本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及一种半滑舌鳎养殖用饲料添加剂的制备方法。
背景技术：
微生态制剂，是指运用微生态学原理，利用对宿主有益无害的益生菌或益生菌的促生长物质，经特殊工艺制成的制剂，其活性物质包括活菌体、死菌体及其代谢产物。微生态制剂经口或者其他黏膜途径投放，旨在改善黏膜表面微生物或酶的动态平衡，或用于刺激特异性或非特异性免疫机制。目前，微生物添加剂己被应用于饲料、农业、医药保健和食品等各领域中。
芽孢杆菌属于好氧菌或兼性厌氧菌，在一定极端条件下会产生芽孢，从而具有耐高温、耐酸碱等特性；同时，一般芽孢杆菌制剂能够发挥生物夺氧作用，以维持胃肠道厌氧环境，并且通常能够和乳酸菌等厌氧菌混合使用，改善胃肠道环境；且芽孢杆菌在作用过程中可产生淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等多种酶类及氨基酸、维生素和促生长物质，促进水产生物对营养物质的消化吸收；并能够与致病菌发生拮抗作用，从而抑制致病菌的生长；能够促进淋巴细胞增殖及免疫球蛋白分泌，改善动物机体的免疫功能。
半滑舌鳎是海水养殖物，对水体环境的要求很高，幼苗的存活率低，个体的生长缓慢，且容易感染有害致病菌，产生疾病。目前半滑舌鳎的养殖多采取喂药养殖，即使用抗生素来抑制有害病菌的生长。但是长期使用抗生素不仅对半滑舌鳎的养殖造成危害，而且滥用抗生素产生的耐药菌对人类健康具有巨大的威胁。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种半滑舌鳎养殖用饲料添加剂的制备方法。所得半滑舌鳎养殖用饲料添加剂既能提高半滑舌鳎幼苗存活率，又能促进半滑舌鳎个体的成长，在半滑舌鳎养殖方面具有良好市场前景。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种半滑舌鳎养殖用饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：
1）乳酸杆菌的扩大培养：将从试管斜面培养基中取出的乳酸杆菌单菌落接入到液体培养基中，然后置于揺床中，20℃、150-250r/min条件下培养3天；然后于对数期将所得乳酸杆菌培养液按1-3vol%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为20℃，发酵时间为24-48h；在所得发酵液中加入柠檬酸钠0.5-0.8vol%、nacl2-6vol%和黄原胶1-5vol%，并调节ph至5-6，得乳酸杆菌液体制剂；
2）芽孢杆菌的扩大培养：将从固体培养基中取出的芽孢杆菌单菌落接入到液体培养基中，然后置于揺床中，15℃、150-250r/min条件下培养3天；然后于对数期将所得芽孢杆菌培养液按3-5vol%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵温度为15℃，发酵时间为24-48h，得芽孢杆菌液体制剂；
3）复配：将步骤1）、2）所得乳酸杆菌液体制剂、芽孢杆菌液体制剂按体积比1-3:2（优选1:2）混合，制得所述半滑舌鳎养殖用饲料添加剂。
步骤1）中所述液体培养基的原料配方为：每1000ml蒸馏水中含：酪蛋白胨8-12g、牛肉提取物10-12g、酵母提取物5-8g、葡萄糖5-6g、乙酸钠5-6g、柠檬酸二铵2-4g、吐温801-2g、磷酸氢二钾2-4g、七水硫酸镁0.2-0.6g、一水硫酸锰0.03-0.05g、碳酸钙20-22g；
所述发酵培养基的原料配方为：每1000ml蒸馏水中含：蛋白胨5-8g、酵母粉1-3g。
步骤2）中所述液体培养基的原料配方为：每1000ml无菌水中含：蛋白胨5-8g、酵母粉1-3g、柠檬酸铁0.1-0.3g、氯化钠18-20g、氯化镁5-6g、氯化钙1.5-2.0g；
所述发酵培养基的原料配方为：每1000ml蒸馏水中含：蛋白胨5-10g、酵母粉1-3g。
所述半滑舌鳎养殖用饲料添加剂的应用方法为，按饲料重量的1-3%称取半滑舌鳎养殖用饲料添加剂，将其与饲料混合后泼洒进半滑舌鳎养殖池进行饲养。
本发明的有益效果在于：本发明所得半滑舌鳎养殖用饲料添加剂可直接投入养殖水体中，并可以降低水体中有害病菌的生长，帮助半滑舌鳎对营养物质进行消化吸收，从而显著提高半滑舌鳎的增重率以及幼苗的存活率，且该饲料添加剂稳定性良好，可以长期储存。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1乳酸杆菌液体制剂的制备
用接种环在乳酸杆菌的固体培养基上进行划线，然后置于摇床中，以20℃、150-250r/min的条件恒温培养48h，获得单菌落；挑取单菌落，接入装有200ml液体培养基的500ml锥形瓶中，然后置于摇床中，以20℃、150-250r/min的条件恒温培养48h，获取种子液；按照1vol%的接种量将种子液接入发酵培养基中进行液体发酵培养，然后置于摇床中，以20℃、150-250r/min的条件恒温培养48h，得乳酸杆菌发酵液，最后往发酵液内加入柠檬酸钠5vol%、nacl4vol%和黄原胶3vol%，并调节ph至5，获得乳酸杆菌液体制剂。
所用液体培养基的原料配方为：每1000ml蒸馏水中含：酪蛋白胨10.0g、牛肉提取物10.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二铵2.0g、吐温801.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、一水硫酸锰0.05g、碳酸钙20.0g。
所用发酵培养基的原料配方为：每1000ml蒸馏水中含：蛋白胨5.0g、酵母粉1.0g。
实施例2芽孢杆菌最优培养基的确定
将从固体培养基中取出的芽孢杆菌单菌落接入到装有200ml液体培养基的500ml锥形瓶中，15℃、150-250r/min条件下培养3天；然后将所得芽孢杆菌菌种液从液体培养基中取出，按5vol%的接种量接入18个内装有200ml不同碳氮比的培养基的500ml锥形瓶中，置于揺床中，15℃、150-250r/min条件下培养72±3小时。将其稀释之后用酶标仪测定发酵液的od值，绘制生长曲线，对比以确定最佳培养基配方。
实验确定最佳的液体培养基配方为：每1000ml无菌水中含：蛋白胨5.0g、酵母粉1.0g、柠檬酸铁0.1g、氯化钠19.45g、氯化镁5.98g、氯化钙1.8g。
所用发酵培养基的原料配方为：每1000ml蒸馏水中含：蛋白胨5.0g、酵母粉1.0g。
实施例3半滑舌鳎养殖用饲料添加剂的制备
将实施例1、2所得芽孢杆菌液体制剂、乳酸杆菌液体制剂按照4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4混合，然后撒入鱼池之中，测定不同比例饲料添加剂对半滑舌鳎幼苗存活率的影响。
表1不同比例饲料添加剂对半滑舌鳎幼苗存活率的影响
实施例4温度变化对饲料添加剂品质的影响
将芽孢杆菌液体制、乳酸杆菌液体制剂剂按体积比2:1混合制得的饲料添加剂分别放置在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃恒温水浴环境下，经过3h处理，分别检测饲料添加剂中芽孢杆菌含量及乳酸杆菌含量，确定菌种变化量，其结果见表2。
表2温度对饲料添加剂品质的影响
由表2可见，饲料添加剂中的芽孢杆菌和乳酸杆菌具有良好的稳定性，温度变化对其影响较小。
实施例5饲料添加剂稳定性试验
将芽孢杆菌液体制剂、乳酸杆菌液体制剂按体积比2:1混合制得的饲料添加剂在4℃冰箱中避光保存0个月、1个月、2个月、3个月后，分别检测其中芽孢杆菌含量及低温乳酸菌含量，其结果见表3。
表3稳定性试验
由表3可见，经3个月的存放，饲料添加剂中的芽孢杆菌和乳酸杆菌含量仍较高。
实施例6饲料添加剂用于半滑舌鳎的养殖实验
将芽孢杆菌液体制剂、乳酸杆菌液体制剂按体积比2:1混合制得的饲料添加剂与半滑舌鳎饲料混合，加水润湿后进行投料。选择无外伤，体质健壮，规格均一，摄食、游动能力强的个体进行喂养。
具体喂养方式为：分别在上午08:30-09:30和下午14:00-15:00，分两次进行喂食，每天喂食时间共2小时；估算半滑舌鳎幼鱼的采食量；温度控制在19±3℃，盐度千分之28-30、ph7.4-7.9，溶解氧保持在5mg/l以上；及时将病鱼、死鱼捞出；为期60天。记录鱼体存活率、初重、终重、初始体长、最终体长，并以单纯饲料喂养为对照，以探究该饲料添加剂对半滑舌鳎幼鱼增重、增长和成活率的影响。
表4半滑舌鳎水箱养殖试验
由表4可见，将本发明所制备的半滑舌鳎饲料添加剂应用于半滑舌鳎的养殖，可以明显增加鱼体的重量和体长，其平均增重198g，比正常饲料喂养的对照组多26g，平均增长12cm，比正常饲料喂养的对照组多2cm；同时，其可以提高养殖存活率，使存活率提高22%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。