一种具有降压抗凝血功能的海参卵发酵产物的制备方法与流程

本发明涉及海参食品加工
技术领域：
，尤其涉及一种具有降压抗凝血功能的海参卵发酵产物的制备方法。
背景技术：
：随着人们生活水平的不断提高，平均寿命不断延长，社会逐渐步入老龄化，心脑血管疾病患病趋势呈现逐年增加。《中国心血管报告2015》指出，2014年，中国心血管病死亡率仍居疾病死亡构成的首位，高于肿瘤及其他疾病。其中，农村心血管病死亡率从2009年起超过并持续高于城市水平。心血管病占居民疾病死亡构成在农村为44.60％，在城市为42.51％。全国每5个死亡人中，就有2个是死于心脑血管病，而脑血管病在中国则成为首位死因。高血压是一种以动脉收缩压或舒张压升高为特征的临床综合症，是引发心、脑、肾和血管等各种并发症和导致中风、动脉硬化、冠心病的一个重要危险因子。世界各国平均患病率在10～12％，且人群分布广。因此，研究心血管药物，治疗和防治心血管疾病是当今社会关注的一个热门课题。目前降压药物有很多种，其中血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)是应用最普遍的，也是当前被认为最安全、最适合于老年人抗高血压药物之一。但多数ACEI为化学合成类药物，在临床应用时，存在不同程度的副作用。于是，寻找疗效高、副作用小的天然来源的ACEI，尤其是血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽，是全世界关注的焦点。海参卵是海参生殖腺的一种，是海参加工过程中的副产物。海参卵营养成分丰富，可直接食用，具有改善视力、抗衰老、增强体质、预防癌症等生理功效。近年来，国内学者对海参卵进行系统性研究，通过酶解、发酵等方式获得了具有特殊生理功能的活性物质，如类胡萝卜素和抗氧化肽等。纳豆菌(Bacillusnatto)属细菌科，芽孢杆菌属，最早分离自传统发酵豆制品——纳豆，是制备发酵产物常用的一种有益菌，可产生多种酶系。1987年，Sumi等人从纳豆中提取具有显著溶栓作用的纳豆激酶(nattokinase，NK)，促进了国内外学者对纳豆芽孢杆菌及其发酵产物的研究。研究显示，纳豆发酵产物具有纤溶、降胆固醇、降血脂、抗菌和抗氧化等多种营养保健功能。技术实现要素：本发明的目的在于拓宽海参原料的应用，充分利用海参加工副产物——海参卵资源，开发一种兼具降压和抗凝血功能的海参卵发酵产品提升海参卵食品的功能性及附加值。为达到上述目的，本发明提供了一种具有降压抗凝血功能海参卵发酵产物的制备方法，包括如下步骤：S1、原料预处理：取海参卵清洗、去杂质，-80℃预冻4～5h，-50℃冻干40～50h，粉碎，得到海参卵冻干粉，备用；S2、制作基础培养基：将步骤S1制得的海参卵冻干粉与水按质量体积比1:10～50(g/mL)混合，制得混合液；按比例加入葡萄糖，所述葡萄糖与所述混合液的质量体积比为1～7:100(g/mL)，加入盐酸或氢氧化钠调节初始pH至6～10，制得海参卵基础培养基；S3、灭菌：将步骤S2制得的海参卵基础培养基，121℃灭菌20min，得到灭菌培养基；S4、接种发酵：待步骤S3制得的灭菌培养基温度降低至40～50℃时，加入所述灭菌培养基体积2～9％的纳豆菌菌悬液，所得灭菌培养基中纳豆菌的终浓度为107CFU/mL，充分混匀后，在31～43℃、通风，摇床转速140～300r/min下培养32～40h，获得海参卵发酵液；S5、分离产物：将步骤S4制得的海参卵发酵液在7000r/min下离心20分钟，收集上清液；将所述上清液浓缩、冻干，得到具有降压抗凝血功能海参卵发酵产物冻干粉。优选方式下，步骤S1所述海参卵冻干粉备用期间冻存于-20℃；以防氧化和变质。优选方式下，步骤S2所述海参卵冻干粉与水的质量体积比为1:30(g/mL)。优选方式下，步骤S2所述葡萄糖的添加量为2:100(g/mL)。优选方式下，步骤S2采用NaOH调节pH至7.2。优选方式下，步骤S2所述加入盐酸或氢氧化钠调节初始pH值为设计值+0.2。在步骤S3灭菌过程中，培养基的pH值会下降0.2，所以在调初始pH的时候，调整到设计值+0.2。优选方式下，步骤S4为：待步骤S3制得的灭菌发酵混合物冷却到40～50℃后，加入所述灭菌培养基体积5％的纳豆菌菌悬液，所得灭菌培养基中纳豆菌的终浓度为107CFU/mL；在37℃通风条件下，在转速为180r/min的摇床中培养36h，获得海参卵发酵液。优选方式下，步骤S5浓缩处理具体为：将所述上清液浓缩至原体积的1/5。浓缩处理可以有效缩短冻干时间。优选方式下，步骤S5所述冻干的具体操作为：-20℃预冻6～8h，-50℃冻干24～40h。采用上述方案后，本发明与已有技术相比具有以下优点：1、本发明先将含有海参卵原料的培养基经过高压(121℃，20min)处理，提高海参卵原料对纳豆菌发酵过程中所分泌蛋白酶的敏感度，使海参卵更易被水解，提高发酵后样品中的多肽含量，并杀灭致病菌和腐败菌，保证产物安全性。通过TCA结合Folin-酚的方法测定样品中多肽含量发现，发酵0h的样品中多肽含量为0.25mg/mL，发酵36h后样品中多肽含量为4.3mg/mL；通过Folin-酚测定可溶性蛋白的结果发现，0h海参卵样品由于高温高压，溶出部分蛋白，蛋白含量为3.5mg/mL，发酵36h后样品中的蛋白含量为11mg/mL；从Tricine-SDS-PAGE小分子电泳结果可知，经发酵后，海参卵中大分子蛋白被充分降解，发酵产物中富含小分子蛋白和多肽，其分子量均低于26Kd，且大多数发酵产物接近1Kd，发酵产物蛋白回收率约为50％。2、海参卵原料未发酵样品的凝血酶时间(TT)为21.95s，凝血酶原时间(PT)为13.6s，活化部分凝血活酶时间(APTT)为56.65s；本发明方法制得的海参卵发酵产物的APTT为69.5s，PT为15.95s，TT为22.4s；本发明方法制得的海参卵发酵产物的凝血时间明显延长，本发明方法制得的海参卵发酵产物具有较强的抗凝血活性。3、海参卵样品为开始发酵时，几乎无ACE抑制活性，ACE抑制率为7.8％，本发明方法制得的海参卵发酵产物的ACE抑制活性显著提高，ACE抑制率可达为90％。4、本发明方法制得的海参卵发酵产物中富含具有降压抗凝血功能的多肽，对高血压症、高血粘症及血栓性疾病具有潜在的辅助治疗作用；同时，本发明制得的发酵产物中含有多种蛋白酶，对于消化酶分泌不足的人群能促进其胃肠道食物的充分消化吸收；本发明方法制得的海参卵发酵产物可应用于饮品、保健品、营养添加剂及医药开发等方面。综上，与直接食用海参卵相比，本发明将海参卵经纳豆菌发酵，不但可产生具有溶解血栓作用的溶纤酶，还产生利于消化吸收、具有抗凝血及降压功能的多肽。海参卵发酵产物，不但可以作为食品直接使用，还可进一步经过浓缩、分离等开发成为保健功能产品。因此，本发明丰富了海参卵的应用方式并增强了其生物活性及开发价值。附图说明图1是海参卵发酵过程TCA可溶性寡肽含量的变化；图2是海参卵发酵过程可溶性蛋白含量的变化；图3是海参卵发酵产物的明胶酶谱谱图；图4是豆粉和海参卵发酵产物的Tricine-SDS-PAGE谱图；图5是豆粉和海参卵发酵产物的抗凝血活性。具体实施方式本发明提供了一种具有降压抗凝血功能的海参卵发酵产物的制备方法，以海参卵为原料，通过纳豆菌发酵，根据发酵产物的ACE抑制活性和抗凝血活性优化发酵条件，得到最优发酵产物。终止发酵，对发酵产物进行离心、过滤、浓缩、冻干，制备降压抗凝血海参卵发酵产物。以下实施例中采用的海参卵冻干粉通过下述方法制得：将海参卵洗净、去除表面粘连的杂质，沥干，在-80℃进行预冻，根据预冻的海参卵的质量和体积设定预冻时间4～5h，然后采用真空冷冻浓缩设备(冻干机)进行冷冻浓缩，先对冻干机进行预冷，约30分钟后，冻干机温度稳定在-50℃后，放入处理好的海参卵样品，打开真空泵，压力迅速下降到10pa之下，冻干机稳定运行40～50h，将海参卵样品全部冻干。将冻干后的海参卵打粉，放入-20℃冰箱备用。本发明实施例及对比例采用下述方法进行表征：测试1：TCA可溶性寡肽含量的测定方法如下：发酵样品100μL加入100μL浓度为20％三氯乙酸(TCA)，震荡混匀，静置20min，16500g/min下离心15min，取上清进行稀释，取稀释后的待测样品100μL，利用Folin-酚的方法测定TCA可溶性寡肽含量，加入Folin-酚甲液500μL，室温反应10min，加入Folin-酚乙液100μL，30℃反应30min，500nm测吸光度，根据标准曲线确定可溶性寡肽含量。标准曲线绘制如下：用结晶牛血清蛋白，根据其纯度配制成0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL，依次加入500μlFolin-酚甲液，混匀。室温下放置10min，再加入50μlFolin-酚乙液，立即振荡均匀，室温下放置30min。然后，在500nm波长下，用酶标仪测定光密度值。以牛血清蛋白浓度为横坐标，吸光值(500nm)为纵坐标，绘制标准曲线。测试2：可溶性蛋白含量的测定方法如下：取稀释后的待测样品100μL，加入Folin－酚甲液500μL，室温反应10min，加入Folin-酚乙液100μL，30℃反应30min，500nm测吸光度，根据标准曲线确定可溶性蛋白含量。标准曲线绘制同测试1。测试3：ACE抑制活性的测定方法如下：ACE抑制活性空白组：于1.5mL离心管中，取25μL超纯水，加入25μL的ACE(酶活力为0.047U/mL)，漩涡震荡2min，37℃孵育5min。加入50μL，5mmol/L底物马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)，37℃，反应1h。然后加入20μL，0.2MHCl终止反应。反应液过孔径为0.45μm的膜后，用HPLC(Waters)检测马尿酸(HA)生成量。ACE抑制活性样品组：于1.5mL离心管中，取25μL上述发酵液(蛋白含量20mg/mL)，加入25μL的ACE(酶活力为0.047U/mL)，漩涡震荡2min，37℃5min。加入50μL，5mmol/L底物HHL，37℃反应1h。然后加入20μL，0.2MHCl终止反应。反应液过孔径为0.45μm的膜后，用HPLC(Waters)检测HA生成量。ACE抑制率＝(A-B)/A*100％；(其中A:加入发酵样品组中HA的峰面积；B:空白组中HA的峰面积)。测试4：抗凝血活性测定方法如下：抗凝血活性测定：将30份来自健康人体检的血液，加入3.8％枸橼酸钠作为抗凝剂，混合均匀，以3000r/min离心15min，收集血浆。将待测血浆加入试管，每管0.9mL，加入发酵产物0.1mL。按试剂盒说明书操作，测定TT、PT及APTT。TT、PT、APTT是检测凝血功能的常见指标：TT是反应凝血酶活性和纤维蛋白原含量的指标，正常范围14.0～21.0s；PT主要反应外源性凝血途径的功能，正常范围9.5～15.5s；APTT主要反应内源性凝血途径有关因子的活性，正常范围23.0～43.0s。实施例1取海参卵冻干粉1.49g，加入30mL去离子水，加入0.6g葡萄糖，用NaOH调整培养基pH到7.2(设计值为7)，将培养基封口，置于121℃灭菌20分钟，待灭菌结束后，取出灭菌培养基。待灭菌培养基温度在40～50℃时，加入0.9mL纳豆菌菌悬液，使培养基菌浓度最终达到107CFU/mL，将纳豆菌菌悬液与灭菌培养基充分混合后，置于37℃，180r/min的摇床中，通风培养0～72h。每隔12h取发酵液一次，采用TCA可溶性寡肽含量的测定方法测定本实施例发酵过程中，发酵产物中TCA可溶寡肽的含量，结果如图1所示。0h时，TCA可溶性寡肽含量很低，说明在0h时高温高压溶出的海参卵大分子蛋白和海参卵未溶出的大蛋白并未被纳豆菌分解；随着发酵时间的延长，TCA可溶性寡肽含量增加，说明纳豆菌在海参卵培养基中进行发酵，将培养基中的大分子蛋白降解为小分子蛋白或者肽，使发酵产物中TCA可溶性寡肽含量显著增加。在0～72h，每隔12h取一次发酵液，用Folin-酚方法测定样品中蛋白含量，结果如图2。在0h海参卵样品由于高温高压，溶出部分可溶性蛋白，其含量为3.5mg/mL，发酵36h后样品中的可溶性蛋白含量达到11mg/mL，之后变化不大。分别取上述发酵0h和36h的产物样品，经过7000r/min离心20min后，取上清液100μL，进行抗凝血活性测定，结果如表1。发酵36h后，TT、PT、APTT都有显著的延长，说明发酵过程可以促进某些抗凝血因子的形成，使得凝血时间延长，起到一定的抗凝血作用。表1海参卵发酵0h和36h抗凝血活性海参卵发酵0h样品海参卵发酵36h样品TT/s21.9522.4PT/s13.615.95APTT/s56.6569.5实施例2取海参卵冻干粉1.1g，加水30mL，加入葡萄糖0.4g，调整pH为7.2(设计值为7)，在121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却至40～50℃后，接入1.5mL纳豆菌菌悬液，终浓度为107CFU/mL，在37℃，180r/min条件下，通风培养36h。发酵液经过7000r/min离心20min，上清液体积约为30mL，经福林酚方法测定上清液蛋白含量约为20mg/mL，上清液经过浓缩、冻干制得海参卵发酵冻干粉约为0.6g。本实施例产物蛋白回收率大约54.5％，通过TCA可溶性寡肽含量测定方法测量得到的寡肽含量18mg/mL。明胶酶谱(活性电泳)显示，如图3所示，在发酵产物中，还存在多种蛋白酶，这些蛋白酶不但可以促进海参卵蛋白分解形成活性多肽，还可以补充部分消费者消化酶分泌不足，促进胃肠道食物的充分消化吸收。实施例3取海参卵冻干粉3.8g，加水40mL，加入葡萄糖1.2g，调整pH为7.2(设计值为7)，在121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后，接入2mL纳豆菌菌悬液，终浓度为107CFU/mL，在37℃，180r/min条件下，通风培养36h。发酵结束后经过7000r/min离心20min，取上清，上清液体积约为32mL，经测定蛋白含量约为23mg/mL，上清液经过浓缩、冻干制得海参卵发酵冻干粉约为0.736g。本实施例产物蛋白回收率为31％，通过TCA可溶性寡肽含量测定方法测量得到的寡肽含量20mg/mL。蛋白回收率＝发酵后蛋白含量/总蛋白*100％利用豆粉作为海参卵发酵产物抗凝血活性测的的对比例。经凯氏定氮测定豆粉中总蛋白含量约为39％(干基)，海参卵中总蛋白含量约为62％(干基)，结果显示，海参卵属于高蛋白、低脂肪的蛋白源，是制备生物活性蛋白和多肽的优良原料。对比例1取相同条件下冻干的豆粉1.8g，保证与实施例2添加到培养基中的总蛋白含量(0.68g)一致，在与实施例2相同的条件下发酵36h，发酵结束后经过7000r/min离心20min，取上清，上清液体积约为20mL，经测定蛋白含量约为33mg/mL，上清液经过浓缩、冻干制得大豆发酵冻干粉约为0.66g。本对比例产物蛋白回收率为28％。取实施例2及对比例1的发酵上清液分别进行ACE抑制活性的测定，结果显示，豆粉发酵产物的ACE抑制率为86.07％，海参卵发酵产物的抑制率为90.06％，说明海参卵是适宜生产ACE抑制多肽的原料，ACE抑制活性略高于豆粉。取实施例2及对比例1中海参卵和豆粉发酵36h后的上清液分别进行Tricine-SDS-PAGE小分子电泳，结果显示如图4，其中M代表超低分子量marker、第1条带代表豆粉发酵0h、第2条带代表豆粉发酵36h、第3条带代表海参卵发酵0h、第4条带代表海参卵发酵36h。发现在0h，豆粉和海参卵都以大分子蛋白存在，发酵36h后，海参卵的大分子蛋白均被降解，在26.6KD上方无大分子蛋白条带，在1～26KD之间有蛋白条带，说明发酵过程中大分子蛋白被降解成小分子蛋白和多肽，且海参卵与豆粉发酵样品产生了不同分子量分布的小分子蛋白，这种差异可能导致二者发酵产物生物活性不同的主要原因。对比例2采用添加到培养基中的总蛋白含量一致的方法，取相同条件下冻干的豆粉6g(总蛋白含量为2.36g)加水40mL，加入葡萄糖1.2g，调整pH为7.2(设计值为7)，在121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却后，接入2mL纳豆菌菌悬液，终浓度为107CFU/mL，在37℃，180r/min条件下，通风培养36h。发酵结束后经过7000r/min离心20min，取上清，上清液体积约为27mL，经测定蛋白含量约为31mg/mL，上清液经过浓缩、冻干制得大豆发酵冻干粉约为0.837g。本对比例产物蛋白回收率为35％。取实施例3及对比例2的发酵上清液100μL，分别测定其抗凝血活性。结果如图5所示，海参卵发酵产物比豆粉发酵产物具有更强的抗凝血活性，可对心脑血管疾病具有潜在的辅助治疗作用。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3