复合菌剂的保护剂及用于处理工业废水的微生物制剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种复合菌剂的保护剂，包括0.05％-0.3％w/v的吐温-20、0.1％-0.5％w/v的黄原胶、1％-5％w/v的甘油和余量的水。本发明还提供了一种包含上述保护剂的用于处理工业废水的微生物制剂。本发明将吐温-20、黄原胶和甘油组成复合菌剂的保护剂，有效延长了复合菌剂的常温保藏时间，同时具有良好的保藏效果；本发明的保护剂成本低廉，适合大规模生产；本发明的微生物制剂有效降低了水体COD，具有良好的处理效果。
【专利说明】复合菌剂的保护剂及用于处理工业废水的微生物制剂
【技术领域】
[0001] 本发明涉及废水处理【技术领域】，具体涉及一种复合菌剂的保护剂及一种用于处理 工业废水的微生物制剂。
【背景技术】
[0002] 处理化工废水所用的复合菌剂主要是由对某种特定的污染物具有较高去除效果 的细菌、真菌、酵母菌、藻类等微生物所组成，所用微生物一般是从自然界中筛选的优势菌 种或通过基因工程产生的高效菌种，投入系统后能够提高系统的处理能力。同时，利用微 生物的作用去除废水中有机污染物的生物处理技术同物理、化学法相比，具有成本低、效率 高、无二次污染等优点，故近年来菌剂使用量增大趋势明显。然而，目前市场上的液体菌剂 产品普遍存在活菌含量低，活菌保藏期短等问题，采用干燥等方式保藏，虽然可以延长保藏 周期，但存在保藏成本费用高、技术设备使用复杂等问题。保护剂的作用是保护细胞膜和蛋 白质结构与功能的完整性，对保藏环境中的PH值、渗透压、温度变化等起缓冲作用，吸收有 害的代谢产物，稳定菌体的生存环境，一般分为小分子类型（如低聚糖类、醇类、缓冲盐类、 氨基酸和维生素类）和大分子类型（如蛋白质、多肽类和多糖类），故根据微生物的生理生 化与代谢途径等特征，有针对性的研发适宜延长菌剂保藏时间的保护剂，以此保护剂添加 入菌剂，所形成的产品易于运输、方便应用，同时具备易于保藏、能够保持菌剂活性等优势。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提出一种复合菌剂的保护剂及一种 用于处理工业废水的微生物制剂，解决现有技术中复合菌剂保藏时间较短以及复合菌剂常 温保藏效果差的技术问题。
[0004] 本发明提供了一种复合菌剂的保护剂，该复合菌剂的保护剂包括0. 05% -0. 3% w/v的吐温-20、0. 1 % -〇. 5% w/v的黄原胶、1 % -5% w/v的甘油和余量的水。
[0005] 优选地，所述保护剂还包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和硫酸镁。
[0006] 优选地，所述保护剂包括0. 1% w/v的吐温-20、0. 2% w/v的黄原胶、3% w/v的甘 油。
[0007] 优选地，所述保护剂包括0. 4% w/v的磷酸氢二钠、0. 08% w/v的磷酸二氢钾和 0. 02% w/v的硫酸镁。
[0008] 本发明还提供了一种用于处理工业废水的微生物制剂，该微生物制剂包括：
[0009] 复合菌剂，包括假单胞菌、不动杆菌、鲍特氏菌、克雷伯氏菌、巨大芽孢杆菌和枯草 芽孢杆菌；
[0010] 上述的保护剂。
[0011] 优选地，所述复合菌剂的制备方法如下：
[0012] (1)将假单胞菌、不动杆菌、鲍特氏菌、克雷伯氏菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌 分别进行放大培养30°c下120rpm/min摇床中培养24?28h，使各菌种的菌液有效活菌浓 度大于108CFU/mL，按个数比1: 1: 1: 1: 1:1将上述各种菌种的菌液混合，得到混合菌液；
[0013] (2)按3%接种比例将所述混合菌液进行进一步的扩培，30°C下在120rpm/min摇 床中培养28?32h，得到扩培混合菌液，当所述扩培混合菌液中有效活菌浓度大于IO 9CFU/ mL时停止培养；
[0014] (3)将步骤（2)获得的菌液在15°C、5000r/min的条件下离心30min，收集泥状菌 体沉淀。
[0015] 优选地，所述微生物制剂通过所述泥状菌体沉淀与所述保护剂均匀混合得到。
[0016] 优选地，所述步骤（2)中扩培混合菌液的体积与所述保护剂的体积比为1:1。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明将吐温-20、黄原胶和甘油组成 复合菌剂的保护剂，有效延长了复合菌剂的常温保藏时间，同时具有良好的保藏效果；本发 明的保护剂成本低廉，适合大规模生产；本发明的微生物制剂有效降低了水体COD，具有 良好的处理效果。
【具体实施方式】
[0018] 下面具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0019] 除非另有定义，本发明使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相 同含义。关于本领域的定义及术语，w/v表示质量体积比，例如：5% w/v表示5g溶质溶解 在IOOmL水中，如果用g/L表示，例如，5g溶质溶解在IOOmL水中，就是50g/L，也就是说5% w/v与50g/L是等量的。术语"扩培"表示细菌或真菌的扩大培养，菌种扩大培养简称菌种 扩培是发酵工程的一个组成部分，其实指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生 产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数 量和质量的菌种过程。
[0020] 尽管本发明的广义范围所示的数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自 测量中存在的标准偏差所致。另外，本发明公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何 和所有子范围。例如记载的"1至10"的范围应理解为包含最小值1和最大值10之间（包 含端点）的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至 6. 1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5. 5至10。另外，任何称为"并入本文"的 参考文献应理解为以其整体并入。
[0021] 另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非 清楚且明确的限于一个所指对象。术语"或"可与术语"和/或"互换使用，除非上下文另 有清楚指明。
[0022] 本发明将吐温-20、黄原胶和甘油进行组合，形成复合菌剂的保护剂，其中，吐 温-20 (Tween-20 ；Polyoxyethy-lene(20)Sorbaitan Monolaurate ;Sorbimac_rogol Laurate300)又称为聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯，为山梨醇及其一失水、双失水化合物 与月桂酸酯按每摩尔山梨醇及其脱水化合物与约20摩尔的环氧乙烷在碱性条件下缩合而 制得，一般用作乳化剂、分散剂、增溶剂、稳定剂等；黄原胶是由β _1，4连接的D葡萄糖单 元的纤维素主链组成的，其在交替的葡萄糖残基上由三糖侧链取代。所述三糖侧链由被葡 萄糖醛酸分隔的两个甘露糖单元构成，大约一半的末端甘露糖单元连接至丙酮酸基团且 非末端残基通常携带乙酰基，侧链上的羧基使得胶分子为阴离子性的，黄原胶具有的分子 量为大约2X IO6道尔顿，相比于大多数多糖，其具有窄的分子量分布，对黄原胶纤维进行的 X-射线衍射研宄鉴别出了右旋的五折螺旋构象，在这种构象中，侧链与主链排列一致并稳 定总体的构象，在溶液中，侧链缠绕纤维素样的主链从而保护它；甘油即为丙三醇。
[0023] 其中，本发明的保护剂采用水剂的形式，各个组分的质量体积比优选如下： 0· 05% -〇· 3% w/v的吐温_20、0· 1% -〇· 5% w/v的黄原胶、1% -5% w/v的甘油和余量的 水。
[0024] 进一步地，本发明的保护剂中还包括如下成分：磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和硫酸 镁。
[0025] 进一步地，保护剂中吐温-20、黄原胶和甘油得最佳配比为：0. 1% w/v的吐温-20、 0. 2% w/v的黄原胶、3% w/v的甘油。
[0026] 进一步地，保护剂中磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和硫酸镁的最佳配比为：0. 4% w/v 的磷酸氢二钠、〇. 08% w/v的磷酸二氢钾和0. 02% w/v的硫酸镁。
[0027] 具体地，本发明将吐温-20、黄原胶和甘油组成复合菌剂的保护剂，有效延长了复 合菌剂的常温保藏时间，同时具有良好的保藏效果。
[0028] 上述液体形态的保护剂可直接添加于液体培养基或菌悬液中使用，下面以处理工 业废水的复合菌剂为例，详细说明保护剂的使用，本发明的用于处理工业废水的微生物制 剂，包括：复合菌剂和上述保护剂，其中，复合菌剂包括假单胞菌、不动杆菌、鲍特氏菌、克雷 伯氏菌、巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。
[0029] 其中，复合菌剂的制备方法如下：
[0030] (1)将假单胞菌、不动杆菌、鲍特氏菌、克雷伯氏菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌 分别进行放大培养30°c下120rpm/min摇床中培养24?28h，使各菌种的菌液有效活菌浓 度大于10 8CFU/mL，按个数比1: 1: 1: 1: 1:1将上述各种菌种的菌液混合，得到混合菌液；
[0031] (2)按3%接种比例将所述混合菌液进行进一步的扩培，30°C下在120rpm/min摇 床中培养28?32h，得到扩培混合菌液，当所述扩培混合菌液中有效活菌浓度大于IO 9CFU/ mL时停止培养；
[0032] (3)将步骤⑵获得的菌液在15°C、5000r/min的条件下离心30min，收集泥状菌 体沉淀。
[0033] 所述微生物制剂通过所述泥状菌体沉淀与所述保护剂以搅拌的方式均匀混合得 到。
[0034] 进一步地，复合菌剂和保护剂的比例关系按照如下方式确定：步骤（2)中扩培混 合菌液的体积与所述保护剂的体积比为1: 1，也就是说，当扩培混合菌液的体积是IOOOmL 时，保护剂的体积也是lOOOmL，加入至步骤（3)所得泥状菌体沉淀中。
[0035] 具体地，上述的微生物制剂有效降低了水体C0D，具有良好的处理效果。
[0036] 实施例1:
[0037] 本发明实施例1提供了一种复合菌剂的保护剂，其制备方法如下：
[0038] 称取吐温_201g，黄原胶2g，甘油30g，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾0. 8g，硫酸镁 0. 2g，混合均勾后，无菌水定容至1000ml。
[0039] 实施例2:
[0040] 本发明实施例2提供了一种复合菌剂的保护剂，其制备方法如下：
[0041 ] 称取吐温-200. 5g，黄原胶3g，甘油40g，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾0. 8g，硫酸镁 0. 2g，混合均勾后，无菌水定容至1000ml。
[0042] 实施例3:
[0043] 本发明实施例3提供了一种复合菌剂的保护剂，其制备方法如下：
[0044] 称取吐温_202g，黄原胶lg，甘油20g，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾0· 8g，硫酸镁 0. 2g，混合均勾后，无菌水定容至1000ml。
[0045] 实施例4:
[0046] 本发明实施例4提供了一种复合菌剂的保护剂，其制备方法如下：
[0047] 称取吐温_203g，黄原胶5g，甘油50g，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾0. 8g，硫酸镁 0. 2g，混合均勾后，无菌水定容至1000ml。
[0048] 实施例5:
[0049] 本发明实施例5提供了一种复合菌剂的保护剂，其制备方法如下：
[0050] 称取吐温_201g，黄原胶4g，甘油10g，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾0. 8g，硫酸镁 0. 2g，混合均勾后，无菌水定容至1000ml。
[0051] 实施例6:
[0052] 本发明实施例6提供了一种复合菌剂的保护剂，其制备方法如下：
[0053] 称取吐温_201g，黄原胶2g，甘油30g，混合均勾后，无菌水定容至1000ml。
[0054] 实施例7:
[0055] 本发明实施例7提供了一种复合菌剂的保护剂，其制备方法如下：
[0056] 称取吐温-200. 5g，黄原胶3g，甘油40g，混合均勾后，无菌水定容至1000ml。
[0057] 实施例8:
[0058] 本发明实施例8提供了一种复合菌剂的保护剂，其制备方法如下：
[0059] 称取吐温_202g，黄原胶lg，甘油20g，混合均勾后，无菌水定容至1000ml。
[0060] 实施例9:
[0061] 本发明实施例9提供了一种复合菌剂的保护剂，其制备方法如下：
[0062] 称取吐温_203g，黄原胶5g，甘油50g，混合均勾后，无菌水定容至1000ml。
[0063] 实施例10:
[0064] 本发明实施例10提供了一种复合菌剂的保护剂，其制备方法如下：
[0065] 称取吐温_201g，黄原胶4g，甘油10g，混合均勾后，无菌水定容至1000ml。
[0066] 实施例11-实施例20:
[0067] 本发明实施例11-20分别提供了一种用于处理工业废水的微生物制剂，分别包括 实施例1-实施例10中的保护剂，另外还包括复合菌剂，其中，复合菌剂包括假单胞菌、不动 杆菌、鲍特氏菌、克雷伯氏菌、巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。
[0068] 其中，复合菌剂的制备方法如下：
[0069] (1)将假单胞菌、不动杆菌、鲍特氏菌、克雷伯氏菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌 分别进行放大培养30°C下120rpm/min摇床中培养24?28h，使各菌种的菌液有效活菌浓 度大于10 8CFU/mL，按个数比1: 1: 1: 1: 1:1将上述各种菌种的菌液混合，得到混合菌液；
[0070] (2)按3%接种比例将所述混合菌液进行进一步的扩培，30°C下在120rpm/min摇 床中培养28?32h，得到扩培混合菌液，当所述扩培混合菌液中有效活菌浓度大于IO 9CFU/ mL时停止培养；
[0071] (3)将步骤⑵获得的菌液在15°C、5000r/min的条件下离心30min，收集泥状菌 体沉淀。
[0072] 最后将与步骤（2)中扩培混合菌液的体积相同的保护剂加入至步骤（3)所得泥状 菌体沉淀中，在本实施例中，步骤（2)中扩培混合菌液以及保护剂的体积均为1000mL。
[0073] 实施例21:
[0074] 本发明实施例21提供上述微生物制剂的应用。
[0075] 保藏效果评估
[0076] 平皿计数法：组别：实施例11-实施例20所述的微生物制剂，以相同有效活菌浓 度的发酵液为对照（CK，即为对比例）。每90d进行一次活菌数检测，检测方法采用菌落计 数法，使用设备：螺旋接种仪；设定运行参数：稀释梯度1〇_ 5,平皿尺寸90_，接种模式为指 数接种模式，接种量50 μ 1。接种后将平皿放入30°C培养箱中培养24h，使用自动菌落计数 设备进行计数，计数结果见表1。
[0077] 废水处理效果测宙
[0078] 废水样：河北省某厂焦化废水。每90d对实施例11-实施例20的微生物制剂和对 比例（CK)进行一次取样，在初始C0D1000mg/L条件下，按体积分数1%接种入生化反应器 中，反应器中同时添加体积分数20%的浓度为3000mg/L的污泥测定停留时间48h后的出水 COD，计算去除率，结果见表2。
[0079] 表1菌落计数结果
[0080]
【权利要求】
1. 一种复合菌剂的保护剂，其特征在于，该复合菌剂的保护剂包括0. 05% -o. 3% w/v 的吐温-20、0. 1% -0. 5% w/v的黄原胶、1% -5% w/v的甘油和余量的水。
2. 根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，所述保护剂还包括磷酸氢二钠、磷酸二 氢钾和硫酸镁。
3. 根据权利要求1或2所述的保护剂，其特征在于，所述保护剂包括0. 1 % w/v的吐 温-20、0. 2% w/v的黄原胶、3% w/v的甘油。
4. 根据权利要求2所述的保护剂，其特征在于，所述保护剂包括0. 4% w/v的磷酸氢二 钠、0. 08% w/v的磷酸二氢钾和0. 02% w/v的硫酸镁。
5. -种用于处理工业废水的微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂包括： 复合菌剂，包括假单胞菌、不动杆菌、鲍特氏菌、克雷伯氏菌、巨大芽孢杆菌和枯草芽孢 杆菌； 权利要求1至4任一项所述的保护剂。
6. 根据权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于，所述复合菌剂的制备方法如下： (1) 将假单胞菌、不动杆菌、鲍特氏菌、克雷伯氏菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分别 进行放大培养30°C下120rpm/min摇床中培养24?28h，使各菌种的菌液有效活菌浓度大 于108CFU/mL，按个数比1:1:1:1:1:1将上述各种菌种的菌液混合，得到混合菌液； (2) 按3%接种比例将所述混合菌液进行进一步的扩培，30<€下在120印111/1]1；[11摇床中 培养28?32h，得到扩培混合菌液，当所述扩培混合菌液中有效活菌浓度大于109CFU/mL时 停止培养； (3) 将步骤（2)获得的菌液在15°C、5000r/min的条件下离心30min，收集泥状菌体沉 淀，并投入保护剂中，通过搅拌形成均匀混合。
7. 根据权利要求6所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂通过所述泥状菌 体沉淀与所述保护剂均匀混合得到。
8. 根据权利要求7所述的微生物制剂，其特征在于，所述步骤（2)中扩培混合菌液的体 积与所述保护剂的体积比为1:1。
【文档编号】C12R1/22GK104480011SQ201410471642
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】朱希坤, 戴速航, 李小明, 杨德玉, 李旭 申请人:中国中化股份有限公司, 沈阳化工研究院有限公司