一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法
【专利摘要】一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，步骤为：一、对刺柏属物种的干燥叶片或种子，进行叶片总DNA或种子胚乳DNA的提取；二、对检测合格的DNA样品，利用核基因Chi1引物进行PCR扩增和测序；三、PCR扩增产物的纯化；四、对纯化产物进行测序反应；五、测序反应产物进一步纯化；六、纯化产物利用遗传分析仪进行数据收集；或对核基因Chi1扩增的PCR产物，用遗传分析仪进行测序和数据收集；七、测序得到的原始序列峰图用软件打开，对测序质量高的个体读取碱基数据信息；原始序列比对和校正；鉴定出刺柏属近缘物种小子圆柏（JM）、方枝圆柏（JS）和西藏圆柏（JT）核基因Chi1的序列；八、分析和比对序列之间的差异程度，进行物种鉴定；具有鉴别快速和准确的特点。
【专利说明】一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物【技术领域】，具体涉及一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法。
【背景技术】
[0002]物种的快速鉴定和识别是保护生物学和生物多样性研究的基础。然而，长期以来，人们对于植物物种的鉴定和识别主要依赖于物种间明显的外部形态特征，如植物的花、果实、种子、根、茎和叶等。同时，还依赖于专业分类人员的实践经验和指导。然而，在当前传统分类学专业人员急剧减少的情况下，基于物种外部形态特征的分类学鉴定方法，很难准确鉴定和识别物种间外部形态特征差异较小(尤其是物种间存在中间过渡形态性状的时候)的近缘植物物种类群。
[0003]近年来，随着分子生物学技术的发展，尤其是DNA分子测序技术的飞速进步，DNA分子条形码(DNA Barcoding)技术被提出用来快速鉴定物种。这一方法主要是通过对一段标准目的DNA分子序列片段进行比对分析从而对相关物种进行快速鉴定。作为一种新型的物种鉴定手段，DNA条形码技术自提出以来就被广泛应用到很多近缘类群的物种鉴定方面，如哺乳动物、鸟类、昆虫和鱼类等。在这些动物类群中，线粒体细胞色素C氧化酶(COI)基因序列有着丰富的和物种特有的变异位点，被认为可以作为动物物种鉴别的核心DNA分子条形码标记。然而，在植物类群中，由于线粒体基因较慢的进化速率，导致很难寻找到含有丰富变异的线粒体基因位点，这严重限制了线粒体基因标记在植物类群物种鉴定中的应用。鉴于此，国际生命条形码联盟(CBOL)和中国植物条形码研究团队(China Plant BOLGroup)通过对大量植物类群的多个叶绿体DNA片段的反复筛选和实验研究，发现在被子植物中进化速率相对较快的叶绿体rbcL+matK基因标记组合以及核ITS基因片段有着丰富的变异位点，可以用来作为种子植物的核心DNA条形码分子标记。另外，叶绿体trnH-psbA基因片段可以作为辅助条形码标记，用于植物物种的DNA分子鉴定。
[0004]然而，对于裸子植物类群来说，由于叶绿体基因较慢的突变速率，加上裸子植物本身较长的世代周期(从种子发育到植株个体成熟到再次产生种子，大约需要15年左右的时间)和大的有效种群大小(数量)导致了叶绿体DNA条形码rbcL+matK+trnH-psbA标记组合以及核ITS基因片段无法准确区分裸子植物近缘物种。这尤其表现在近期发生物种形成历史的柏科刺柏属物种上面，导致刺柏属物种间叶绿体DNA片段以及核ITS基因片段基因位点间的大量共享，使得使用这些标准DNA条形码分子标记组合很难准确鉴定和识别刺柏属近缘物种。本发明拟找到一段能够在刺柏属物种中具有丰富变异位点的核基因引物进行区分和鉴定刺柏属近缘物种。
【发明内容】
[0005]为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，柏科刺柏属物种由于具有大量相同的外部形态特征和一些中间过度形态，一般都为常绿乔木或灌木树种；雌雄同株或异株；叶为刺叶或鳞叶，披针形或近条形；雄球花卵圆形或矩圆形，雌球花近圆球形；球果浆果状，近球形；种鳞合生，肉质；种子1-6粒，无翅，常有树脂槽，这导致了运用传统的形态分类学鉴定方法很难快速准确的鉴别这些物种，同时，由于刺柏属物种之间相对较近的物种形成和分化历史和大的有效种群数量，使得利用单亲遗传、进化速率较慢的叶绿体DNA分子标记很难鉴别这些物种。研究发现，柏科刺柏属物种在国际生命条形码联盟和中国植物条形码研究团队推荐使用的核心叶绿体DNArbcL+matK+trnH-psbA条形码标记组合和核ITS基因片段上均存在大量的基因多态性共享，导致无法准确区分刺柏属近缘物种。另外，以前的物种分子鉴定研究，大多一个物种取样一个个体进行鉴定，导致一个物种在不同地方进行取样时，由于近缘物种间的基因多态性共享或渐渗，可能使得亲缘关系较近的物种具有相同的基因序列或变异，这给物种的准确鉴别带来了极大困难，因此，本发明的目的是筛选出一种能够在刺柏属多个近缘物种中取样多个个体，利用具有双亲遗传特征、而且进化速率较快的核基因DNA分子条形码标记，进行物种的快速和准确鉴别的方法；利用具有双亲遗传特征、而且进化速率较快的核基因DNA分子条形码标记，进行物种的快速和准确鉴别。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，能够对刺柏属近缘物种进行快速和准确鉴别的DNA分子条形码标记，主要是利用一段双亲遗传的核基因Chil引物对刺柏属近缘种不同个体的DNA样品进行扩增和序列测定，从而进行序列比对分析以及系统进化树的构建，进一步比较分析序列间的变异以及系统进化树上不同物种个体的聚类情况来进行物种的快速鉴定；具体包括以下步骤:
[0007]—、对采集的刺柏属物种的干燥叶片或种子，使用CTAB法进行叶片总DNA或种子胚乳DNA的提取；具体程序如下:
[0008]I)取自然干燥的刺柏属物种的一颗成熟种子，砸开外种皮；用蒸馏水侵泡种子10-24小时，用镊子分离种子中单倍体的胚乳，保存于4°C的冰箱内；
[0009]2)研磨胚乳或粉碎叶片:对于分离的单倍体胚乳，放入事先预冷的研钵中，一颗种子的胚乳放到一起，加入适量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)粉末和液氮，迅速研磨成细粉末；对于干燥叶片，直接用电子天平称取0.02g，然后与不锈钢珠一同放进2.0mL的离心管中，并在离心管中加入适量PVP粉末，一同置于组织研磨器以30Hz频率打磨粉碎样品3min，使其尽可能成为粉末；
[0010]3)粉末中加入800 μ L在65 V水浴中预热的2 X CTAB溶液和8 μ L的β -巯基乙醇，轻弹让粉末完全混匀于2 X CTAB溶液中，将离心管置于65°C水浴锅中水浴45min，期间每隔1min上下颠倒混匀；
[0011]4)取出离心管，待温度降到室温，在12000rpm，4°C条件下离心1min ;用剪掉头的蓝色枪头吸取上清液置于新的2.0mL离心管中，然后加入800 μ L氯仿-异戊醇溶液，上下颠倒混匀离心管lOmin，以进行杂质的抽提；
[0012]5)在转速10000rpm、4°C条件下离心1min,转移上层液体到新的2.0mL离心管中，并加入800 μ L氯仿-异戊醇溶液，上下颠倒混匀离心管1min ；
[0013]6)在转速10000rpm，4°C条件下离心lOmin，用移液器吸取上清液(注意尽量不要吸取中间层的液体)置于1.5mL的新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇轻摇混匀，置于_20°C的冰箱中保存90min以上；
[0014]7)取出后在4°C，转速12000rpm下离心lOmin，倒掉上层废液，再用70%乙醇漂洗沉淀2次，每次2-4min，然后放在超净工作台上自然风干；
[0015]8)在离心管中加入60 μ L双蒸水溶解DNA沉淀，用浓度为I %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和产量，置于4°C的冰箱内保存备用；
[0016]二、对检测合格的DNA样品，利用核基因Chil引物进行PCR扩增和测序；
[0017]具体PCR 扩增体系为 25 μ L:包括 2.5 μ LlO X PCR buffer, 0.5 μ L25mmoI/LMgCl2,5ymol/L 正反向核基因 Chil 引物各 1.2 μ L, 0.5 μ LlOmmol/LdNTP, 0.25 μ L5U/ μ Lr-TagDNA聚合酶，10?50ng的模板DNA，充分混匀后，在普通PCR扩增仪上进行PCR扩增反应；
[0018]扩增程序为:先在94°C条件下预变性4分钟，接着进行36个循环，包括在94°C条件下变性45秒，55 °C条件下退火45秒，72 °C条件下延伸2分30秒，最后72 °C条件下终延伸10分钟，扩增产物保存在4°C的冰箱内，用浓度为I %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的纯度和产量；
[0019]三、PCR扩增产物的纯化
[0020]使用纯化试剂盒CASpure PCR Purificat1n Kit对PCR扩增产物进行纯化:
[0021]I)在solut1n II中加入4倍体积的无水乙醇；
[0022]2)从PCR反应管中将反应产物移至干净的1.5mL离心管中，加入5倍体积的solut1n I混合均勻，得到混合液；
[0023]3)将混合液转移到一个已经套入2.0mL离心管的吸附柱内，室温放置2min，在转速 1000rpm 时离心 Imin ；
[0024]4)重复步骤3) —次；
[0025]5)倒掉2.0mL离心管中的废液，将吸附柱放入同一个2.0mL离心管中，于转速1000rpm的条件下空柱离心2min ；
[0026]6)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，于37°C时放置8_12min以确保乙醇完全挥发干净；
[0027]7)在吸附柱中吸附膜的中央加入30 μ L灭菌的双蒸水进行洗脱，双蒸水65°C预热，室温或37°C的水浴静置Imin以上；
[0028]8)转速1000rpm的条件下离心lmin，此1.5mL离心管中的液体即为回收的DNA片段，用浓度为I %的琼脂糖凝胶电泳检测纯化产物的纯度和产量，于4°C条件下保存备用；
[0029]四、对纯化产物进行测序反应
[0030]纯化后的产物，用与PCR扩增时相同的引物进行测序反应，在普通PCR扩增仪上进行，10 μ L的反应体系包括:Big Dye Terminator (ABI) 2.5 μ L，正向或反向核基因Chil引物5pmol，纯化后的模板产物25-50ng，测序反应的条件如下:
[0031]首先95°C条件下预变性8秒，接着进行25个循环，包括95°C条件下变性15秒，50°C条件下退火15秒，60°C条件下延伸90秒，最后60°C条件下终延伸90秒，测序反应的产物保存在4 °C的冰箱内；
[0032]五、测序反应产物的进一步纯化
[0033]测序反应的产物按如下步骤进行纯化:
[0034]I)加入25 μ L的醋酸钠，避光室温放置30min，在25°C、转速4000rpm的条件下离心 30min ；
[0035]2)离心结束后立即倒扣离心,转速不超过500rpm ;
[0036]3)加入35μ L的75%乙醇，立即在25°C、转速4000rpm的条件下离心15min ；
[0037]4)离心结束后立即倒扣离心,转速不超过500rpm ;
[0038]5)加入40μ L的75%乙醇，立即在25°C、转速4000rpm的条件下离心15min ；
[0039]6)离心结束后立即倒扣离心,转速不超过500rpm ;
[0040]7) 37°C的烘箱烘干半小时以上；
[0041]8)取出后加入10 μ L甲酰胺；
[0042]9)变性上机:95°C条件下变性5min，取出后快速放于冰上冷冻1min ；
[0043]10)纯化产物保存于4°C的冰箱内，待上机收集数据；
[0044]六、纯化产物利用ABI 3130x1 Genetic Analyser遗传分析仪进行数据收集；或者对于Chil基因扩增的PCR产物，利用ABI 3730x1 Genetic Analyser遗传分析仪进行测序和数据的收集；
[0045]七、测序得到的原始序列峰图用Chromas软件打开，并对测序质量高的个体读取碱基数据信息；然后利用MEGA ver.6.0软件进行序列比对和校正；鉴定出刺柏属近缘物种小子圆柏(JM)、方枝圆柏(JS)和西藏圆柏(JT)Chil基因的序列:
[0046]小子圆柏#292_1_JM
[0047]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA
[0048]小子圆柏#292_2_JM
[0049]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA
[0050]方枝圆柏#270-l_JS
[0051]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCATGCCAC
GACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGAC
CAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGA
GGTATTGCGATATATTAGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTA
GAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTT
TGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA
[0052]方枝圆柏#061-4_JS
[0053]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTAGCCTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTAGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA
[0054]西藏圆柏#183-1_JT
[0055]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAACTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCTCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATACTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCCATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA
[0056]西藏圆柏#222-2_JT
[0057]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAACTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCTCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0058]八、分析和比对序列之间的差异程度，进行刺柏属小子圆柏(JM)、方枝圆柏(JS)和西藏圆柏(JT)的物种鉴定；
[0059]由序列比对和分析可以看出，刺柏属三个近缘物种在Chil基因序列上存在明显的遗传差异，相互之间能够区分，方枝圆柏(JS)的两个个体270-1-JS和061-4-JS在核苷酸110bp、290bp和476bp位置处存在着特有的基因变异位点；小子圆柏(JM)的两个个体292-1-JM和292-2-JM在28bp、120bp、189bp和449bp位置处存在着特有的变异位点；而西藏圆柏(JT)的两个个体183-1-JT和222-2-JT在165bp、281bp、197bp和281bp处存在特有的基因变异，这些特有的基因变异位点使得三个刺柏属物种之间能够准确区分；
[0060]利用MEGA ver.6.0软件基于距离法进行系统进化树的构建，由系统进化关系树可得知，每个刺柏属物种的个体能够单独聚到一个独立的遗传分支上，对应于该物种本身，使得这些物种之间能够准确区分。
[0061]所述的2XCTAB溶液为十六烷基三甲基溴化铵溶液，其成分为:10mmol/LTris-HCl PH 8.0, 1.4mol/LNaCl, 20mmol/L 乙二胺四乙酸二钠和 2% CTAB。
[0062]所述的氯仿-异戊醇溶液的体积比为24:1。
[0063]所述的无水乙醇需预先在_20°C冰箱预冷2小时以上。
[0064]所述的双蒸水的PH大于7.0。
[0065]所述的核基因Chil引物的序列为，正向:GGCGGCGGAGATTACTGTA，反向:TAGAAGACGCGCATTTGAGAA。
[0066]本发明的有益效果:
[0067]本发明提供的DNA分子条形码标记Chil基因序列能够对刺柏属近缘物种进行快速和准确的鉴别，能够为刺柏属物种的物种分类和分子系统发育研究鉴定基础。通过对刺柏属的三个物种小子圆柏、方枝圆柏和西藏圆柏的个体，进行Chil基因的PCR扩增和测序，并对序列进行比对和系统聚类分析，发现每一个物种的两个个体能够单独的聚到一个独立的遗传分支上，并且得到了中度到高度水平的支持率。例如方枝圆柏(JS)的两个个体270-1-JS和061-4-JS聚到一个遗传分支上的支持率为99 ;西藏圆柏(JT)的两个个体183-1-JT和222-2-JT聚在一起的支持率为68，而小子圆柏(JM)的两个个体292-1-JM和292-2-JM聚到一起的支持率为100，说明使用该核基因Chil基因序列能够对这些物种进行准确和快速的分类鉴别。
[0068]同时，本发明提供的DNA分子条形码鉴定方法，不仅是对传统刺柏属物种鉴定的强有力补充，而且使该属植物标本鉴定过程实现了自动化和标准化，突破了对专业分类人员经验的过度依赖，能够在较短时间内建立形成易于利用的应用系统。这一技术将极大地促进人类监测、了解以及利用柏科刺柏属物种生物多样性的能力，在该属物种的保护生物学和生物多样性研究领域具有广泛的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0069]图1为提取DNA的I %琼脂糖凝胶电泳结果图。
[0070]图2为扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳结果图。
[0071]图3为纯化产物的1%琼脂糖凝胶电泳结果图。
[0072]图4为刺柏属物种Chi I基因的部分序列峰图。
[0073]图5为三个刺柏属近缘物种Chil基因序列变异情况图；其中图5(a)为Chil基因l-300bp的序列变异情况图，图5(b)为Chil基因301-400bp的序列变异图，图5 (c)为Chil基因401-500bp的序列变异图，图5(d)为Chil基因501-600bp的序列变异图，05(e) %Chil基因601-679bp的序列变异图。
[0074]图6为三个刺柏属物种基于Chil基因的系统进化关系图。
[0075]图7为五个刺柏属近缘物种Chil基因序列变异图；其中图7(a)为Chil基因1-1OObp的序列变异图，图7(b)为Chil基因101-200bp的序列变异图，图7 (c)为Chil基因201-300bp的序列变异图，图7⑷为Chil基因301-400bp的序列变异图，图7 (e)为Chil基因401-500bp的序列变异图，图7(f)为Chil基因501-600bp的序列变异图，图7 (g)为Chil基因601-687bp的序列变异图。
[0076]图8为五个刺柏属物种基于Chil基因的系统进化关系图。
【具体实施方式】
[0077]下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
[0078]实施例1
[0079]—种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，包括以下步骤:
[0080]一、对采集的刺柏属物种的干燥叶片或种子，使用CTAB法进行叶片总DNA或种子胚乳DNA的提取；具体程序如下:
[0081]I)取自然干燥的刺柏属物种的一颗成熟种子，砸开外种皮；用蒸馏水侵泡种子10-24小时，用镊子分离种子中单倍体的胚乳，保存于4°C的冰箱内；
[0082]2)研磨胚乳或粉碎叶片:对于分离的单倍体胚乳，放入事先预冷的研钵中，一颗种子的胚乳放到一起，加入适量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)粉末和液氮，迅速研磨成细粉末；对于干燥叶片，直接用电子天平称取0.02g，然后与不锈钢珠一同放进2.0mL的离心管中，并在离心管中加入适量PVP粉末，一同置于组织研磨器以30Hz频率打磨粉碎样品3min，使其尽可能成为粉末；
[0083]3)粉末中加入800 μ L在65 V水浴中预热的2 X CTAB溶液和8 μ L的β -巯基乙醇，轻弹让粉末完全混匀于2XCTAB溶液中，将离心管置于65°C水浴锅中水浴45min，期间每隔1min上下颠倒混匀；
[0084]4)取出离心管，待温度降到室温，在12000rpm，4°C条件下离心1min ;用剪掉头的蓝色枪头吸取上清液置于新的2.0mL离心管中,然后加入800 μ L氯仿-异戊醇溶液,轻轻的上下颠倒混匀离心管lOmin，以进行杂质的抽提；
[0085]5)在转速10000rpm、4°C条件下离心1min,转移上层液体到新的2.0mL离心管中，并加入800 μ L氯仿-异戊醇溶液，上下颠倒混匀离心管1min ；
[0086]6)在转速1000rpm, 4°C条件下离心1min,用移液器吸取上清液(注意尽量不要吸取中间层的液体)置于1.5mL的新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇轻摇混匀，置于_20°C的冰箱中保存90min以上；
[0087]7)取出后在4°C，转速12000rpm下离心lOmin，倒掉上层废液，再用70%乙醇漂洗沉淀2次，每次2-4min，然后放在超净工作台上自然风干；
[0088]8)在离心管中加入60 μ L双蒸水溶解DNA沉淀，用浓度为I %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和产量(如图1)，置于4°C的冰箱内保存备用；
[0089]二、对检测合格的DNA样品(如图1所示)，利用核基因Chi I引物进行PCR扩增和测序，正向:GGCGGCGGAGATTACTGTA，反向:TAGAAGACGCGCATTTGAGAA ;
[0090]具体PCR 扩增体系为 25 μ L:包括 2.5 μ LlO X PCR buffer, 0.5 μ L25mmoI/LMgCl2,5ymol/L 正反向核基因 Chil 引物各 1.2 μ L, 0.5 μ LlOmmol/LdNTP, 0.25 μ L5U/ μ Lr-TagDNA聚合酶，10?50ng的模板DNA，充分混匀后，在普通PCR扩增仪上进行PCR扩增反应；
[0091]扩增程序为:先在94°C条件下预变性4分钟，接着进行36个循环，包括在94°C条件下变性45秒，55 °C条件下退火45秒，72 °C条件下延伸2分30秒，最后72 °C条件下终延伸10分钟，扩增产物保存在4°C的冰箱内，用浓度为I %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的纯度和产量(如图2所示)；
[0092]三、PCR扩增产物的纯化
[0093]使用纯化试剂盒CASpure PCR Purificat1n Kit对PCR扩增产物进行纯化:
[0094]I)在solut1n II中加入4倍体积的无水乙醇；
[0095]2)从PCR反应管中将反应产物移至干净的1.5mL离心管中，加入5倍体积的solut1n I混合均勻，得到混合液；
[0096]3)将混合液转移到一个已经套入2.0mL离心管的吸附柱内，室温放置2min，在转速 1000rpm 时离心 Imin ；
[0097]4)重复步骤3) —次；
[0098]5)倒掉2.0mL离心管中的废液，将吸附柱放入同一个2.0mL离心管中，于转速1000rpm的条件下空柱离心2min ；
[0099]6)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，于37°C时放置8_12min以确保乙醇完全挥发干净；
[0100]7)在吸附柱中吸附膜的中央加入30 μ L灭菌的双蒸水进行洗脱，双蒸水65°C预热，室温或37°C的水浴静置Imin以上；
[0101]8)转速1000rpm的条件下离心lmin，此1.5mL离心管中的液体即为回收的DNA片段，用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测纯化产物的纯度和产量(如图3)，于4°C条件下保存备用。
[0102]四、对纯化产物进行测序反应
[0103]纯化后的产物，用与PCR扩增时相同的引物进行测序反应，在普通PCR扩增仪上进行，10 μ L的反应体系包括:Big Dye Terminator (ABI) 2.5 μ L，正向或反向核基因Chil引物5pmol，纯化后的模板产物25-50ng，测序反应的条件如下:
[0104]首先95°C条件下预变性8秒，接着进行25个循环，包括95°C条件下变性15秒，50°C条件下退火15秒，60°C条件下延伸90秒，最后60°C条件下终延伸90秒，测序反应的产物保存在4 °C的冰箱内；
[0105]五、测序反应产物的进一步纯化
[0106]测序反应的产物按如下步骤进行纯化:
[0107]I)加入25 μ L的醋酸钠，避光室温放置30min，在25°C、转速4000rpm的条件下离心 30min ；
[0108]2)离心结束后立即倒扣离心,转速不超过500rpm ;
[0109]3)加入35 μ L的75%乙醇,立即在25°C、转速4000rpm的条件下离心15min ;
[0110]4)离心结束后立即倒扣离心,转速不超过500rpm ;
[0111]5)加入40 μ L的75%乙醇,立即在25°C、转速4000rpm的条件下离心15min ；
[0112]6)离心结束后立即倒扣离心,转速不超过500rpm ;
[0113]7) 37°C的烘箱烘干半小时以上；
[0114]8)取出后加入1yL甲酰胺；
[0115]9)变性上机:95°C条件下变性5min，取出后快速放于冰上冷冻1min ；
[0116]10)纯化产物保存于4°C的冰箱内，待上机收集数据；
[0117]六、纯化产物利用ABI 3130x1 Genetic Analyser遗传分析仪进行数据收集；或者对于Chil基因扩增的PCR产物，利用ABI 3730x1 Genetic Analyser遗传分析仪进行测序和数据的收集；
[0118]七、测序得到的原始序列峰图用Chromas软件打开，并对测序质量高的个体(如图4所示，峰图整齐，没有杂峰干扰)读取碱基数据信息；然后利用MEGAver.6.0软件进行序列比对和校正；鉴定出刺柏属近缘物种小子圆柏(JM)、方枝圆柏(JS)和西藏圆柏(JT)Chil基因的序列:
[0119]#292-l_JM(小子圆柏)
[0120]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0121]#292-2_JM (小子圆柏)
[0122]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0123]#270-l_JS (方枝圆柏)
[0124]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCATGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTAGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0125]#061-4_JS (方枝圆柏)
[0126]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTAGCCTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTAGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0127]#183-1_JT (西藏圆柏)
[0128]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAACTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCTCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATACTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCCATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0129]#222_2_JT (西藏圆柏)
[0130]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAACTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCTCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0131]八、分析和比对序列之间的差异程度(见图5)，进行刺柏属小子圆柏(JM)、方枝圆柏(JS)和西藏圆柏(JT)的物种鉴定；
[0132]由序列比对和分析可以看出，刺柏属三个近缘物种在Chil基因序列上存在明显的遗传差异，相互之间能够区分，例如方枝圆柏(JS)的两个个体270-1-JS和061-4-JS在核苷酸110bp、290bp和476bp位置处存在着特有的基因变异位点；小子圆柏(JM)的两个个体292-1-JM和292-2-JM在28bp、120bp、189bp和449bp位置处存在着特有的变异位点；而西藏圆柏(JT)的两个个体183-1-JT和222-2-JT在165bp、281bp、197bp和281bp处存在特有的基因变异，这些特有的基因变异位点使得三个刺柏属物种之间能够准确区分；
[0133]同时，利用MEGA ver.6.0软件基于距离法进行系统进化树(Bootstrap值设置为1000，其他参数选择默认值)的构建，由系统进化关系树(见图6)可以看出，每个刺柏属物种的个体能够单独聚到一个独立的遗传分支上，对应于该物种本身，使得这些物种之间能够准确区分。
[0134]实施例2
[0135]应用本发明对刺柏属近缘物种进行快速的分子鉴定:对采集的刺柏属近缘物种祁连圆柏、密枝圆柏、小子圆柏、方枝圆柏和西藏圆柏的叶片或种子，进行DNA的提取，并利用本发明提供的核基因引物Chil进行DNA样本的PCR扩增和测序，比对和分析所测序列与本发明序列之间的差异，并进行所有序列系统进化树的构建和聚类分析，从而进行刺柏属物种的分子鉴定；
[0136]一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，包括以下步骤:
[0137]—、提取刺柏属近缘物种祁连圆柏、密枝圆柏、小子圆柏、方枝圆柏和西藏圆柏不同个体的DNA ；
[0138]步骤一?步骤六与实施例一的步骤一?步骤六相同；
[0139]七、测序得到的原始序列峰图用Chromas软件打开，并对测序质量高的个体读取碱基数据信息；然后利用MEGA ver.6.0软件进行序列比对和校正；鉴定出Chil基因的序列:
[0140]小子圆柏#292-l_JM
[0141 ] CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0142]小子圆柏#292-2_JM
[0143]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGACGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGACTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；TTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCATGTGTTTGGT
ATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTG
0>00^0>^0>0000^?>^000>0000^00000>000>0>0000^000000>0?0^000000^>000>0^0>00>00?^>^?^?>000>0000^^0?^00000?>000^000>^^00>000^00>00>^000>^^00>^^0^>0?0>GGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTMTCTCGACTGCTTTMCCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTAGMMTCCCCMTTCATCCAGACCGTGGTGTGMAGGCCTTMTGTGAGTGTTMTMTGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ;
〔0148〕珣漭画苗 #190-2IJC
1--10149Uo>>T>TT>oGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCATGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTG
0>00^0>^0>0000^?>^000>0000^00000>000>0>0000^000000>0?0^000000^>000>0^0>00>0CAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTMTCTCGACTGCTTTMCCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTAGMMTCCCCMTTCATCCAGACCGTGGTGTGMAGGCCTTMTGTGAGTGTTMTMTGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ;
〔0150〕 珣漭画苗#013丨1丨^
〔0151Uo>>T>TT>oGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGMCTATMTTACATAGCGGCTGGGMGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGMCGATCCGGATATTGTTG
Gacgtcatgacgggtmatggcagccgtcgggcagcgacagcgctgcgggcagmgtgcggggtacggagtgacga0
CAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGA
GGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTMTCTCGACTGCTTTMCCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTA
GMMTCCCCMTTCATCCAGACCGTGGTGTGMAGGCCTTMTGTGAGTGTTMTMTGTTTGTTTGTGTGAGTTT
18TGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0152]密枝圆柏#013-3_JC
[0153]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0154]密枝圆柏#013-6_JC
[0155]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATATTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0156]祁连圆柏#151-9_JP
[0157]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAACTCTGCTCAGGCCGGAAATCTGATGTTTGTATTGGTTGCTTTTCCACTTTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTGTGCTTGAACTATAATTACATTGCGGCTGGGAAGGCTATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTATAAGAGGTATTGTGATATACTGGGGGTGAGCTATGGCCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCGCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAACGGCGTTAATGTGAGTGTCAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0158]祁连圆柏#06-l_JP
[0159]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAACTCTGCTCAGGCCGGAAATCTGATGTTTGTATTGGTTGCTTTTCCACTTTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTGTGCAGGAACTATAATTACATTGCGGCTGGGAAGGCTATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGTGATATACTGGGGGTGAGCTATGGCCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCGCTATTCATCCAGACCGTGGTGTGAACGGCGTTGATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0160]祁连圆柏#06-9-JP
[0161]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAACTCTGCTCAGGCCGGAAATCTGATGTTTGTATTGGTTGCTTTTCCACTTTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTGTGCAGGAACTATAATTACATTGCGGCTGGGAAGGCTATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGTGATATACTGGGGGTGAGCTATGGCCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCGCTATTCATCCAGACCGTGGTGTGAACGGCGTTGATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0162]祁连圆柏#06-14_JP
[0163]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAACTCTGCTCAGGCCGGAAATCTGATGTTTGTATTGGTTGCTTTTCCACTTTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTGTGCAGGAACTATAATTACATTGCGGCTGGGAAGGCTATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGTGATATACTGGGGGTGAGCTATGGCCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCGCTATTCATCCAGACCGTGGTGTGAACGGCGTTGATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0164]祁连圆柏#dlh-ll_JP
[0165]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAACTCTGCTCAGGCCGGAAATCTGATGTTTGTATTGGTTGCGTTTCCACTTTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTGTGCAGGAACTATAATTACATTGCGGCTGGGAAGGCTATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCGAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGTTTCTACAAGAGGTATTGTGATATATTGGGGGTGAGCTATGGCCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAACGGCGTTGATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0166]方枝圆柏#270-l_JS
[0167]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCATGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGATGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ;
〔0170〕^^aa:#061-4-JS
〔017 Iuo>>T>TT>oGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTAGCCTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTMGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCMACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTMATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGMGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACMGAGGTATTGCGATATATTAGGGGTGAGCTATGGTCCTMTCTCGACTGCTTTMCCAGAGACCCTTTGGTTTTGCCCTAGMMTCCCCMTTCATCCAGACCGTGGTGTGMAGGCCTTMTGTGAGTGTTMTMTGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ;
〔0172〕社漭画a:#061-5-JS
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〔0174〕到S画苗 #1S-1-JT
1--10175U CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGMCTATMCTACATAGCGGCTGGGMGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGMCGATCCGGATATTGTTG
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〔0176U 到■画苗#222-2丨！1
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〔0178〕到■画苗#157-1丨！1
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〔0180Ums 画苗 #157-9IJT
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〔0182〕到■画苗#303-4丨！1
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[0184]西藏圆柏#327-3_JT
[0185]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACCACACTGTGAAGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGGTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCTCAGTCTCCCAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATACTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0186]西藏圆柏#293-l_JT
[0187]CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGCTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTTGATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACGTTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCATGTGTTTGGTATTATGCAGGAACTATAATTACATAGCGGCTGGGAAGGCGATTGGCTTCGACGGGTTGAACGATCCGGATATTGTTGCTCGAGATGCCACGGTCTCGTTTAAGACGGCGATCTGGTTCTGGATGACGGCGCAGTCTCCCAAACCGTCGTGCCACGACGTCATGACGGGTAAATGGCAGCCGTCGGGCAGCGACAGCGCTGCGGGCAGAAGTGCGGGGTACGGAGTGACGACCAATATAATAAACGGAGGGCTTGAATGCGGGAAAGGGTCGGATTCGAGGGTGCAGGATCGCATTGGATTCTACAAGAGGTATTGCGATATACTGGGGGTGAGCTATGGTCCTAATCTCGACTGCTTTAACCAGAGGCCCTTTGGTTTTGCCCTTGAAAATCCCCCATTCATCCAGACCGTGGTGTGAAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTTTTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTCAATA ；
[0188]八、分析和比对序列之间的差异程度，进行物种鉴定；经过序列比对和分析发现，小子圆柏(JM)的三个个体292-l-JM、292-2-JM和132-1-JM在28bp、197bp和409bp处存在着三个特有的基因变异位点，祁连圆柏的5个个体151-9-JP、06-l-JP、06-9-JP、06-14-JP和 dlh-11-JP 在 40bp、58bp、65bp、77bp、87bp、157bp、184bp、199bp、475bp、499bp、579bp 和583bp处存在着12个特有的替代(变异)位点，同时在45-52bp处存在着一个特有的插入/缺失位点变异，方枝圆柏的4个个体270-l-JS、270-2-JS、061-4-JS和061-5-JS在484bp处存在着一个特有的变异位点，这些特有的基因变异位点使得刺柏属近缘物种之间能够初步区分和鉴别(见图7);
[0189]同时,利用分子进化软件MEGA Ver.6.0基于距离法进行系统进化树(Bootstrap值设置为1000，其他参数选择默认值)的构建，进一步进行刺柏属近缘物种的分子鉴定。分析系统进化树(见图8)可以看出，每个刺柏属物种来自不同居群的个体(个体名称的前两位或三位字符代表居群号，中间一个字符代表居群中的个体编号，最后的2个字母代表物种)能够单独聚到一个对应于该物种本身的遗传分支上，使得这些物种之间能够准确的区分和鉴别。例如，祁连圆柏(JP)三个居群(151、06和dlh)的5个个体151-9-JP、06-l-JP、06-9-JP、06-14-JP和dlh-11-JP聚到了一个大的遗传分支上，得到了 100的支持率，小子圆柏(JM)两个居群(292和132)的三个个体292-l-JM、292-2-JM和132-1-JM也聚到了一个遗传分支上，支持率高达99，方枝圆柏(JS)两个居群(270和061)的4个个体270-1-JS、270-2-JS、061-4-JS和061-5-JS聚在一个分支上的支持率为96，而密枝圆柏(JC)两个居群(190 和 013)的 5 个个体 190-l-JC、190-2-JC、013-l-JC、013-3-JC 和 013-6-JC 也聚在了一个大的遗传分支上，对应于该物种本身，尽管支持率较低(34),此外,西藏圆柏(JT)6个不同居群(183、222、157、303、327 和 293)的 7 个个体 183-1-JT、222_2-JT、157-1-JT、157-9-JT、303-4-JT、327-3-JT和293-1-JT也处于系统进化树中一个大的遗传分支上，对应于该物种本身。这些结果显示出核基因Chil序列片段具有高度的物种鉴定能力，能够成功用于刺柏属近缘物种的分子鉴定。
【权利要求】
1.一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，其特征在于，包括以下步骤: 一、对采集的刺柏属物种的干燥叶片或种子，使用CTAB法进行叶片总DNA或种子胚乳DNA的提取；具体程序如下: 1)取自然干燥的刺柏属物种的一颗成熟种子，砸开外种皮；用蒸馏水侵泡种子10-24小时，用镊子分离种子中单倍体的胚乳，保存于4°C的冰箱内； 2)研磨胚乳或粉碎叶片:对于分离的单倍体胚乳，放入事先预冷的研钵中，一颗种子的胚乳放到一起，加入适量的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)粉末和液氮，迅速研磨成细粉末；对于干燥叶片，直接用电子天平称取0.02g，然后与不锈钢珠一同放进2.0mL的离心管中，并在离心管中加入适量PVP粉末，一同置于组织研磨器以30Hz频率打磨粉碎样品3min，使其尽可能成为粉末； 3)粉末中加入800yL在65°C水浴中预热的2XCTAB溶液和8yL的β-巯基乙醇，轻弹让粉末完全混匀于2 X CTAB溶液中，将离心管置于65°C水浴锅中水浴45min，期间每隔1min上下颠倒混勻； 4)取出离心管，待温度降到室温，在12000rpm，4°C条件下离心1min;用剪掉头的蓝色枪头吸取上清液置于新的2.0mL离心管中，然后加入800 μ L氯仿-异戊醇溶液，上下颠倒混匀离心管lOmin，以进行杂质的抽提； 5)在转速10000rpm、4°C条件下离心1min,转移上层液体到新的2.0mL离心管中，并加ASOOyL氯仿-异戊醇溶液，上下颠倒混匀离心管1min ； 6)在转速10000rpm，4°C条件下离心lOmin，用移液器吸取上清液置于1.5mL的新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇轻摇混匀，置于_20°C的冰箱中保存90min以上； 7)取出后在4°C，转速12000rpm下离心lOmin，倒掉上层废液，再用70%乙醇漂洗沉淀2次，每次2-4min，然后放在超净工作台上自然风干； 8)在离心管中加入60μ L双蒸水溶解DNA沉淀，用浓度为I %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和产量，置于4°C的冰箱内保存备用； 二、对检测合格的DNA样品，利用核基因Chil引物进行PCR扩增和测序， 具体 PCR 扩增体系为 25yL:包括 2.5yL10XPCR buffer,0.5 μ L25mmol/L MgCl2,5ymol/L 正反向核基因 Chil 引物各 1.2 μ L, 0.5 μ LlOmmol/LdNTP, 0.25 μ L5U/ μ Lr-TagDNA聚合酶，10?50ng的模板DNA，充分混匀后，在普通PCR扩增仪上进行PCR扩增反应； 扩增程序为:先在94°C条件下预变性4分钟，接着进行36个循环，包括在94°C条件下变性45秒，55 °C条件下退火45秒，72 °C条件下延伸2分30秒，最后72°C条件下终延伸10分钟，扩增产物保存在4°C的冰箱内，用浓度为I %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的纯度和产量； 三、PCR扩增产物的纯化 使用纯化试剂盒CASpure PCR Purificat1n Kit对PCR扩增产物进行纯化: 1)在solut1nII中加入4倍体积的无水乙醇； 2)从PCR反应管中将反应产物移至干净的1.5mL离心管中，加入5倍体积的solut1nI混合均匀，得到混合液； 3)将混合液转移到一个已经套入2.0mL离心管的吸附柱内，室温放置2min，在转速1000rpm 时离心 Imin ； 4)重复步骤3)—次； 5)倒掉2.0mL离心管中的废液，将吸附柱放入同一个2.0mL离心管中，于转速1000rpm的条件下空柱离心2min ； 6)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，于37°C时放置8-12min以确保乙醇完全挥发干净； 7)在吸附柱中吸附膜的中央加入30μ L灭菌的双蒸水进行洗脱，双蒸水65°C预热，室温或37°C的水浴静置Imin以上； 8)转速1000rpm的条件下离心Imin,此1.5mL离心管中的液体即为回收的DNA片段，用浓度为I %的琼脂糖凝胶电泳检测纯化产物的纯度和产量，于4°C条件下保存备用； 四、对纯化产物进行测序反应 纯化后的产物，用与PCR扩增时相同的引物进行测序反应，在普通PCR扩增仪上进行，1yL的反应体系包括:Big Dye Terminator (ABI) 2.5 μ L，正向或反向核基因Chil引物5pmol,纯化后的模板产物25-50ng,测序反应的条件如下: 首先95°C条件下预变性8秒，接着进行25个循环，包括95°C条件下变性15秒，50°C条件下退火15秒，60°C条件下延伸90秒，最后60°C条件下终延伸90秒，测序反应的产物保存在4 °C的冰箱内； 五、测序反应产物的进一步纯化 测序反应的产物按如下步骤进行纯化: 1)加入25μ L的醋酸钠，避光室温放置30min，在25°C、转速4000rpm的条件下离心30min ； 2)离心结束后立即倒扣离心,转速不超过500rpm； 3)加入35μL的75%乙醇，立即在25°C、转速4000rpm的条件下离心15min ； 4)离心结束后立即倒扣离心,转速不超过500rpm； 5)加入40μ L的75%乙醇，立即在25°C、转速4000rpm的条件下离心15min ； 6)离心结束后立即倒扣离心,转速不超过500rpm； 7)37°C的烘箱烘干半小时以上； 8)取出后加入1yL甲酰胺； 9)变性上机:95°C条件下变性5min，取出后快速放于冰上冷冻1min； 10)纯化产物保存于4°C的冰箱内，待上机收集数据； 六、纯化产物利用遗传分析仪进行数据收集；或者对于Chil基因扩增的PCR产物，利用遗传分析仪进行测序和数据的收集； 七、测序得到的原始序列峰图用Chromas软件打开，并对测序质量高的个体读取碱基数据信息；然后利用MEGA ver.6.0软件进行序列比对和校正；鉴定出刺柏属近缘物种小子圆柏(JM)、方枝圆柏(JS)和西藏圆柏(JT)Chil基因的序列: 小子圆柏#292-l-JM
CAATATTACGGCCGAGGGCCCATCCAGTTGTCATGGTAAGTCTGGGAAATTT
GATGGTTGTATTGGTTGTTTTTCCACTGTTAAATCATATACAAATACGCAACG
TTACTACACTGTGACGTCTCATGAATTTGCACGTGTTTGGTATTATGCAGGA
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ACCCTTTGGTTTTGCCCTAGAAAATCCCCAATTCATCCAGACCGTGGTGTG
AAAGGCCTTAATGTGAGTGTTAATAATGTTTGTTTGTGTGAGTTTTGGTGTT
TTCTATACGTATATATACATATGAGATATGCTAATAATATTATGTAGTAAATTTC
AATA ； 八、分析和比对序列之间的差异程度，进行刺柏属小子圆柏(JM)、方枝圆柏(JS)和西藏圆柏(JT)的物种鉴定； 由序列比对和分析可以看出，刺柏属三个近缘物种在Chil基因序列上存在明显的遗传差异，相互之间能够区分，方枝圆柏(JS)的两个个体270-1-JS和061-4-JS在核苷酸110bp、290bp和476bp位置处存在着特有的基因变异位点；小子圆柏(JM)的两个个体292-1-JM和292-2-JM在28bp、120bp、189bp和449bp位置处存在着特有的变异位点；而西藏圆柏(JT)的两个个体183-1-JT和222-2-JT在165bp、281bp、197bp和281bp处存在特有的基因变异，这些特有的基因变异位点使得三个刺柏属物种之间能够准确区分； 利用MEGA ver.6.0软件基于距离法进行系统进化树的构建，由系统进化关系树可得知，每个刺柏属物种的个体能够单独聚到一个独立的遗传分支上，对应于该物种本身，使得这些物种之间能够准确区分。
2.根据权利要求1所述的一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，其特征在于，所述的2XCTAB溶液为十六烷基三甲基溴化铵溶液，其成分为:100mmol/L Tris-HCl PH8.0，1.4mol/LNaCl,20mmol/L 乙二胺四乙酸二钠和 2% CTAB。
3.根据权利要求1所述的一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，其特征在于，所述的氯仿-异戊醇溶液的体积比为24:1。
4.根据权利要求1所述的一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，其特征在于，所述的无水乙醇需预先在_20°C冰箱预冷2小时以上。
5.根据权利要求1所述的一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，其特征在于，所述的双蒸水的PH大于7.0。
6.根据权利要求1所述的一种快速鉴别刺柏属近缘物种的分子方法，其特征在于，所述的核基因Chil引物的序列为，正向:GGCGGCGGAGATTACTGTA，反向:TAGAAGACGCGCATTTGAGAA。
【文档编号】C12Q1/68GK104263846SQ201410577132
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】李忠虎, 房敏峰, 岳明, 刘文哲, 刘占林, 赵鹏, 赵桂仿 申请人:西北大学