一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌双重pcr检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌双重PCR检测方法，包括样品处理、核酸提取、PCR扩增和PCR产物检测，该方法能检测染色体上的毒力基因，同时可以检测致病性质粒，具有特异性强、操作简单快速、灵敏度高等优点，避免单重PCR检测带来的漏检结果及传统致病性检测的缺陷。
【专利说明】-种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌双重PCR检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全检测【技术领域】，具体涉及一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌 双重PCR检测方法。
【背景技术】
[0002] 小肠结肠炎是一种重要的食源性致病菌，导致人类的急性胃肠、菌血症等疾病。在 欧洲，小肠结肠炎耶尔森氏菌病是仅次于沙门氏菌和弯曲杆菌病的第三大肠道感染疾病。 小肠结肠炎耶尔森氏菌有致病性和非治病性之分，致病性菌株的毒力因子包括染色体上毒 力基因和致病性的质粒，而非致病菌菌株不含有毒力基因或者毒力质粒。目前，传统鉴定该 菌致病力的方法有自凝试验、刚果红试验、37°C下钙依赖的生长等，但这些方法均耗时、特 异性差、不稳定，应用非常有限。现有的PCR方法大都是基于单个毒力基因建立的单重PCR 方法，缺乏对染色体和致病性质粒的整体考虑，容易出现食品检验中致病性小肠结肠炎耶 尔森氏菌的漏检等，导致疾病的发生与传播。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌双重PCR检测方法，本方 法选取的基因即包括位于染色体上的ail基因，又包括位于质粒上的VirF基因，达到对致 病菌菌株的快速检测，克服了传统致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌操作繁琐、不稳定、特异性 差等缺点，同时也避免了基于单个毒力基因造成的毒力菌株漏检的情况。
[0004] 本发明所采用的技术方案是，一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌双重PCR检测方 法，包括以下步骤：
[0005] 1)样品处理：将分离的小肠结肠炎耶尔森氏菌接种于灭菌的新鲜大豆胰蛋白胨 肉汤中，25-28°C培养过夜培养，并将培养得到的菌液稀释至6. 5X109-6. 5X10°cfu/mL ;
[0006] 2)核酸提取：将稀释后的菌液采用基因组DNA试剂盒和质粒提取试剂盒提取致病 菌基因组DNA和质粒DNA，保存于-30°C备用；
[0007] 3) PCR 扩增：
[0008] 将致病菌基因组DNA和质粒DNA加入到PCR反应体系中并通过双重PCR扩增程序 对致病菌基因组DNA和质粒DNA模板进行PCR扩增；
[0009] 4) PCR产物检测：取5 μ L-8 μ L PCR扩增产物，点样于含有Gold view染料的预先 放入含有TAE缓冲液的水平电泳槽的琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳完成后，将凝胶取出放 置凝胶成像系统中进行拍照，观察和分析扩增检测结果。
[0010] 本发明的特点还在于，
[0011] 步骤3)中PCR扩增体系为：原浓度为IOyM的体积为0.5-1.OyL的引物， 200-250yMdNTP，Taq DNApolymerase2-5U，10XbufTer2.5yL，l-5ng DNA 模版，加双蒸水 补充至25 μ L ;其中，引物包括ail基因引物和核苷酸序列VirF基因引物，ail基因的核苷 酸序列如SEQ ID NO. 1所示；virF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述ail基因 引物为 F:5，-taatgtgtacgctgcgag-3，，R:5，-gacgtcttacttgcactg-3，；所述 virF 基因引 物为 F:5' -ggcagaacagcagtcagacata-S'，R:5' -ggtgagcatagagaatacgtcg-S，。
[0012] 双重PCR扩增程序参数：95°C预变性2. Omin ;94°C变性I. 0min，56-58°C退火45s， 72°C延伸45s-60s，35个循环；最后72°C延伸7. Omin结束体外扩展反应。
[0013] 电泳条件为100mA，200V，电泳时间为30分钟。
[0014] 凝胶取出放置凝胶成像系统中进行拍照，观察和分析扩增检测结果，结果具体为： 若在351bp或者561bp处出现条带，则分别为ail或virF阳性，说明待测样品中含有致病 性小肠结肠炎耶尔森氏菌；否则为阴性，说明待测样品中不含有致病性小肠结肠炎耶尔森 氏国。
[0015] 本发明的有益效果是：本发明建立一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速检测 方法。该方法能检测染色体上的毒力基因，同时可以检测致病性质粒，具有特异性强、操作 简单快速、灵敏度高等优点，避免单重PCR检测带来的漏检结果及传统致病性检测的缺陷。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测图，其中，M为DL2000marker ;Lanel-6 为含有双重毒力基因的致病性菌株；Lanel' -6'为只含染色体毒力基因的致病性菌株；P为 阳性对照；N为阴性对照；
[0017] 图2是模拟样品中致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌双重PCR灵敏度检测结果， 其中，M:DL2000，Lanel-6 分另Ij 为 6.5X106cfu/mL，6.5X105cfu/mL，6.5X104cfu/mL， 6. 5 X 103cfu/mL，6. 5 X 102cfu/mL，6. 5 X IO1CfuAiL, 6. 5 X 10Qcfu/mL。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0019] 实施例1致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌双重PCR检测体系的建立
[0020] 1.基因组和质粒DNA的提取：将通过GB/T4789. 8-2008方法分离的小肠结肠炎耶 尔森氏菌接种于灭菌的新鲜大豆胰蛋白胨肉汤中，25-28°C培养过夜培养,取Iml菌液或者 不同稀释度的菌液（6. 5X109-6. 5X10°cfu/mL)采用广州美基生物有限公司基因组DNA提 取试剂盒和质粒提取试剂盒分别提取致病菌基因组DNA和质粒DNA，保存于-30°C备用；
[0021] 2.双重PCR扩增程序：
[0022] PCR体系（25 μ L) :0· 5-1. 0 μ L引物（引物原浓度为10 μ M)，包括ail基 因（其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1)引物和virF基因（其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2)引物，其中，ail基因引物：F:5' -taatgtgtacgctgcgag-3'（其核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 3)，R:5' -gacgtcttacttgcactg-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 4); virF 基因引物：F: 5 ' -ggcagaacagcagtcagacata-3 '（其核昔酸序列如 SEQ ID NO. 5)， R: 5, -ggtgagcatagagaatacgtcg-3，（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 6)，200-250 μ M 的 dNTP， 2-5U的Taq DNA聚合酶，2. 5 μ L的10 X buffer，l-5ng的DNA模版，加双蒸水补充至25 μ L。
[0023] 其中，ail基因的核苷酸序列为：5'_atgaaaaagacattactagctagttctctaatagcct g tttatcaattgcgtctgttaatgtgtacgctgcgagtgaaagtagtatttctattggttatgcgcaaagccatgtaa aag aaaatgggtatacattggataatgaccctaaaggttttaacctgaagtaccgttatgaactcgatgataactg gggagt aataggttcgtttgcttatactcatcagggatatgatttcttctatggcagtaataagtttggtcatggt gatgttgattacta ttcagtaacaatggggccatctttccgcatcaacgaatatgttagcctttatggattactgg gggccgctcatggaaag gttaaggcatctgtatttgatgaatcaatcagtgcaagtaagacgtcaatggcatacgg ggcaggggtgcaattcaa cccacttccaaattttgtcattgacgcttcatatgaatactccaaactcgatagcata aaagttggcacctggatgcttgg tgcagggtatcgattctaa_3,;
[0024] virF基因的核苷酸序列为：
[0025] -atggcatcactagagattattaaattagaatgggccacacctatatttaaggttgttgagcattca caagatg gcctatatattcttttgcaaggtcagatttcatggcagaacagcagtcagacatatgatttagatgaggg gaatatgct gtttttgcgtcgtggcagctatgctgttcgatgtggtacaaaagaaccctgccaattactttggatt ccattaccaggca gttttttgagtacttttttacatcggtttggttctttgcttagtgaaattagacgagacaatg ccacacccaagccattgtta atttttaatatttcaccaatattatcacaatccattcaaaatctatgtgccatatt ggaacggagtgattttccgtcagtatta acgcaactgcgtattgaggaattattgcttttgcttgcctttagctcg caaggggctttattcctctcggctctgcgccatt taggcaaccgcccagaagaacggttgcagaaatttatggagg aaaattatctacaagggtggaaactaagcaaattt gcgcgagaattcggcatgggattaaccacattcaaagaact gtttggtacagtttatggcatttcaccacgcgcctgg ataagcgagcgacgtattctctatgctcaccaattactt cttaatggtaagatgagtattgttgatattgccatggaagc agggttctcgagtcagtcttatttcactcaaagtt atcgacgtcgcttcggatgcactcccagccaagcccgtcttacta aaatagcaaccacaggctaa-3,；
[0026] 其中，划横线且斜体部分为引物结合位点。
[0027] 双重PCR扩增参数：95°C预变性2. Omin，35个循环（94°C变性I. Omin，56-58°C退 火458,721：延伸458-608)，最后721：延伸7.01^11结束体外扩展反应。取5以1^-8以1^?〇? 扩增产物，点样于含有Gold view染料的琼脂糖凝胶中（预先放入含有TAE缓冲液的水平电 泳槽）进行电泳（100mA，200V)，30分钟后停止电泳，将凝胶取出放置凝胶成像仪进行检测 和拍照。若在351bp或者561bp处出现条带，则分别为ail或virF阳性，说明待测样品中 含有致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌；否则为阴性，说明待测样品中不含有致病性小肠结肠 炎耶尔森氏菌。扩增检测结果如图1所示，该双重PCR体系能扩增出致病性小肠结肠炎耶 尔森氏菌的染色体上的ail和质粒上virF基因，体系具有稳定性高、特异性强等优点。同 时该双重PCR方法能同时检测出致病菌两个毒力基因（ail基因或virF基因），清晰了解该 致病菌的毒力分布特点，避免了单重PCR检测技术带来的致病菌漏检等结果。
[0028] 实施例2致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌双重PCR灵敏度检测的应用试验
[0029] 将1克酸奶（致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌阴性）加入到8ml无菌水中，再将不同 稀释度（6. 5 X 106cfu/mL，6. 5 X 105cfu/mL，6. 5 X 104cfu/mL，6. 5 X 103cfu/mL，6. 5 X IO2Cfu/ mL，6. 5 X lOkfu/mL，6. 5 X 10°cfu/mL)的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌液。无菌操作移 取I. Oml菌液分别采用基因组提取试剂盒和质粒提取试剂盒提取致病菌的基因组和质粒 DNA。
[0030] PCR 体系（25μ L) :1· Ομ L 引物（引物原浓度 ΙΟμΜ) (ail 基因：F:5'-taatgtgtacg ctgcgag-3,，R:,-gacgtcttacttgcactg-3 ,;virF^?:F:5,-ggcagaacagcagtcagacata_3,, R :5，-ggtgagcatagagaatacgtcg-3，），200_250μΜ dNTP，Ta q DNA polymerase 4U，IOX 缓冲液2. 5 μ L，5ng DNA模版，加双蒸水补充至25 μ L。
[0031] 双重PCR扩增参数：95°C预变性2. 0min，35个循环（94°C变性I. 0min，56°C退火 45s，72°C延伸60s)，最后72°C延伸7. Omin结束体外扩展反应。取5yL-8yL PCR扩增产 物，点样于含有Gold view染料的琼脂糖凝胶中（预先放入含有TAE缓冲液的水平电泳槽） 进行电泳（100mA，200V)，30分钟后停止电泳，将凝胶取出放置凝胶成像系统中进行检测和 拍照，结果如图2所示。该双重PCR检测人工污染的模拟样品中致病性小肠结肠炎耶尔森 氏菌灵敏度达10 2cfu/mL，表明该方法具有很高的特异性和稳定性，能克服传统检测致病菌 稳定性不高、操作繁琐、耗时长等缺点。
[0032]
【权利要求】
1. 一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌双重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 样品处理：将分离的小肠结肠炎耶尔森氏菌接种于灭菌的新鲜大豆胰蛋白胨肉汤 中，25-28°C培养过夜培养，并将培养得到的菌液稀释至6. 5X 109-6. 5X 10°cfu/mL ; 2) 核酸提取：将稀释后的菌液采用基因组DNA试剂盒和质粒提取试剂盒提取致病菌基 因组DNA和质粒DNA，保存于-30°C备用； 3. PCR扩增： 将致病菌基因组DNA和质粒DNA加入到PCR反应体系中并通过双重PCR扩增程序对致 病菌基因组DNA和质粒DNA模板进行PCR扩增； 4. PCR产物检测：取5iiL-8iiL PCR扩增产物，点样于含有Gold view染料的预先放入 含有TAE缓冲液的水平电泳槽的琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳完成后，将凝胶取出放置凝 胶成像系统中进行拍照，观察和分析扩增检测结果。
2. 根据权利要求1所述的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌双重PCR检测方法，其特 征在于，所述步骤3)中PCR扩增体系为：原浓度为10 yM的体积为0.5-1. Oil L的引物， 200-250 u MdNTP，Taq DNA polymerase 2-5U，10 X buffer 2.5 uL，l-5ng DNA 模版，加双蒸 水补充至25 y L ;其中，引物包括ail基因引物和核苷酸序列virF基因引物，ail基因的核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；virF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述ail基 因引物为 F:5，-taatgtgtacgctgcgag-3，，R:5，-gacgtcttacttgcactg-3，；所述 virF 基因 弓I物为 F:5，-ggcagaacagcagtcagacata-3，，R:5，-ggtgagcatagagaatacgtcg-3，。
3. 根据权利要求1所述的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌双重PCR检测方法，其特征在 于，所述双重PCR扩增程序参数：95°C预变性2. Omin ;94°C变性1. 0min，56-58°C退火45s， 72°C延伸45s-60s，35个循环；最后72°C延伸7. Omin结束体外扩展反应。
4. 根据权利要求1所述的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌双重PCR检测方法，其特征在 于，所述电泳条件为l〇〇mA，200V，电泳时间为30分钟。
5. 根据权利要求1所述的致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌双重PCR检测方法，其特征在 于，所述凝胶取出放置凝胶成像系统中进行拍照，观察和分析扩增检测结果，结果具体为： 若在351bp或者561bp处出现条带，则分别为ail或virF阳性，说明待测样品中含有致病 性小肠结肠炎耶尔森氏菌；否则为阴性，说明待测样品中不含有致病性小肠结肠炎耶尔森 氏国。
【文档编号】C12Q1/04GK104388574SQ201410751927
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】叶应旺, 韩永佳, 焦芮, 高吉娜 申请人:合肥工业大学