[0062] rs2305710 的引物序列为 SEQ ID No: 142 和 SEQ ID No: 143 ;
[0063] rs61978639 的引物序列为 SEQ ID No: 145 和 SEQ ID No: 146 ;
[0064] rs3130257 的引物序列为 SEQ ID No: 148 和 SEQ ID No: 149 ;
[0065] rs34908836 的引物序列为 SEQ ID No: 151 和 SEQ ID No: 152 ;
[0066] rs56229136 的引物序列为SEQIDNo:154和SEQIDNo:155。
[0067] 所述的遗传标志物的特异性延伸引物，该引物为：
[0068] rs3827760 的引物序列为 SEQ ID No:3 ;rsll570112 的引物序列为 SEQ ID No:6 ; rs201130283 的引物序列为 SEQ ID No:9;rs201477597 的引物序列为 SEQ ID No:12; rsl264429 的引物序列为 SEQ ID No:15;rsl43989805 的引物序列为 SEQ ID No:18; rsl47592698 的引物序列为 SEQ ID No:21;rs41269281 的引物序列为 SEQ ID No:24; rsl7217280 的引物序列为 SEQ ID No:27;rsl91127702 的引物序列为 SEQ ID No:30; rs2793086 的引物序列为 SEQ ID No:33 ;rs6446315 的引物序列为 SEQ ID No:36 ; rslll909699 的引物序列为 SEQ ID No:39;rsl42508708 的引物序列为 SEQ ID No:42; rs3733782 的引物序列为 SEQ ID No:45;rsl38921247 的引物序列为 SEQ ID No:48; rs45611935 的引物序列为 SEQ ID No:51;rs35683659 的引物序列为 SEQ ID No:54; rsl47031025 的引物序列为 SEQ ID No:57;rs200847762 的引物序列为 SEQ ID No:60; rs78373056 的引物序列为 SEQ ID No:63;rs3739757 的引物序列为 SEQ ID No:66; rs679882 的引物序列为 SEQ ID No:69;rsl41615048 的引物序列为 SEQ ID No:72; rsl46021011 的引物序列为 SEQ ID No:75;rs7769051 的引物序列为 SEQ ID No:78; rs201854588 的引物序列为 SEQ ID No:81;rs41302077 的引物序列为 SEQ ID No:84; rsll571707 的引物序列为 SEQ ID No:87;rs78738447 的引物序列为 SEQ ID No:90; rs79153019 的引物序列为 SEQ ID No:93;rs35511555 的引物序列为 SEQ ID No:96; rsl90646764 的引物序列为 SEQ ID No:99;rs76685516 的引物序列为 SEQ ID No:102; rs61752940 的引物序列为 SEQ ID No:105;rsl90958876 的引物序列为 SEQ ID No:108; rs9475487 的引物序列为 SEQ ID No:lll;rs80358282 的引物序列为 SEQ ID No:114; rs2305985 的引物序列为 SEQ ID No:117;rs201287330 的引物序列为 SEQ ID No:120; rsl88551104 的引物序列为 SEQ ID No:123;rs202172344 的引物序列为 SEQ ID No:126; rsll564258 的引物序列为 SEQ ID No:129;rs2242527 的引物序列为 SEQ ID No:132; rsl052690 的引物序列为 SEQ ID No:135;rsll7207261 的引物序列为 SEQ ID No:138; rsl40636259 的引物序列为 SEQ ID No:141;rs2305710 的引物序列为 SEQ ID No:144; rs61978639 的引物序列为 SEQ ID No:147;rs3130257 的引物序列为 SEQ ID No:150; rs34908836 的引物序列为 SEQ ID No:153;rs56229136 的引物序列为 SEQ ID No:156。
[0069] 所述的遗传标志物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
[0070] 所述的遗传标志物的特异性扩增引物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
[0071] 所述的遗传标志物的特异性延伸引物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
[0072] -种胃癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中rs3827760， rsll570112, rs201130283, rs201477597, rsl264429, rsl43989805, rsl47592698, rs41269281, rsl7217280, rsl91127702, rs2793086, rs6446315, rslll909699, rsl42508708, rs3733782, rsl38921247, rs45611935, rs35683659, rsl47031025, rs200847762, rs78373056, rs3739757, rs679882,rsl41615048,rsl46021011,rs7769051, rs201854588, rs41302077, rsll571707, rs78738447, rs79153019, rs35511555, rsl90646764,rs76685516,rs61752940,rsl90958876,rs9475487,rs80358282,rs2305985, rs201287330, rsl88551104, rs202172344, rsll564258, rs2242527, rsl052690, rsll7207261, rsl40636259, rs2305710, rs61978639, rs3130257, rs34908836,和 rs56229136〇
[0073] 所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有上述的特异性扩增引物和/或特异性延伸引 物。
[0074] 所述诊断试剂盒，该试剂盒还包括PCR技术常用的试剂，如Taq酶、dNTP混合液、 MgCl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
[0075] 具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：（1)建立统一标准的标本库和数据 库：以标准操作程序（SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床 资料。（2)基因型检测：选择胃癌病例以及与之匹配的对照，利用高密度低频高外显性遗传 标志物芯片，在全外显子组范围内找出与胃癌相关的遗传标志物。（3)对筛选出的阳性关联 遗传标志物，进一步在样本中进行检测，以判断其关联的稳定性。（4)胃癌辅助诊断试剂盒 的研制：根据胃癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的遗传标志物开发辅助诊 断试剂盒。
[0076] 本发明人以标准操作程序（SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口 学资料、临床资料等，并米用了 Illuminalnnnium?Human Exome BeadChip(Illumina Inc·， San Diego, CA)芯片进行全外显子组扫描，Sequeom MassARRAY基因分型进行单个位点的检 测等。
[0077] 具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
[0078] 1.研究样本的选择
[0079] (1)经病理学明确诊断的胃癌病例；
[0080] (2)与病例匹配的对照；
[0081] 本研究共选用4090例符合标准的样本进行研究。
[0082] 2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20_50ng/ μ 1DNA，纯度（紫外 2600D 与 2800D 比值）在 1. 6-2. 0。
[0083] 3. Illumina InHniumw Human Exome BeadChip (Illumina Inc. , San Diego, CA) 芯片检测
[0084] (1)取受试者全基因组DNA样本；
[0085] (2) ￠: Illumina InIlnium00 Human Exome BeadChip (Illumina Inc. , San Diego, CA)芯片上进行全外显子组扫描；
[0086] (3)检测并比较各基因型在胃癌病例与健康对照中的分别差异。
[0087] 4.单个遗传标志物的Sequeom MassARRAY基因分型
[0088] (1)取受试者DNA样本；
[0089] (2)设计单个遗传标志物的特异性引物；
[0090] (3)进行 PCR 反应；
[0091] (4)检测并比较胃癌病例与健康对照中不同基因型的分布差异。
[0092] 5.诊断试剂盒制备方法
[0093] Illumina InIlniumui' Human Exome BeadChip (Illumina Inc. , San Diego, CA)芯 片进行全外显子组扫描和单个遗传标志物检测后确定胃癌病例与健康对照中基因型分布 频率有显著差异的遗传标志物，作为胃癌诊断的指标。最后筛选出的与胃癌发病有关的 遗传标志物组成辅助诊断试剂盒（rs3827760, rsll570112, rs201130283, rs201477597， rsl264429, rsl43989805, rsl47592698, rs41269281, rsl7217280, rsl91127702, rs2793086,rs6446315,rslll909699,rsl42508708,rs3733782,rsl38921247,rs45611935, rs35683659,rsl47031025,rs200847762,rs78373056,rs3739757,rs679882,rsl41615048, rsl46021011, rs7769051, rs201854588, rs41302077, rsll571707, rs78738447, rs79153019, rs35511555, rsl90646764, rs76685516, rs61752940, rsl90958876, rs9475487, rs80358282, rs2305985, rs201287330, rsl88551104, rs202172344, rsll564258, rs2242527,rsl052690,rsll7207261, rsl40636259, rs2305710, rs61978639, rs3130257, rs34908836,和rs56229136)。诊断试剂可以包括这些遗传标志物的特异性引 物对，以及Taq酶、dNTP等试剂。
[0094] 6.统计分析方法
[0095] 运用X 2检验（用于分类变量）或者student t检验（用于连续性变量）比较人 口学特征等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关 联分析。
[0096] 为了进一步研究这52个低频高外显性遗传标志物构成的综合指征用于早期诊 断的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑每个遗传标志物与胃癌发病的正、负关联 情况和联系强度。具体来说，我们对每个遗传标志物的三种基因型进行评分，野生纯合 型="0"，杂合型="1"，变异纯合型="2"，以单个SNP分析时的additive模型下的回 归系数为权重，综合考虑每个遗传标志物的情况给每个研究对象确定一个危险分值。危 险分值的计算方法如下：危险分值=(〇. 450Xrs3827760的评分）+ (0. 797Xrsll570112 的评分）+ (1. 001Xrs201130283 的评分）+ (1. 456Xrs201477597 的评 分）+ (0· 476Xrsl264429 的评分）+ (0· 935Xrsl43989805 的评分）+ (0· 742Xrsl47592698 的评分）+ (1. 286 Xrs41269281 的评分）+ (0.663Xrsl7217280 的评 分）+ (1. 473Xrsl91127702 的评分）+ (0· 551Xrs2793086 的评分）+ (1. 836Xrs6446315 的评分）+ (_〇· 782Xrsl 11909699 的评分）+ (0.757Xrsl42508708 的评 分）+ (-0· 634Xrs3733782 的评分）+ (0· 542Xrsl38921247 的评分）+ (0· 459Xrs45611935 的评分）+ (0.504Xrs35683659 的评分）+ (2. 569Xrsl47031025 的评 分）+ (-0· 826Xrs200847762 的评分）+ (1. 379Xrs78373056 的评分）+ (2. 163Xrs3739757 的评分）+ (0.454Xrs679882 的评分）+ (0.926Xrsl41615048 的评 分）+ (1. 070Xrsl46021011 的评分）+ (0· 369Xrs7769051 的评分）+ (1. 250Xrs201854588 的评分）+ (〇.448 Xrs41302077 的评分）+ (1. 144Xrsll571707 的评 分）+ (-0· 418Xrs78738447 的评分）+ (0· 864Xrs79153019 的评分）+ (1. 259Xrs35511555 的评分）+ (1. 749Xrsl90646764 的评分）+ (0.363Xrs76685516 的评 分）+ (I. 012 X rs61752940 的评分）+ (0· 923 X rs 190958876 的评分）+ (0· 450 X rs9475487 的 评分）+ (1. 709 Xrs80358282 的评分）+ (0· 541 Xrs2305985 的评分）+ (1. 275 Xrs201287330 的评分）+ (1. 272Xrsl88551104 的评分）+ (1. 156Xrs202172344 的评 分）+ (0· 416Xrsl 1564258 的评分）+ (0· 694Xrs2242527 的评分）+ (-0· 606Xrsl052690 的评分）+ (-1. 261Xrsll7207261 的评分）+ (-0· 764Xrsl40636259 的评 分）+ (0· 373Xrs2305710 的评分）+ (· 486Xrs61978639 的评分）+ (1. 169Xrs3130257 的评 分）+ (0. 856 Xrs34908836的评分）+ (0. 523 X rs56229136的评分），获得的危险分值系数以 及界限值被直接应用于全基因组关联研究的4090例样本中。（以rs3827760为例：0. 450 为rs3827760的回归系数（见表I) ;rs3827760的评分，野生纯合型="0"，杂合型="1"， 变异纯合型="2"，某个SNP的基因型由仪器检测结果确定；某个样本的总评分是这些个 SNP分别评分的总和，单个SNP的基因型只是计算评分的一个中间过程，不需要知道具体基 因型。）
[0097] 统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成（PLINK1. 07)。统计学显著性水平 P值设为〇. 05,所有统计学检验均为双侧检验。
[0098] 以下是本发明进一步的说明：
[0099] 在上述1140例符合条件的胃癌病例及2950例健康对照中，两组年龄、性别均衡可 t匕。我们将这两组人群经 Illumina Inrinium?:Human Exome BeadChip (Illumina Inc.，San Diego, CA)芯片进行全外显子组扫描获得相关结果。
[0100] 根据 Illumina Infinium? Human Exome BeadChip (IIlumina Inc. , San Diego, CA)芯片检测，本发明人检测到在"胃癌病例"组和"健康对照"组中基因型分布频率 存在差异的遗传标志物包括：rs3827760, rsll570112, rs201130283, rs201477597， rsl264429, rsl43989805, rsl47592698, rs41269281, rsl7217280, rsl91127702, rs2793086,rs6446315,rslll909699,rsl42508708,rs3733782,rsl38921247,rs45611935, rs35683659,rsl47031025,rs200847762,rs78373056,rs3739757,rs679882,rsl41615048, rsl46021011, rs7769051, rs201854588, rs41302077, rsll571707, rs78738447, rs79153019, rs35511555, rsl90646764, rs76685516, rs61752940, rsl90958876, rs9475487, rs80358282, rs2305985, rs201287330, rsl88551104, rs202172344, rsll564258, rs2242527,rsl052690,rsll7207261, rsl40636259, rs2305710, rs61978639, rs3130257, rs34908836,和 rs56229136。
[0101] 单因素和多因素 Logistic回归分析结果均表明，这52个遗传标志物与胃癌的发 病存在着显著关联。
[0102] 进一步分析这52个遗传标志物的组合用于胃癌诊断的效果，发现其组合能够很 好的区分病例与对照。
[0103] 根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于胃癌辅助诊断的试剂盒，包含测 定受试者血标本DNA中上述遗传标志物的特异性引物和其他检测试剂。
[0104] 具体而言，这52个遗传标志物的组合，或者这52个遗传标志物的特异性引物构成 的相关诊断试剂盒有助于胃癌的辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病 情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
[0105] 本发明有益效果：
[0106] 本发明提供的遗传标志物作为胃癌辅助判断的标志物的优越性在于：
[0107] (1)低频高外显性遗传标志物是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志 物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功 开发将为胃癌的诊断和治疗开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
[0108] (2)遗传标志物试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于胃癌的辅助诊断， 有助于更好地反映患者的疾病状态，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个 性化的防治方案提供支持。
[0109] (3)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用全外显子组芯片扫描以获取 疾病相关的低频高外显性遗传标志物，并应用Sequeom MassARRAY基因分型方法在大样本 中进行了验证；以上方法和策略的应用加速和保证了低频高外显性遗传生物标志物和诊断 试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
[0110] 本发明通过控制年龄、性别、吸烟、饮酒等对疾病发展的影响因素，研究遗传标志 物在胃癌辅助诊断的应用前景，阐述遗传标志物对于胃癌进展的影响，揭示其诊断价值。因 此，本发明获得了胃癌发病相关遗传标志物；通过遗传标志物和诊断试剂盒的研制和应用， 可使得胃癌的诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评 价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
【专利附图】
【附图说明】
[0111] 图1 :显示全外显子组关联研究病例组和对照组的ROC曲线。
[0112] 显示胃癌病例组对健康对照组为参照的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0113] 以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
[0114] 实施例1样品的收集和样品资料的整理
[0115] 发明人于2004年开始至2010年从南京医科大学肿瘤中心收集了大量的胃癌患者 血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了 4090例符合下列标准的样本作为全基 因组芯片扫描和单个遗传标志物Sequeom MassARRAY基因分型的实验样品：
[0116] 1、病理学明确诊断的胃癌患者；
[0117] 2、与之匹配的健康对照；
[0118] 并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
[0119] 实施例2外周血DNA全外显子组扫描
[0120] 在上述符合条件的1140例胃癌患者和2950例健康对照中，将这两组人群经 Illumina Infinium? Human Exome BeadChip (IIlumina Inc. , San Diego, CA)芯片检测获 得相关结果。具体步骤为：
[0121] 1、向储存于2ml冻存管中的外周血加入溶血试剂（即裂解液，40份量配置方法如 下：蔗糖219. 72g、氯化镁2. 02g和曲拉通X-100 (amresco 0694) 20ml混合后，用TrisHcl溶 液定容至2000ml，下同），颠倒混勻后完全转入。
[0122] 2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混勻，4000rpm离心10分 钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混勻清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃 上清。
[0123] 3、抽提DNA :向沉淀中加 Iml抽提液（每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠， 14. 4ml 0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10%十二烧基硫酸钠，148. Iml双蒸水，下同）和8μ1蛋 白酶Κ，充分震荡混匀，37°C水浴过夜。
[0124] 4、去除蛋白质：加 Iml饱和酚充分混勻（手轻摇15分钟），4000rpm离心10分钟， 取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液（氯仿：异戊 醇=24 :1，v/v，下同），充分混勻后（手摇15分钟），4000rpm离心10分钟，取上清（分入 两个I. 5ml的离心管）。
[0125] 5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60 μ 1，再加入与上清液等体积的冰无 水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心lOmin。
[0126] 6、DNA洗漆：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml，12000rpm离心IOmin,弃上清后真空抽 干或置于清洁干燥环境中蒸干。
[0127] 7、测量浓度：通常能得到20-50ng/ μ I DNA，纯度（紫外2600D与2800D比值）在 1. 6~2, 0〇
[0128] 8、进行全夕卜显子组扫描：在 Illumina Infinium? Human Exome BeadChip(Illumina Inc.，San Diego，CA)芯片上进行全外显子组扫描。
[0129] 9、数据分析与处理：在"胃癌病例"组和"健康对照"组中发现的基因型分布频率 有显著差异的低频高外显性遗传标志物在上文中已经罗列出，结果见表1。
[0130] 表1.病例组与对照组全外显子组关联分析结果
[0131]
[0132]
【权利要求】
1. 一种与胃癌辅助诊断相关的低频高外显性遗传标志物，其特征在于该标志物 为 rs3827760, rsll570112, rs201130283, rs201477597, rsl264429, rsl43989805， rsl47592698, rs41269281, rsl7217280, rsl91127702, rs2793086, rs6446315, rslll909699, rsl42508708, rs3733782, rsl38921247, rs45611935, rs35683659, rsl47031025, rs200847762, rs78373056, rs3739757, rs679882, rsl41615048, rsl46021011, rs7769051, rs201854588, rs41302077, rsll571707, rs78738447, rs79153019, rs35511555, rsl90646764, rs76685516, rs61752940, rsl90958876, rs9475487, rs80358282, rs2305985, rs201287330, rsl88551104, rs202172344, rsll564258, rs2242527, rsl052690,rsll7207261, rsl40636259, rs2305710, rs61978639, rs3130257, rs34908836,和 rs56229136 的组合。
2. 权利要求1所述的遗传标志物的特异性扩增引物，其特征在于该引物为： rs3827760 的引物序列为 SEQ ID No:l 和 SEQ ID No:2 ; rsll570112 的引物序列为 SEQ ID No:4 和 SEQ ID No:5 ; rs201130283 的引物序列为 SEQ ID No:7 和 SEQ ID No:8; rs201477597 的引物序列为 SEQ ID No:10 和 SEQ ID No:11 ; rsl264429 的引物序列为SEQIDNo:13和SEQIDNo:14; rsl43989805 的引物序列为SEQIDNo:16和SEQIDNo:17; rsl47592698 的引物序列为SEQIDNo:19和SEQIDNo:20; rs41269281 的引物序列为 SEQ ID No:22 和 SEQ ID No:23 ; rsl7217280 的引物序列为 SEQ ID No:25 和 SEQ ID No:26 ; rsl91127702 的引物序列为 SEQ ID No:28 和 SEQ ID No:29; rs2793086 的引物序列为 SEQ ID No:31 和 SEQ ID No:32 ; rs6446315 的引物序列为 SEQ ID No:34 和 SEQ ID No:35; rs 111909699 的引物序列为 SEQ ID No :37 和 SEQ ID No :38 ; rsl42508708 的引物序列为 SEQ ID No:40 和 SEQ ID No:41 ; rs3733782 的引物序列为 SEQ ID No:43 和 SEQ ID No:44 ; rsl38921247 的引物序列为 SEQ ID No:46 和 SEQ ID No:47 ; rs45611935 的引物序列为 SEQ ID No :49 和 SEQ ID No :50 ; rs35683659 的引物序列为 SEQ ID No:52 和 SEQ ID No:53 ; rs 147031025 的引物序列为 SEQ ID No :55 和 SEQ ID No :56 ; rs200847762 的引物序列为 SEQ ID No:58 和 SEQ ID No:59 ; rs78373056 的引物序列为 SEQ ID No:61 和 SEQ ID No:62 ; rs3739757 的引物序列为 SEQ ID No:64 和 SEQ ID No:65 ; rs679882 的引物序列为 SEQ ID No :67 和 SEQ ID No :68 ; rsl41615048 的引物序列为 SEQ ID No:70 和 SEQ ID No:71 ; rsl46021011 的引物序列为 SEQ ID No:73 和 SEQ ID No:74; rs7769051 的引物序列为 SEQ ID No:76 和 SEQ ID No:77 ; rs201854588 的引物序列为 SEQ ID No :79 和 SEQ ID No :80 ; rs41302077 的引物序列为 SEQ ID No:82 和 SEQ ID No:83 ; rsll571707 的引物序列为 SEQ ID No:85 和 SEQ ID No:86; rs78738447 的引物序列为 SEQ ID No:88 和 SEQ ID No:89 ; rs79153019 的引物序列为 SEQ ID No:91 和 SEQ ID No:92 ; rs35511555 的引物序列为 SEQ ID No:94 和 SEQ ID No:95; rsl90646764 的引物序列为 SEQ ID No:97 和 SEQ ID No:98 ; rs76685516 的引物序列为 SEQ ID No:100 和 SEQ ID No: 101; rs61752940 的引物序列为SEQIDNo:103和SEQIDNo:104; rsl90958876 的引物序列为SEQIDNo:106和SEQIDNo:107; rs9475487 的引物序列为 SEQ ID No: 109 和 SEQ ID No: 110; rs80358282 的引物序列为SEQIDNo:112和SEQIDNo:113; rs2305985 的引物序列为 SEQ ID No: 115 和 SEQ ID No: 116; rs201287330 的引物序列为SEQIDNo:118和SEQIDNo:119; rsl88551104 的引物序列为SEQIDNo:121和SEQIDNo:122; rs202172344 的引物序列为SEQIDNo:124和SEQIDNo:125; rsll564258 的引物序列为SEQIDNo:127和SEQIDNo:128; rs2242527 的引物序列为 SEQ ID No: 130 和 SEQ ID No: 131 ; rsl052690 的引物序列为 SEQ ID No: 133 和 SEQ ID No: 134; rsll7207261 的引物序列为SEQIDNo:136和SEQIDNo:137; rsl40636259 的引物序列为SEQIDNo:139和SEQIDNo:140; rs2305710 的引物序列为 SEQ ID No: 142 和 SEQ ID No: 143; rs61978639 的引物序列为SEQIDNo:145和SEQIDNo:146; rs3130257 的引物序列为 SEQ ID No: 148 和 SEQ ID No: 149; rs34908836 的引物序列为 SEQ ID No: 151 和 SEQ ID No: 152 ; rs56229136 的引物序列为SEQIDNo:154和SEQIDNo:155。
3.权利要求1所述的遗传标志物的特异性延伸引物，其特征在于该引物为： rs3827760 的引物序列为 SEQ ID No:3;rsll570112 的引物序列为 SEQ ID No:6; rs201130283 的引物序列为 SEQ ID No:9;rs201477597 的引物序列为 SEQ ID No:12; rsl264429 的引物序列为 SEQ ID No:15;rsl43989805 的引物序列为 SEQ ID No:18; rsl47592698 的引物序列为 SEQ ID No:21;rs41269281 的引物序列为 SEQ ID No:24; rsl7217280 的引物序列为 SEQ ID No:27;rsl91127702 的引物序列为 SEQ ID No:30; rs2793086 的引物序列为 SEQ ID No:33 ;rs6446315 的引物序列为 SEQ ID No:36 ; rslll909699 的引物序列为 SEQ ID No:39;rsl42508708 的引物序列为 SEQ ID No:42; rs3733782 的引物序列为 SEQ ID No:45;rsl38921247 的引物序列为 SEQ ID No:48; rs45611935 的引物序列为 SEQ ID No:51;rs35683659 的引物序列为 SEQ ID No:54; rsl47031025 的引物序列为 SEQ ID No:57;rs200847762 的引物序列为 SEQ ID No:60; rs78373056 的引物序列为 SEQ ID No:63 ;rs3739757 的引物序列为 SEQ ID No:66 ; rs679882 的引物序列为 SEQ ID No:69;rsl41615048 的引物序列为 SEQ ID No:72; rsl46021011 的引物序列为 SEQ ID No:75;rs7769051 的引物序列为 SEQ ID No:78; rs201854588 的引物序列为 SEQ ID No:81;rs41302077 的引物序列为 SEQ ID No:84; rsll571707 的引物序列为SEQIDNo:87;rs78738447 的引物序列为SEQIDNo:90; rs79153019 的引物序列为SEQIDNo:93;rs35511555 的引物序列为SEQIDNo:96; rsl90646764 的引物序列为SEQIDNo:99;rs76685516 的引物序列为SEQIDNo:102; rs61752940 的引物序列为 SEQ ID No:105;rsl90958876 的引物序列为 SEQ ID No:108; rs9475487 的引物序列为SEQIDNo:lll;rs80358282 的引物序列为SEQIDNo:114; rs2305985 的引物序列为 SEQ ID No:117;rs201287330 的引物序列为 SEQ ID No:120; rsl88551104 的引物序列为 SEQ ID No:123;rs202172344 的引物序列为 SEQ ID No:126; rsll564258 的引物序列为 SEQ ID No:129;rs2242527 的引物序列为 SEQ ID No:132; rsl052690 的引物序列为 SEQ ID No:135;rsll7207261 的引物序列为 SEQ ID No:138; rsl40636259 的引物序列为 SEQ ID No:141;rs2305710 的引物序列为 SEQ ID No:144; rs61978639 的引物序列为 SEQ ID No:147;rs3130257 的引物序列为 SEQ ID No:150; rs34908836 的引物序列为 SEQ ID No:153;rs56229136 的引物序列为 SEQ ID No:156。
4. 权利要求1所述的遗传标志物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的应用。
5. 权利要求2所述的遗传标志物的特异性扩增引物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的 应用。
6. 权利要求3所述的遗传标志物的特异性延伸引物在制备胃癌辅助诊断试剂盒中的 应用。
7. -种胃癌辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒用于检测外周血DNA中rs3827760， rsll570112, rs201130283, rs201477597, rsl264429, rsl43989805, rsl47592698, rs41269281, rsl7217280, rsl91127702, rs2793086, rs6446315, rslll909699, rsl42508708, rs3733782, rsl38921247, rs45611935, rs35683659, rsl47031025, rs200847762, rs78373056, rs3739757, rs679882, rsl41615048, rsl46021011, rs7769051, rs201854588, rs41302077, rsll571707, rs78738447, rs79153019, rs35511555, rsl90646764,rs76685516,rs61752940,rsl90958876,rs9475487,rs80358282,rs2305985, rs201287330, rsl88551104, rs202172344, rsll564258, rs2242527, rsl052690, rsll7207261， rsl40636259, rs2305710, rs61978639, rs3130257, rs34908836 和 rs56229136〇
8. 根据权利要求7所述的诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述的特 异性扩增引物和/或权利要求3所述的特异性延伸引物。
9. 根据权利要求7或8所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PCR技术常用的 试剂。
【文档编号】C12Q1/68GK104263823SQ201410469997
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】沈洪兵, 靳光付, 马红霞, 胡志斌, 戴俊程, 朱迅 申请人:南京医科大学