一种检测小鼠内耳毛细胞的标记分子及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测小鼠内耳毛细胞的标记分子及应用，所述的标记分子为Chrna9和Espnl；本发明筛选出小鼠内耳毛细胞特异性的细胞标记分子可以区分小鼠内耳毛细胞与其他组织来源的细胞，也可为其他物种内耳毛细胞特异性标记分子研究提供参考。
【专利说明】-种检测小鼠内耳毛细胞的标记分子及应用 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种小鼠内耳毛细胞鉴定，特别涉及一种组合式细胞标记分子鉴定小 鼠内耳毛细胞的新型方法，这种方法能特异性地鉴定分离和培养的小鼠内耳毛细胞。 (二）
【背景技术】
[0002] 哺乳动物内耳的前庭和耳蜗中存在内耳干细胞，内耳干细胞具有自我更新和多分 化多潜能性，体外无血清贴壁培养可以形成内耳祖细胞。将内耳祖细胞与灭活的鸡胚椭圆 囊间质细胞共培养，部分祖细胞可以分化成具有功能的成熟毛细胞，具有典型的毛细胞形 态。
[0003] 近年来的研究发现内耳干细胞具有多分化潜能，在特定的分化条件下可以发育成 内耳毛细胞。首先，将内耳干细胞接种在经多聚赖氨酸预先处理好的培养皿中，无血清贴壁 培养7天。RT-PCR和免疫荧光检测表明分化之后的细胞表达内耳发育相关基因和蛋白，形 成内耳祖细胞。然后将内耳祖细胞接种在灭活的鸡胚椭圆囊间质细胞上。7天后，RT-PCR 和免疫荧光检测表明诱导分化后有部分细胞表达毛细胞的特异性基因和蛋白。诱导产生的 毛细胞可以吸收特异性分子染料FM1-43,全细胞膜片钳检测发现其具有功能。内耳毛细胞 是机械刺激的受体，可以将声音刺激转化为电信号。功能敏感性毛细胞的丢失是导致感音 性耳聋的主要原因。因此，毛细胞在治疗感音性耳聋方面具有重要的应用价值。
[0004] 具有大量的纯度较高的细胞是分子和细胞生物学研究的基础。内耳毛细胞在内耳 中数目较少；体外培养条件复杂；缺少特异性的表面蛋白，导致分离高纯度的毛细胞难度 很大。因此，到目前为止，对毛细胞进行的相关研究还非常少。虽然目前有研究发现了一些 不同物种内耳毛细胞表达的基因，但这些基因尚缺乏较强的组织特异性，例如成鼠分离的 内耳毛细胞表达的Myosin VIIA，Espin以及Brn3c，在其他的组织中也有不同程度的表达。 因此，到目前为止尚缺乏针对内耳毛细胞特异性的细胞标记分子，这对内耳毛细胞的分离 和纯化以及鉴定造成了一定的困难，也是内耳毛细胞应用研究方面存在的一个技术瓶颈。 (三）
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种鉴定小鼠内耳毛细胞的标记分子，并采用这种细胞标记分 子特异性地鉴定小鼠内耳毛细胞的方法。本发明是通过分离得到小鼠内耳耳蜗基底膜上的 干细胞，在体外进行无血清悬浮培养获得克隆的小鼠内耳干细胞。将内耳干细胞无血清贴 壁培养7天，诱导分化形成内耳祖细胞。再将内耳祖细胞接种在灭活的鸡胚椭圆囊间质细 胞上共培养，7天后约有30-40%的内耳祖细胞分化成毛细胞。用小分子染料FM1-43特异 性标志毛细胞，再通过流式细胞仪进行分选，得到纯度较高的毛细胞。提取小鼠内耳毛细胞 的核糖核酸（RNA)进行小鼠基因表达谱芯片检测小鼠内耳毛细胞基因表达谱，然后筛选特 异性候选基因。最后从新生小鼠中提取出如大脑、肝脏、皮肤等10个不同组织的RNA，通过 RT-PCR对候选的目的基因进行特异性检测，确定小鼠内耳祖细胞的特异性组合式细胞标记 分子。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种检测小鼠内耳毛细胞的标记分子，所述的标记分子为Chrna9(核 苷酸序列为序列5所示）和Espnl (核苷酸序列为序列6所示）。
[0008] 本发明还提供一种所述的检测小鼠内耳毛细胞的标记分子在检测小鼠内耳毛细 胞中的应用，所述的应用为：从小鼠耳蜗基底膜分离单细胞，提取单细胞总RNA，反转录成 cDNA,以cDNA为模板,分别以Chrna9正向引物和Chrna9反向引物，Espnl正向引物和Espnl 反向引物作为两对引物进行PCR扩增，若Chrna9正向引物和Chrna9反向引物扩增产物 355bp，Espnl正向引物和Espnl反向引物扩增产物759bp，则单细胞为小鼠内耳毛细胞；
[0009] Chrna9 正向引物：5' -AGCTGCGTCTCCAGTCATTC-3' ；
[0010] Chrna9 反向引物：5 ' -TGCTGTCTCTACGGCTTTGA-3 ;
[0011] Espnl 正向引物：5' -GGTGGAGTGGTTACTCCGTG-3' ；
[0012] Espnl 反向引物：5' -GGCATGTGGGCATTTCATCA-3'。
[0013] 本发明所述检测小鼠内耳毛细胞的标记分子按如下步骤筛选：
[0014] (1)内耳干细胞分离和成球培养
[0015] 解剖小鼠获得小鼠耳蜗基底膜后，将基底膜胰酶消化，用移液枪吹打散后，获得单 细胞，然后将单细胞悬浮在内耳干细胞培养基中，在37°C、5% CO2孵育箱中悬浮培养5-6 天，形成内耳干细胞球。
[0016] 本发明分离培养的小鼠内耳干细胞阳性表达Nestin、Abcg2、Pax-2、BMP-4及 BMP-7等基因。
[0017] ⑵内耳干细胞诱导分化为内耳祖细胞
[0018] 用0. lmg/ml的多聚赖氨酸室温孵育培养皿5分钟,完全吸除多聚赖氨酸。用PBS 彻底清洗培养皿3次，每次5分钟。将培养皿放入37°C孵育箱中过夜干燥。将P3代内耳 干细胞接种在经多聚赖氨酸预先处理好的培养皿中，用内耳祖细胞培养基贴壁培养7天之 后，形成内耳祖细胞。
[0019] 本发明分离培养的小鼠内耳祖细胞阳性表达Pax-2、BMP_4及BMP-7等基因。
[0020] (3)内耳祖细胞诱导分化为内耳毛细胞
[0021] 将P3代鸡胚椭圆囊间质细胞接种在用明胶处理好的培养皿上。待基质细胞增长 到整个玻片的90%的时候，用丝裂霉素（Sigmadyg/mL)孵育箱中处理3小时。完全吸 出丝裂霉素，用PBS漂洗处理后的细胞3次，然后作为饲养层细胞用于内耳干细胞的分化。 将内耳祖细胞接种在灭活的鸡胚椭圆囊间质细胞上，用内耳毛细胞培养基诱导分化7天之 后，部分内耳祖细胞诱导分化为内耳毛细胞。
[0022] 小鼠内耳毛细胞阳性表达Mathl、Myosin VIIA、Espin及Brn3c等基因。
[0023] (4)内耳毛细胞的流式分选
[0024] 用DMEM/F12培养基稀释FM1-43 (5 μ M，Sigma)染料，将诱导分化之后的样品放入 染料中染色10秒钟。快速的吸出FM1-43,加入PBS快速清洗三遍，每遍5分钟。使用成分 为50% Accutase(Invitrogen公司）+50%胰酶（0· 05% )的混合消化液对样品进行消化。 消化完成之后加入等体积的大豆来源胰酶抑制剂终止消化，用Iml Eppendorf移液枪将样 品吹打成单细胞悬液。
[0025] 将经FM1-43染色的细胞悬液转移至15mL管中，IOOOrpm离心5分钟。离心完成之 后，完全弃上清，加入ImLPBS重悬细胞。用40 μ m的滤器对细胞悬液进行过滤，除去较大的 细胞团。过滤之后的细胞悬液进行二次离心，IOOOrpm离心5分钟之后完全去除上清。用含 20% FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞，将细胞悬液转移到无菌流式管中，在流式细胞分选 仪中进行毛细胞分选。
[0026] (5)基因表达谱芯片检测基因表达谱与特异性候选基因筛选
[0027] 将分选得到的内耳毛细胞RNA进行Phalanx小鼠基因表达谱检测（检测单位：上 海仪方生物科技有限公司）。经对比内耳干细胞祖细胞以及内耳毛细胞后，对内耳毛细胞差 异表达性基因进行进一步分析，从内耳毛细胞中筛选出31个特异表达的基因。
[0028] (6)特异性组合式细胞标记分子验证
[0029] 根据内耳毛细胞筛选的31种特异表达的基因，结合比较内耳干细胞、祖细胞中特 异表达的基因，候选Chrna9和Espnl共2种基因，对小鼠大脑、肝脏、皮肤、肺、肠、胃、肾脏、 肌肉、心脏及眼睛共10个不同的组织及器官进行RNA提取后，聚合酶链反应（PCR)检测这 2种基因在不同组织细胞内的表达水平，验证出Chrna9和Espnl两种分子组合为小鼠内耳 毛细胞最佳组合式细胞标记分子。
[0030] 本发明提供的Chrna9和Espnl两种细胞标记分子在小鼠内耳毛细胞中是特异性 表达的，通过Phalanx小鼠基因表达谱的检测，表明Chrna9和Espnl两种基因具有显著的 高水平表达。本发明提供的新型组合式细胞标记分子可应用于小鼠内耳毛细胞的鉴定，通 过小鼠不同组织2种候选基因的检测分子，只有在小鼠内耳毛细胞中Chrna9和Espnl这两 种基因都是阳性表达的，因此这两种基因的组合阳性表达可作为小鼠内耳毛细胞的标记分 子，用于小鼠内耳毛细胞的分选和纯化依据及用于小鼠分离或体外培养扩增的内耳毛细胞 分选以及纯化研究。
[0031] 本发明的有益效果是：
[0032] (1)本发明筛选出小鼠内耳毛细胞特异性的组合式细胞标记分子Chrna9和 Espnl0
[0033] (2)以本发明提供的组合式细胞标记分子可以区分小鼠内耳毛细胞与其它组织来 源的细胞。
[0034] (3)使用本发明提供的组合式细胞标记分子阳性表达可鉴定小鼠内耳毛细胞，为 发展新的分离纯化技术提供依据。
[0035] (4)本发明提供的组合式细胞标记分子也可为其他物种内耳毛细胞特异性标记分 子研究提供参考。 (四）【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1小鼠内耳干细胞球显微图，A行为100X放大倍数下，内耳干细胞在培养1、3、 5天的形态，B行为250X放大倍数下，内耳干细胞在培养1、3、5天的形态；C行为用DAPI 对培养1、3、5天的内耳干细胞球染色后，250X放大倍数下显微图。
[0037] 图2小鼠内耳祖细胞显微图。
[0038] 图3鸡胚椭圆囊基质细胞显微图；A为原代鸡胚椭圆囊间质细胞，B为P3代鸡胚椭 圆囊间质细胞，密度为80-90%。
[0039] 图4小鼠内耳毛细胞显微图。
[0040] 图5小鼠内耳毛细胞检测电泳图，泳道1为Marker，泳道2为GAPDH，泳道3为 Myosin7a，泳道 4 为 Espin，泳道 5 为 Brn3c，泳道 6 为 P27kip1。
[0041] 图6小鼠内耳毛细胞标志蛋白Myosin7a、Espin和Brn3c激光共聚焦显微图，A为 毛细胞特异性蛋白Myosin7a抗体标志显微图；B为毛细胞特异性蛋白Espin抗体标志显微 图；C为毛细胞特异性蛋白Brn3c抗体标志显微图。
[0042] 图7为内耳毛细胞流式分选图，（A)为通过门控去除细胞悬液中的死细胞及细胞 碎片；(B)为通过门控去除细胞悬液中的细胞聚集；(C)为通过门控去除细胞悬液中的粘连 体；(D)没有细胞碎片和粘连体的细胞悬液，FM1-43阳性细胞通过门分选收集；(E)通过分 析没有染色的对照组，来说明没有FM1-43荧光的背景图；(F)对分选出来的FM1-43阳性细 胞，进行重新分选。
[0043] 图8候选基因在不同组织中的表达电泳图，泳道1为大脑，泳道2为肝脏，泳道3为 皮肤，泳道4为肺，泳道5为肠，泳道6为胃，泳道7为肾脏，泳道8为肌肉，泳道9为心脏， 泳道10为眼睛，泳道11为内耳毛细胞。
[0044] 图9标志分子Chrna9+Espnl在不同类型细胞中的表达电泳图，泳道1为内耳单细 胞检测Chrna9,泳道2为内耳单细胞检测Espnl ;泳道3为胃组织检测Chrna9,泳道4为胃 组织检测Espnl ;泳道5为肾脏组织检测Chrna9,泳道6为肾脏组织检测Espnl ;泳道7为 肌肉组织检测Chrna9,泳道8为肌肉组织检测Espnl。 (五）【具体实施方式】
[0045] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0046] 实施例1小鼠内耳干细胞的分离及培养
[0047] 1)将ICR小鼠（浙江省医学科学院）在_20°C冰箱中麻醉5分钟，浸入75%酒精 中杀菌。用手术剪将小鼠直接断头，去除皮毛。然后在无菌状态下中分头颅，去除大脑及 脑干，充分暴露位于颅底的颞骨。仔细的用剪刀和镊子分离出颞骨，将其转移到装有4°C预 冷PBS (pH值为7.4)的3. 5cm培养皿中。显微镜下用镊子在耳蜗底部钻一个小孔，从下至 上剖开螺壳，暴露完整的蜗轴和蜗管。用镊子夹住耳蜗管的最底部，将耳蜗管与蜗轴分离。 由此得到的耳蜗管包括螺旋韧带、前庭膜、以及基底膜（包含Corti器）。将分离得到的耳 蜗管转移到新鲜预冷的PBS中，进一步将包含Corti器的基底膜与前庭膜及螺旋韧带分离 开。将基底膜转移到IOOuL 0.05% (w/v)的胰酶（购自Gbico)中，37°C消化7分钟，加入 100μ llmg/ml的大豆胰酶抑制剂（PBS缓冲液配制，购自Gbico，pH = 7. 4)终止胰酶反应。
[0048] 2)用量程为200 μ L的移液枪吹打步骤1)反应物30-40次，使单细胞从基底膜中 脱落。细胞脱落后经70 μ m的细胞筛过滤，去除较大的组织残骸与碎片，得到几乎没有大细 胞聚集的单细胞悬液。然后用内耳干细胞培养基稀释，细胞密度为l〇 5/ml，获得稀释后的 单细胞悬液。内耳干细胞培养基组成为：1% (v/v)B27(血清替代物B27)、2% (v/v)N2(血 清替代物N 2)、20ng/mL EGF(表皮生长因子）、50ng/mL bFGF(碱性成纤维细胞生长因子、 10ng/mL IGF-I (类胰岛素生长因子1)、50 μ g/ml青霉素，溶剂为DMEM/F12 (购自Gbico)， DMEM/F12 组成为 DMEM 和 Ham's F-12, pH 值为 L 4。
[0049] 3)稀释后的单细胞悬液经70 μ m的细胞筛过滤，获得单细胞悬液。
[0050] 4)取步骤3)获得的200 μ L单细胞悬液，用2mL内耳干细胞培养基稀释后在37°C、 5% CO2孵育箱中悬浮培养1-5天，其中内耳干细胞会形成内耳干细胞球，其它非干细胞的 细胞由于生长条件的限制而逐渐凋亡。分别取50 μ L培养1、3和5天的内耳干细胞培养基 滴于玻片上，在显微镜下分别放大100倍（图1中的A行）和250倍（图1中的B行）观 察内耳干细胞球。同时，分别取50 μ L培养1、3和5天的内耳干细胞培养基，让其中的内耳 干细胞球在玻片上贴壁后，用200 μ L DAPI试剂（Roche公司）孵育细胞球1-3分钟，进行 DAPI染色，并放大250倍观察内耳干细胞球如图1中C行所示，每一个细胞球里有几十至数 百个细胞。
[0051] 实施例2内耳干细胞诱导分化为内耳祖细胞
[0052] 1)将实施例1中培养5天形成的内耳干细胞球用量程为200μ L的移液枪吹打 成单细胞，并IOOOrpm离心5分钟后收集细胞，然后细胞用2mL内耳干细胞培养液重悬后， 37 °C下培养5天形成P2代内耳干细胞球。将P2代内耳干细胞继续传代，获得P3代内耳干 细胞球。
[0053] 2)用200 μ L 0. lmg/ml的多聚赖氨酸（Sigma公司）孵育培养皿5分钟，然后完全 吸除多聚赖氨酸。用PBS漂洗培养皿3次，每次5分钟。将培养皿放入37°C孵育箱中干燥 过夜。
[0054] 3)将P3代内耳干细胞球以500球/ml的密度悬浮在内耳祖细胞培养基中，然后 接种于上述用多聚赖氨酸预处理的培养皿中，在37°C、5% CO2孵育箱中贴壁培养7天，形成 含内耳祖细胞的培养液，将培养液IOOOrpm离心5分钟，获得内耳祖细胞，如图2。内耳祖 细胞培养基组成为：1% (v/v)B27、2% (v/v)N2(、50ng/mL FGF3(成纤维细胞生长因子3)、 50ng/mLFGF10 (成纤维细胞生长10)，溶剂为DMEM/F12 (购自Gbico)，DMEM/F12组成为DMEM 和 Ham's F-12, pH 值为 L 4。
[0055] 实施例3鸡胚椭圆囊基质细胞的分离与培养
[0056] 1)在显微镜下分离出20个胚胎期（E18)鸡胚的椭圆囊，用0. 5mg/ml的嗜热菌蛋 白酶（Sigma，DMEM/F12稀释）在37°C下处理40分钟。加入5% (v/v)的血清终止消化后 去掉椭圆囊的感觉上皮。
[0057] 2)用PBS(pH值为7.4)清洗20个剩余的椭圆囊基质部分，然后将其转移到 200yLPBS 中。加入 200yL0.25% (w/v)的胰酶/EDTA(购自 Gbico)，37°C 消化 7 分钟。加 入400 μ L含10% (v/v)FBS的DMEM/F12培养基终止消化。
[0058] 3)用Eppendorf移液枪轻柔的吹打鸡胚椭圆囊基质组织，将基质细胞分离出来接 种在IOcm培养皿中，培养液为含10% (v/v)FBS的DMEM/F12,37°C培养至椭圆囊基质细胞 长到整个培养皿的80-90% (图3)的时候进行传代。
[0059] 4)传代时，先完全吸除培养基，然后加入2mL 0.25% (w/v)的胰酶/EDTA(购自 Gbico)，37°C消化7分钟。加入4mL含10% (v/v)FBS的DMEM/F12培养基终止消化。用 Eppendorf移液枪轻柔的将细胞吹打成单细胞悬液。用70 μ m细胞筛过滤细胞悬液，除去 较大的组织。将细胞接种IOcm培养皿中，37°C培养至椭圆囊基质细胞长到整个培养皿的 80-90%的时候进行下一次传代。细胞继续扩增两代,然后进行冻存,冻存液为90% (v/v) 血清加10% (v/v)的DMS0,每毫升冻存液中冻存IX IO6个细胞。
[0060] 实施例4内耳祖细胞诱导分化为内耳毛细胞
[0061] 1)将明胶加入到24孔培养板中，37°C孵育半小时。然后完全吸除明胶，将实施例 3制备的P3代鸡胚椭圆囊间质细胞接种在用明胶处理好的培养板中。37°C培养至基质细胞 增长到整个培养板面积的90%的时候，加入200 μ L含丝裂霉素（Sigma，2 μ g/mL)的培养基 (含10% FBS的DMEM/F12)，37°C在孵育箱中孵育3小时。完全吸除培养基，然后用PBS(pH 值7. 4)漂洗细胞3次，每次5分钟，获得灭活的鸡胚椭圆囊间质细胞。
[0062] 2)将实施例2制备的内耳祖细胞接种在灭活的鸡胚椭圆囊间质细胞上，用内耳毛 细胞诱导培养基在37°C下诱导分化7天，部分细胞分化为内耳毛细胞，具有毛细胞的形态， 如图4。内耳毛细胞培养基组成为：1% (ν/ν)Β27、2% (ν/ν)Ν2、5μΜ DAPT(Sigma公司）， 溶剂为 DMEM/F12 (购自 Gbico)，DMEM/F12 组成为 DMEM 和 Ham's F-12, pH 值为 L 4。
[0063] 实施例5诱导分化的内耳毛细胞基因表达检测
[0064] 1)分化后细胞总RNA提取：将实施例4中祖细胞分化7天之后形成的含毛细胞 的细胞群体收集在15ml离心管中，IOOOrpm离心5分钟弃上清；加入ImL TRIzol (TakaRa 公司），置漩涡振荡器上震荡至细胞完全溶解后，转移至I. 5ml EP管（Axgen公司）中； 加入200 μ L氯仿（国药集团化学试剂有限公司），剧烈振荡混匀，室温放置5min ;4°C下 12, OOOrpm离心15min，吸取上层水相约300 μ L入新的I. 5ml EP管中；加入等体积的异 丙醇（国药集团化学试剂有限公司），颠倒混勻，室温静置IOmin ;4°C下12, OOOrpm离心 IOmin,弃上清；用体积浓度75%的乙醇水溶液洗漆沉淀，4?下12, OOOrpm离心5min，弃上 清；室温干燥2-5min后，加入适量DEPC水（Sigma公司）溶解，即为总RNA样品，用于下一 步实验或保存于-80°C冰箱。
[0065] 2) cDNA第一链合成：总RNA样品用DNA酶（Sigma公司）消化处理清除残余的 基因组DNA污染，用紫外分光光度计测定（波长为260nm) RNA浓度。cDNA第一链合成采 用反转录试剂盒（Fermentas公司），每个样品取2 μ g总RNA(0. 5-1 μ L)用于第一链合 成。具体步骤如下：2μ g总RNA(0. 5_1μ L)、ly L oligo(dT)18引物和1μ L随机引物， ddH20 补至总体积 12μ L，置 65°C反应 5min ;加入 5Xbuffer 4uL、dNTP 2μ L、ribolockTM RNase inhibitor 1 μ L 和 RevertAidTM M-MulV 反转录酶 1 μ L，反应总体积为 20uL, 25°C 5min - 42°C 60min - 70°C 5min。合成的 cDNA 第一链用于下一步 PCR 反应。
[0066] 3)PCR反应：将上述制备的cDNA第一链作为模板进行RT-PCR扩增，所用引物序列 见表UPCR反应采用PCR Mix试剂盒（上海翊圣生物技术有限公司），PCR反应体系为：cDNA 2yL、2mM dNTP IyLUOyM 的上下游引物各 IyLUOXbufTer(含 Mg2+)5yL 和 TaqDNA 聚 合酶1 μ匕加 H2O补至总体积50μ L。PCR程序为：94°C预变性5min，94°C变性30s，53°C? 62°C退火30s，72°C延伸30s，35循环，72°C延伸7min，退火温度和循环数根据引物的具体情 况进行选择。反应完成后取5 μ L扩增产物加1 μ L溴酚兰指示剂（Sigma公司），用1. 2% 的琼脂糖（Biowest公司）进行凝胶电泳。电泳完毕后，用凝胶成像分析系统观测结果如图 5。表明实施例4中的内耳祖细胞经诱导分化之后，部分细胞分化为毛细胞。
[0067] 表1用于RT-PCR的引物序列
[0068]
【权利要求】
1. 一种检测小鼠内耳毛细胞的标记分子，其特征在于所述的标记分子为Chrna9和 Espnl 0
2. -种权利要求1所述的检测小鼠内耳毛细胞的标记分子的应用，其特征在于所述的 应用为：从小鼠耳蜗基底膜分离单细胞，提取单细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板， 分别以Chrna9正向引物和Chrna9反向引物，Espnl正向引物和Espnl反向引物作为两对 引物进行PCR扩增，若Chrna9正向引物和Chrna9反向引物扩增产物355bp，Espnl正向引 物和Espnl反向引物扩增产物759bp，则单细胞为小鼠内耳毛细胞； Chrna9 正向引物：5' -AGCTGCGTCTCCAGTCAITC-3' ； Chrna9 反向引物：5' -TGCTGTCTCTACGGCITTGA-3 ; Espnl 正向引物：5' -GGTGGAGTGGTTACTCCGTG-3' ； Espnl 反向引物：5' -GGCATGTGGGCAITTCATCA-3'。
【文档编号】C12N15/11GK104313131SQ201410493237
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】王金福, 柳全文 申请人:浙江大学