本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸的应用。
背景技术：
瘤胃甲烷生成不仅导致5～7％的反刍动物饲料能量损失，还是温室气体的重要来源，羊每年平均产10～16kg甲烷，牛平均为60～160kg。因此，对反刍动物甲烷抑制剂的研究应用，不仅能提高动物的能量利用效率和生产性能，还具有良好的生态效益。虽然已有各种各样的饲料添加剂(如天然植物提取物、离子载体、多卤素化合物、电子受体、油脂等)被研究开发，但均存在不同的问题，如长效性、安全性和微生物耐受性等问题。这些缺陷限制了已有添加剂的广泛应用。硝酸盐是近年来研究较多的，也是较有应用前景的瘤胃甲烷抑制剂，但其在瘤胃中代谢的中间产物亚硝酸盐，能够经瘤胃壁进入血液引起高铁血红蛋白血症，危害动物健康。虽然安全应用硝酸盐的研究已经开展，但仍有较长一段路要走。因此，一种新的，高效的反刍动物甲烷抑制剂是社会所亟需的。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸在制备甲烷菌抑制剂中的应用，已解决现有技术存在的长效性、安全性和微生物耐受性不足等问题。
本发明还要解决的技术问题是提供2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸作为动物饲料添加剂的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸在制备甲烷菌抑制剂中的应用。
2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸的结构式如下：
其中，所述的甲烷菌为瘤胃甲烷菌。
其中，所述的甲烷菌抑制剂为反刍动物甲烷菌抑制剂。
2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸作为动物饲料添加剂的应用也在本发明的保护范围之内。
其中，所述的动物为反刍动物。
其中，所述的应用是指2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸作为动物饲料添加剂在抑制动物瘤胃甲烷中的应用。
有益效果：
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸能够通过自身的硝酸酯官能团(-O-NO2)氧化甲烷菌甲基辅酶M还原酶的镍(+1)活性中心。甲基辅酶M还原酶是甲烷菌甲烷生成途径中的关键酶，它的失活将阻断甲烷生成。试验证明这类化合物具有长期抑制瘤胃甲烷生成的能力。与目前研究较广的瘤胃甲烷抑制剂硝酸盐相比，其安全性更高。因为2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸在瘤胃代谢过程中，不易导致亚硝酸盐过量积累。在实施的体外实验和动物体内实验中均未检出亚硝酸盐离子过量累积。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
1材料方法
1.1实验材料
1.1.1试验动物及瘤胃液采集
试验动物为4头装有永久性瘤胃瘘管的湖羊。饲喂苜蓿干草，自由饮水。每天08:00和16:00分两次饲喂。试验当天，在晨饲前半小时取瘤胃液，从4头瘘管羊取得新鲜瘤胃液迅速装入预先通入二氧化碳的保温瓶带回实验室。
1.1.2人工瘤胃发酵液制备
发酵液的配制参照Menke和Steingass(1988)的方法。将采集的新鲜瘤胃液用4层纱布过滤，量取1250mL的瘤胃液迅速倒入已准备好的3750mL的人工缓冲液中，瘤胃液与缓冲液按1:3(v/v)的比例混合，制成混合人工瘤胃培养液。将混合后的发酵液分装到180mL发酵瓶中，整个过程的温度保持在39℃，持续通入纯二氧化碳以保持厌氧环境(以刃天青变成无色来判断)，用磁力搅拌器搅拌以保持瘤胃液与缓冲液混合均匀。发酵瓶中预先添加0.5g粉碎苜蓿干草和0.5g玉米粉以及不同剂量的甲烷菌抑制剂置于39℃的恒温培养箱中预热30min。然后向发酵瓶中通入二氧化碳以保证发酵瓶中为厌氧环境。分装完毕后，在恒温振荡器39℃，100r/min条件下培养24小时。
1.1.3甲烷菌抑制剂
2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸
1.2试验方法
1.2.1试验设计
实施例1：试验设3个组，对照组(不添加任何药物)，2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸组1(330μm/L)和2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸组2(660μm/L)。
1.2.2化学分析
发酵结束时，立即测定总产气量，H2和CH4和pH。取2mL发酵液，13 000r/min和4℃条件下离心10min取1.5mL上清液，加入0.2mL 25％偏磷酸固定，静置15min后，-20℃保存，后续用于挥发性脂肪酸的测定。
总产气量的测定参照Theodorou等(1994)的方法,用气压转换仪测定发酵瓶内产气量。
H2和CH4使用安捷伦7890B气相色谱仪测定。汽化室温度：200℃；色谱柱(Porapak Q packing&MolSieve 5A packing，Agilent)，柱温80℃；TCD检测器：200℃；载气为N2。
挥发性脂肪酸参照Pontes等[13]方法检测。采用安捷伦7890B气相色谱仪。汽化室220℃；色谱柱为FUSED SILICA毛细管柱(Supelco)，柱温40℃，4min；40-110(40℃/min)；110℃，2min；110-150(40℃/min)；150℃,5min梯度升温。氢离子火焰检测器FID：250℃。载气为氮气。样品经偏磷酸酸化，内标为巴豆酸。
乳酸参照Barker&Summerson(1941)方法测定。
干物质消失率参照朱伟云等(2001)方法测定。
1.2.3微生物浓度测定
微生物浓度定量分析采用Premix Ex TagTM(TaKaRa)试剂，Applied Biosystems 7300Real-Time PCR System。利用含有目的基因片段的质粒制备标准曲线，计算目的基因在样品中的浓度。本文中使用的PCR引物如下所列。
1.3数据统计处理
数据采用SPSS 20.0软件中的One-way ANOVA(Tukey)进行分析，置信区间为95％。实施例1 2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸抑制瘤胃体外发酵甲烷菌生成试验
由表1可见，与对照组(未添加组)相比，添加330μmol/L的2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸能够减少92％的甲烷生成量。对短链脂肪酸的检测显示(表2)，添加抑制剂尽管降低了乙酸的生成量，但没有显著影响总短链脂肪酸的生成量。乙酸和丙酸比值显著降低。
表1瘤胃体外发酵24小时气体产生量
表2瘤胃体外发酵24小时短链脂肪酸的生成量
由表3所示，添加330μmol/L的2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸显著降低了甲烷菌数量，但没有显著影响瘤胃厌氧真菌、原虫和细菌的数量。在瘤胃中，细菌和原虫是降解饲料的主要菌群，而厌氧真菌是首先定殖到植物片段的菌群之一，他们在瘤胃植物细胞壁降解过程中起着重要作用。试验结果表明2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸对甲烷菌的抑制具有专一性。
添加660μmol/L的2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸，完全抑制甲烷生成。没有影响细菌和原虫的数量，但显著降低瘤胃厌氧真菌的数量。乙酸产量和乙酸与丙酸比显著下降，丙酸、丁酸和总短链脂肪酸没有显著变化。
表3添加2,2双甲基-3-(硝基氧基)丙酸对瘤胃甲烷菌、细菌、真菌和原虫的影响