一种分子标记在检测奶牛产奶性状中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种分子标记在检测奶牛产奶性状中的应用。本发明公开一种引物，由SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的DNA分子组成。本发明公开的分子标记可以应用于检测奶牛的产奶性状，在奶牛的分子育种中具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种分子标记在检测奶牛产奶性状中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种分子标记在检测奶牛产奶性状中的应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase，FASN)是一种多功能蛋白，负责哺乳动物中 乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A从头合成一种长链软脂酸（16:0) (Lock&Garnsworthy，2003)，因 此，FASN作为影响不同代谢过程或脂肪性状的候选基因而被研究。FASN的多态在许多研究 中显不出与奶牛和肉牛的脂肪性状相关（Morris et al. 2007 ;Schennink et al. 2009 ;Li et al. 2011 ;Matsuhashi et al. 2011 ;Maharani et al. 2012 ;0h et al. 2012)。牛的FASN 基因位于19号染色体上，在一些已知的影响牛肉脂肪酸成分，脂肪和乳脂以及相关性状的 QTLs 区间内（ http://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/BT/index)。
[0003] 由于FASN基因位于与乳脂相关的QTL区间内，并且是脂肪酸合成的一种关 键酶。先前不同的奶牛群体研究发现，FASN与乳脂性状（Roy et al.2006;Schennink et al· 2009)和乳脂肪酸组成（Morris et al· 2007 ;Schennink et al· 2009 ;Stoop et al. 2009)显著相关，因此，它是奶牛产奶性状的重要候选基因，有望发掘分子标记应用于奶 牛的分子育种中。
[0004] 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)是目前 SNP 批量检测的 一种国际通用的平台，效率和准确性均较高。SNPs质谱分析方法的原理是：首先通过PCR 反应扩增出含有待检SNP位点的目的片段，然后用SAP酶去除PCR体系中剩余的脱氧核糖 核苷三磷酸（dNTP)和引物，然后加入单碱基延伸引物，其3'末端碱基紧挨SNP位点，且与 目的片段上的碱基完全互补，采用四种ddNTP替代dNTP，这样，探针在SNP位点处仅延伸一 个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解吸电离飞行时间 质谱（MALDI-T0F MS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基。质 谱分析方法特点是应用MALDI-T0F质谱仪基于根据不同的分子量可以将等位基因排序，如 果SNP位点为纯合子，那么质谱仪将会捕捉到2个不同的波谱峰，如果为杂合子，质谱仪将 会捕捉到四个不同的波谱峰。不同的波谱峰形状代表电荷标记的不同质量。MALDI-T0F-MS 完成的SNP检测的准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短、性价比高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种分子标记在检测奶牛产奶性状中的应用。
[0006] 本发明提供一种引物，由SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示的DNA 分子组成。
[0007] -种检测或辅助检测牛产奶性状高低的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂 盒包含上述引物。
[0008] 上述试剂盒中，所述产奶性状为产奶量、乳脂量、乳脂率和/或乳蛋白量；
[0009] 所述牛为奶牛。
[0010] 一种检测或辅助检测牛产奶性状高低的方法也属于本发明的保护范围，包括如下 步骤：检测待测牛FASN基因序列自5'末端起第18663位的碱基，将在FASN基因自5'末端 起第18663位的碱基均为T的个体，记作纯合TT个体，将在FASN基因自5'末端起第18663 位的碱基均为C的个体，记作纯合CC个体，将在FASN基因自5'末端起第18663位的碱基 为T和C的个体，记作杂合CT个体；在产奶量或乳脂量或乳蛋白量的性状上，纯合TT个体 大于杂合CT个体，杂合CT个体大于纯合CC个体；杂合CT个体的乳脂率大于纯合CC个体， 纯合CC个体的乳脂率大于纯合TT个体；
[0011] 所述FASN基因的序列为GenBank登录号为AF285607的序列，该序列的更新日为 2003年11月24日。
[0012] 上述方法中，所述纯合TT个体、纯合CC个体或杂合CT个体的检测方法如下：
[0013] 以待测牛的基因组DNA为模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的DNA分子 为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，记作分子标记1，进一步以SEQ ID No. 5所示的 DNA分子为单碱基延伸引物，采用MALDI-T0F-MS检测分子标记1中的SNP位点；将分子标 记1自5'末端起第36位的碱基均为T的个体，记作纯合TT个体；将分子标记1自5'末端 起第36位的碱基均为C的个体，记作纯合CC个体；将分子标记1自5'末端起第36位的碱 基为T和C的个体，记作杂合CT个体；
[0014] 所述牛为奶牛。
[0015] 上述引物或上述任一所述的试剂盒在制备检测或辅助检测牛产奶性状高低的产 品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0016] 上述应用中，所述产奶性状为产奶量、乳脂量、乳脂率和/或乳蛋白量。
[0017] 上述引物或上述任一所述的试剂盒在牛育种中的应用也属于本发明的保护范围。
[0018] 上述任一所述的应用中，所述牛为奶牛。
[0019] 本发明提供的分子标记可以应用于检测奶牛的产奶性状，在奶牛的分子育种中具 有广阔的应用前景，并且该分子标记的检测具有如下优点：简便、快速、灵敏，结果可靠、稳 定、准确，适合实验室大群体规模检测的需要。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为MALDI-T0F-MS验证群体个体SNP位点分型实验流程。
【具体实施方式】
[0021] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0022] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0023] 中国荷斯坦公牛管制冻精样品由北京三元绿荷奶牛养殖中心提供。
[0024] 女儿群体血样由北京市畜牧兽医总站提供。
[0025] 实施例1、基因多态性检测
[0026] 一、以北京地区14头中国荷斯坦公牛作为基因多态性检测的试验群体，提取各公 牛管制冻精样品的基因组DNA(方法见名称为"一种公牛冻精基因组DNA的提取方法"，专利 号为ZL201110251216. 1的发明专利）。用紫外分光光度计准确测定各冻精样品的基因组 DNA浓度，并均将其用ddH20稀释成50ng/ μ 1，再将各样品等量混合成池DNA。
[0027] 二、根据牛FASN基因序列（GenBank登录号为AF285607,更新日为2003年11月 24日），利用primer3.0(http://primer3. wi.mit.edu/)软件进行引物设计，共设计30对 引物，覆盖了 FASN基因82. 83%的全长序列，发现多态性位点的引物序列如表1所示，用双 蒸水将其稀释到浓度为lOpmol/μ 1。
[0028] 表1 FASN基因PCR扩增引物序列信息
[0029]
【权利要求】
1. 一种引物，由SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示的DNA分子组成。
2. -种检测或辅助检测牛产奶性状高低的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所述的引 物。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述产奶性状为产奶量、乳脂量、乳月旨 率和/或乳蛋白量。
4. 一种检测或辅助检测牛产奶性状高低的方法，包括如下步骤：检测待测牛FASN基因 序列自5'末端起第18663位的碱基，将在FASN基因自5'末端起第18663位的碱基均为T 的个体，记作纯合TT个体，将在FASN基因自5'末端起第18663位的碱基均为C的个体，记 作纯合CC个体，将在FASN基因自5'末端起第18663位的碱基为T和C的个体，记作杂合 CT个体；在产奶量或乳脂量或乳蛋白量的性状上，纯合TT个体大于杂合CT个体，杂合CT个 体大于纯合CC个体；杂合CT个体的乳脂率大于纯合CC个体，纯合CC个体的乳脂率大于纯 合TT个体； 所述FASN基因的序列为GenBank登录号为AF285607的序列，该序列的更新日为2003 年11月24日。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述纯合TT个体、纯合CC个体或杂合CT 个体的检测方法如下： 以待测牛的基因组DNA为模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的DNA分子为引 物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，记作分子标记1，进一步以SEQ ID No. 5所示的DNA 分子为单碱基延伸引物，采用MALDI-TOF-MS检测分子标记1中的SNP位点；将分子标记1 自5'末端起第36位的碱基均为T的个体，记作纯合TT个体；将分子标记1自5'末端起第 36位的碱基均为C的个体，记作纯合CC个体；将分子标记1自5'末端起第36位的碱基为 T和C的个体，记作杂合CT个体。
6. 权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂盒在制备检测或辅助检测牛产 奶性状高低的产品中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述产奶性状为产奶量、乳脂量、乳脂率 和/或乳蛋白量。
8. 权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂盒在牛育种中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104232632SQ201410471772
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】孙东晓, 阿里姆, 范翌鹏, 谢岩, 王鹏, 张胜利, 张毅 申请人:中国农业大学