本发明涉及一种泥鳅饲料，具体涉及一种含有甲壳素酶的泥鳅生长饲料及其制备方法，属于泥鳅饲料技术领域。
背景技术：
泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)，隶属鲤形目、鳅科、花鳅亚科、泥鳅属，俗称钢鳅、鳅鱼、真泥鳅等。因为泥鳅肉质蛋白含量高、脂肪含量低、营养丰富、味道鲜美，深受广大东南亚国家消费者青睐。近年来，由于环境污染、过度捕捞等原因，泥鳅野生资源呈下降趋势，为了满足巨大的市场，泥鳅人工养殖规模逐年扩大。但是泥鳅配合饲料的研究却严重滞后于产业发展，成为泥鳅养殖业健康快速可持续性发展的制约因素之一，急需加强对泥鳅配合饲料的研究力度。
甲壳素酶(E.C.3.2.1.14)为第三代饲料酶制剂，可以随机切断甲壳素中的β-1,4糖苷键，降解甲壳素为水溶性的低聚糖(甲壳素聚糖)，进而消除其的抗营养作用，而且甲壳素聚糖具有特殊的生物学活性。目前，已有研究者将其应用与甲壳素含量较高的水产饲料中，以提高养殖动物对饲料的利用效率，如朱家勇等利用具有甲壳素酶降解活性的酵母菌添加于含有蝇蛆粉的鲫鱼(Musca domestica)饲料，可降低甲壳素的抗营养作用，进而提高鲫鱼的生长性能和非特异性免疫能力。再如Y zhang在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的饲料中添加甲壳素酶和虾粉(富含甲壳素)后，发现甲壳素酶作用于虾粉后斜带石斑鱼的生长性能和免疫能力得到显著提高。目前，甲壳素酶在泥鳅饲料中的应用研究还是空白。
鱼粉是一种广泛应用于水产饲料中的优质蛋白质源，因其产量降低、需求量加大，鱼粉的价格一直维持在较高水平，加大了养殖企业的饲养成本，限制了水产养殖业的发展。因此，为了降低饲料成本，提高养殖企业的经济效益，寻求一种优质、价格低廉和供应量大的动植物蛋白质源对鱼粉进行部分或全部替代，逐渐成为水产饲料的重要热门研究方向之一。
蝇蛆粉(maggot meal)因其蛋白含量高、营养全面、价格低廉，已有研究报告其可以部分替代饲料中的鱼粉。李贤等发现，蝇蛆粉可以替代泥鳅饲料中鱼粉的25-50％，但发现随着替代量的提高，泥鳅的生长性能逐渐下降，其认为是蝇蛆粉中含有较多的甲壳素，具有较高的抗营养作用，这与研究凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、鲫鱼、石斑鱼研究结果一致。本发明旨在为配制优质价廉的泥鳅生长饲料。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种含有甲壳素酶的泥鳅生长饲料，可降低饲料中甲壳素对泥鳅的抗营养作用，提高泥鳅对饲料的消化吸收率，提高其生长性能。本发明还提供了该泥鳅生长饲料的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用的一种含有甲壳素酶的泥鳅生长饲料，包括以下组份及含量，鱼粉14％，蝇蛆粉27％，豆粕25％，玉米蛋白粉5％，高筋粉22％，甜菜碱0.5％，氯化胆碱0.5％，大豆磷脂1％，鱼油0.5％，豆油2％，磷酸二氢钙1.5％，维生素C多聚磷酸酯0.2％，维生素混合物0.3％，矿物质混合物0.5％；
将上述各组份均匀混合组成基础饲料，以0.001-0.400％的甲壳素酶替代等量的基础饲料，即得泥鳅生长饲料。
作为改进，所述维生素混合物在每千克饲料中，包括硫胺素50mg，核黄素200mg，盐酸吡哆醇50mg，维生素B12 0.1mg，维生素K3 40mg，肌醇2000mg，泛酸400mg，烟酸750mg，叶酸15mg，生物素5mg，维生素A5000IU，维生素D 2000IU，维生素E 100mg，维生素C 320mg，次粉18.67g。
作为改进，所述矿物质混合物在每千克饲料中，包括四水硫酸锰40mg，六水氯化钴80mg，五水硫酸铜12mg，七水氯化铝15mg，碘酸钾5mg，七水硫酸亚铁1000mg，七水硫酸锌350mg，氯化钠5000mg，亚硒酸钠6mg。
作为改进，将以下含量的组份，鱼粉14％、蝇蛆粉27％、豆粕25％、玉米蛋白粉5％、高筋粉22％、甜菜碱0.5％、氯化胆碱0.5％、大豆磷脂1％、鱼油0.5％、豆油2％、磷酸二氢钙1.5％、维生素C多聚磷酸酯0.2％、维生素混合物0.3％和矿物质混合物0.5％，混合组成基础饲料，加入基础饲料总量0.100％的甲壳素酶替代等量的基础饲料，即得泥鳅生长饲料。
作为改进，所述甲壳素酶为饲料级粉状酶制剂，活性为20000U/g。
作为改进，所述蝇蛆粉中粗蛋白含量为53.00％，粗脂肪含量为13.5％，水分含量为8.2％，灰分含量为10.80％，钙含量为1.00％，总磷含量为1.12％，能量为20.9MJ/kg。
另外，本发明还提供了一种上述任一项所述含有甲壳素酶的泥鳅生长饲料的制备方法，包括以下步骤：
1)蝇蛆粉的制备：取所需含量蝇蛆粉，粉碎研磨后过80目网筛，-20℃冰箱中保存备用；
2)泥鳅生长饲料的制备：取配方量的鱼粉、豆粕、玉米蛋白粉、高筋粉、甜菜碱、氯化胆碱、大豆磷脂、鱼油、豆油、磷酸二氢钙、维生素C多聚磷酸酯、维生素混合物和矿物质混合物，及步骤1)所制备的蝇蛆粉，各组分均匀混合，粉碎并过60目筛，再制成直径为2.00mm的颗粒饲料，自然冷却后装入密封袋，置于阴凉干燥处保存备用。
本发明的机理：饲料中添加外源性甲壳素酶，能有效降低甲壳素对动物消化和吸收的负面影响，消除其抗营养作用。甲壳素聚糖为甲壳素酶降解甲壳素的产物，相较于水不溶性的甲壳素，其具有抗氧化作用，能激活动物的免疫机能，具有较强的生物学活性。
本发明通过在饲料中添加0.001％-0.400％的甲壳素酶，能提高泥鳅的增重率和特定生长率，降低饲料系数。因此将甲壳素酶添加于含有蝇蛆粉的泥鳅饲料中，可有效消除甲壳素对泥鳅的抗营养作用，能有效促进泥鳅的生长性能，增强泥鳅的非特异性免疫能力。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例一
一种含有甲壳素酶的泥鳅生长饲料，包括以下组份及含量，鱼粉14％，蝇蛆粉27％，豆粕25％，玉米蛋白粉5％，高筋粉22％，甜菜碱0.5％，氯化胆碱0.5％，大豆磷脂1％，鱼油0.5％，豆油2％，磷酸二氢钙1.5％，维生素C多聚磷酸酯0.2％，维生素混合物0.3％，矿物质混合物0.5％，将上述各组份均匀混合组成基础饲料。
实施例二
向实施例一制得的基础饲料中，加入基础饲料总量0.025％的甲壳素酶替代等量的基础饲料，即得泥鳅生长饲料。
实施例三
向实施例一制得的基础饲料中，加入基础饲料总量0.050％的甲壳素酶替代等量的基础饲料，即得泥鳅生长饲料。
实施例四
向实施例一制得的基础饲料中，加入基础饲料总量0.100％的甲壳素酶替代等量的基础饲料，即得泥鳅生长饲料。
实施例五
向实施例一制得的基础饲料中，加入基础饲料总量0.200％的甲壳素酶替代等量的基础饲料，即得泥鳅生长饲料。
实施例六
向实施例一制得的基础饲料中，加入基础饲料总量0.400％的甲壳素酶替代等量的基础饲料，即得泥鳅生长饲料。
本发明的泥鳅生长饲料的性能研究
1.1试验用料
甲壳素酶为饲料级粉状酶制剂，购自上海陆广生物科技有限公司，活性为20000U/g；
试验用蝇蛆粉购于江苏长江饲料有限公司，粗蛋白含量为53.00％；粗脂肪含量为：13.5％；水分含量为8.2％；灰分含量为10.80％；钙含量为1.00％；总磷含量为1.12％；能量为20.9MJ/kg。蝇蛆粉粉碎研磨后过80目网筛，-20℃冰箱中保存备用。
在基础饲料的基础上，参照实施例一至六，以0、0.025％、0.050％、0.100％、0.200％和0.400％的甲壳素酶替代等量的基础饲料，制成6种等氮等能试验饲料，分别用E1(对照)、E2、E3、E4、E5和E6组表示。所有饲料原料均粉碎并过60目筛，再制成直径为2.00mm的颗粒饲料，自然冷却后装入密封袋，置于阴凉干燥处保存备用。饲料中粗蛋白、粗脂肪、粗灰分含量的测定参照AOAC(1995)的方法。饲料中总能采用氧弹量热仪(TRHW-6000C)进行测定。基础饲料组成及营养水平见表1。
表1 基础饲料配方及化学成分
维生素混合物(mg/kg or IU/kg饲料)：硫胺素,50mg；核黄素，200mg；盐酸吡哆醇，50mg；维生素B12,0.1mg；维生素K3,40mg；肌醇，2000mg；泛酸，400mg；烟酸，750mg；叶酸，15mg；生物素，5mg；维生素A，5000IU；维生素D,2000IU；维生素E，100mg；维生素C,320mg；次粉，18.67g。
矿物质混合物(mg/kg or g/kg饲料)：四水硫酸锰，40mg；六水氯化钴，80mg；五水硫酸铜，12mg；七水氯化铝，15mg；碘酸钾，5mg；七水硫酸亚铁，1000mg；七水硫酸锌，350mg；氯化钠，5000mg；亚硒酸钠，6mg。
1.2试验用鱼与饲养管理
试验选择泥鳅幼鱼，从徐州市七里沟农贸市场购得。试验在徐州生物工程职业技术学院水产养殖实验室的水族箱(120cm*60cm*40cm)中进行，开始饲喂鲤鱼开口料，2周后随机分6组，每组3个重复，每个重复放养45尾，初始体重约2.32±0.01g。试验开始停喂24h后，于每天8:00和17:00各投喂1次，投喂量为泥鳅体重的3％左右，以泥鳅1h内摄食完为宜，根据实际情况适当调整投喂量。试验用水为瀑气后的自来水，水深15cm左右，水箱无土，每隔4d换水一次，以保证水质清洁，加热棒加热控制水温在25-27℃。
1.3样品采集与分析
试验结束后停喂24h，分别称量各组泥鳅的终末体重，统计泥鳅的尾数，计算平均终末体重、增重率、特定生长率、饲料系数、成活率、肥满度等指标，参照李爱杰(1996)和刘永坚(2002)的方法测定。
取各组织样品：取泥鳅血，经离心后，吸出血清待测；取血后再取出泥鳅的内脏，并分离出肝脏，并准确称取内脏、肝脏重量，计算空壳率和内脏指数等指标。将肝脏和血清放人-80℃超低温冰箱中，待测超氧化物歧化酶(Superoxide ismutase，SOD)活性及丙二醛(Malonaldehyde，MDA)含量。
增重率(weight gain rate，WGR，％)＝100×(终末体重－初始体重)/初体重；
特定生长率(specific growth rate，SGR，％/d)＝100×(ln终末体重-ln初始体重)/试验天数；
饲料系数(feed coeficient，FC)＝投饲总量/(终末体重+死亡体重-初始体重)；
存活率(survival rate，SR，％)＝100×终末尾数/初始尾数；
空壳率(DOR，％))＝100×(体重-内脏重)/体重；
肥满度(condition factor，CF，g/cm)＝100×体重/体长3；
内脏指数(viscerosomtic index，VSI，％)＝100×内脏重/体重；
肝脏和全肠道中SOD活性和MDA含量测定均采用南京建成生物有限公司生产的试剂盒，操作步骤按试剂盒中的说明书进行。
数据以平均值±标准误(mean±S.E)表示，采用SPSS 17.0for Windows对所有数据进行单因子方差分析(ANOVA)，若差异达到显著，则进行Tukey多重比较(Tukey HSD test)，显著水平为P<0.05。
1.4蝇蛆粉替代鱼粉饲料中添加甲壳素酶对泥鳅生长性能的影响
由表2可知，各试验组终末体重随着甲壳素酶添加量的增加先上升后下降，其中E4组最高，显著高于其他各组(P<0.05)；E2和E3组差异不显著(P>0.05)，但显著高于对照组、E5和E6组(P<0.05)；对照组、E5和E6组差异不显著(P>0.05)。E4组泥鳅的WGR最高，为78.00％，随后依次是E3、E2、E6、E5、E1组，E1组最低，为40.33％；E4组显著高于E1、E2、E5、E6组(P<0.05)，与E3组差异不显著(P>0.05)；E1、E5和E6组之间无显著差异(P>0.05)。各组泥鳅SGR的顺序为E4>E3>E2>E6>E5>E1组，E4组显著高于其他各组(P<0.05)；E2、E3和E4组与E1组差异显著(P<0.05)，而E5、E6组与E1组差异不显著(P>0.05)。各组饲料FC在1.40-1.51之间，其中E4组最低，为1.40，显著高于E1、E2、E5、E6组(P<0.05)，与E3组差异不显著(P>0.05)；E2、E5、E6组与E1组无显著差异(P>0.05)。饲料中添加不同剂量的甲壳素酶对泥鳅的存活率无显著影响(P>0.05)，但E4组泥鳅的SR最高，为95.56％。
表2 蝇蛆粉替代鱼粉饲料中添加甲壳素酶对泥鳅生长性能的影响
1.5蝇蛆粉替代鱼粉饲料中添加甲壳素酶对泥鳅形体指标的影响
由表3可知，泥鳅的内脏指数、肥满度、空壳率各组之间无显著性差异(P>0.05)，但随着饲料中甲壳素酶添加量的增加，内脏指数有先降低后上升的趋势，E4组最低，肥满度和空壳率有先上升后下降的趋势，E4组最高。
表3 蝇蛆粉替代鱼粉饲料中添加甲壳素酶对泥鳅形体指标的影响
1.6蝇蛆粉替代鱼粉饲料中添加甲壳素酶对泥鳅各组织中SOD活性和MDA含量的影响
由表4可见，肝脏和血清中SOD活性均随着饲料中甲壳素酶添加量的增加先上升后降低，均在E4组最高，分别为153.96U·ml-1、113.63U·ml-1，且均显著高于其他各组(P<0.05)。E2、E4和E5组泥鳅肝脏中SOD活性无显著差异(P>0.05)，但显著高于E1组(P<0.05)；E6和E1组之间无显著差异(P>0.05)。E3和E5组泥鳅血清中SOD活性差异不显著(P>0.05)，但显著高于E1组(P<0.05)；E2、E6和E1组之间无显著差异(P>0.05)。
表4 蝇蛆粉替代鱼粉饲料中添加甲壳素酶对泥鳅各组织中SOD活性的影响
由表5可见，肝脏和血清中MDA含量均随着饲料中甲壳素酶添加量的增加先降低后上升，均在E4组最低，分别为10.67nmol·ml-1、10.90nmol·ml-1。E2、E3和E4组肝脏MDA含量无显著差异(P>0.05)，但显著低于E1和E6组(P<0.05)；E5和E6组与E1组差异不显著(P>0.05)。E2、E3、E4和E5组泥鳅血清MDA含量无显著差异(P>0.05)，但显著高于E1组(P<0.05)；E1和E6组差异不显著(P>0.05)。
表5 蝇蛆粉替代鱼粉饲料中添加甲壳素酶对泥鳅各组织中MDA含量的影响
蝇蛆粉是一种新型生物蛋白饲料原料，蛋白质含量与鱼粉相差无几，同时含有多种生物活性物质，如抗菌肽、甲壳素等。由于不具有内源性甲壳素酶，动物很难降解蝇蛆粉中的甲壳素，某些情况下可能会对养殖动物的生长造成负面影响。
饲料中添加外源性甲壳素酶，能有效降低甲壳素对动物消化和吸收的负面影响，消除其抗营养作用。甲壳素聚糖为甲壳素酶降解甲壳素的产物，相较于水不溶性的甲壳素，其具有抗氧化作用，能激活动物的免疫机能，具有较强的生物学活性。本发明以甲壳素酶添加于含有蝇蛆粉(富含甲壳素)的饲料中饲养泥鳅，发现甲壳素酶可有效消除甲壳素对泥鳅的抗营养作用，促进泥鳅生长，增强泥鳅的非特异性免疫能力。
本发明在饲料中添加0.025％-0.100％的甲壳素酶，能提高泥鳅的增重率和特定生长率，降低饲料系数。因此甲壳素酶添加于含有蝇蛆粉的泥鳅饲料中，能有效促进泥鳅的生长性能，提高饲料利用率。
在蝇蛆粉含量较高的泥鳅饲料中，通过添加甲壳素酶，能有效降解蝇蛆粉中甲壳素，消除其抗营养作用，促进营养物质的消化吸收，提高泥鳅的生长性能，另外，本发明发现添加10μg和20μg/kg体重的重组表达的甲壳素酶到含有2％虾粉的斜带石斑鱼饲料中，能显著提高斜带石斑鱼的生长性能。当甲壳素酶添加量为0.200％和0.400％时，泥鳅的增重率、特定生长率和饲料系数与对照组无显著差异，原因可能是外源性酶过多的添加会抑制内源性酶的分泌，出现的一种酶活性饱和现象，进而影响泥鳅的生长性能。
本发明中，各添加甲壳素酶组的泥鳅内脏指数、肥满度和空壳率与E1组之间无统计学差异，这说明添加甲壳素酶对泥鳅的形体指标无不良影响。同时，随着饲料中甲壳素酶添加量的增加，内脏指数有先降低后上升的趋势，E4组最低，肥满度和空壳率有先上升后下降的趋势，E4组最高。原因可能是饲料中的脂类含量和氧化程度以及碳水化合物的含量有关。
抗氧化系统是动物体免疫防御机制中起着重要作用，是一种防御过氧化反应的伤害主动防御系统；SOD活性是衡量机体抗氧化能力和非特异性免疫能力的重要指标；MDA是脂质在自由基作用下发生过氧化反应的产物，通过测定其含量，能间接评价机体抗氧化的能力。本发明中添加甲壳素酶对泥鳅的SOD活性有显著增强作用；MDA含量显著降低。说明甲壳素酶添加与含量蝇蛆粉的饲料中可在一定程度上有效增强泥鳅的抗氧化能力；并且，通过数据分析，甲壳素酶添加量为0.100％效果最佳。
综上所述，甲壳素酶添加于含有蝇蛆粉的饲料中，可降低蝇蛆中甲壳素对泥鳅的抗营养作用，提高泥鳅对饲料的消化吸收率，提高其生长性能，增强抗氧化力和非特异性免疫力，进一步提高了蝇蛆粉在泥鳅饲料中的应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。