本发明涉及一种小麦蛋白的改性方法，具体涉及一种使用有机酸型天然低共熔溶剂对小麦蛋白促脱酰胺改性的方法。
背景技术：
小麦蛋白作为小麦淀粉的副产物，是一种营养丰富，物美价廉的植物蛋白。蛋白富含的大量非极性残基（30%~40%）如gln、asn等以疏水交互作用存在，同时其重复结构域富含谷氨酰胺，侧链易形成氢键，因此导致了它的水难溶性，使得它的许多功能性质如乳化性、起泡性等应用受到限制，进而限制了其在食品领域及其他领域方面的应用。大量的研究表明脱酰胺处理可明显改善小麦蛋白的溶解性，其原理是将蛋白中大量不带电荷的极性天门冬酰胺和谷胺酰胺中的酰胺基团转变成带负电荷的羧酸基，进而使蛋白间的氢键减少，蛋白表面负电荷增加，分子间静电斥力增强，蛋白分子结构展开。
本课题组前期专利（ccn200910036934.x）提出了一种使用有机酸脱酰胺改性小麦面筋蛋白的方法，所得改性蛋白降解程度低，起泡性高。liao等指出有机酸（醋酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸）随机脱酰胺作用具有较强的专一性和高特异性，仅蛋白侧链酰胺基团进行脱酰胺改性，伴随着这一反应小麦蛋白的溶解性和功能特性得到改善，并且对蛋白质的水解作用也较为微弱。wang等人报道经柠檬酸、酒石酸、苹果酸脱酰胺改性的小麦蛋白的溶解性和乳化性显著提高。但目前对小麦蛋白促溶获得的脱酰胺程度有限，难以实现高脱酰胺（＞90%），亟需寻求突破，采用更适宜工业化的途径开发研究小麦蛋白对提高小面蛋白产品附加值，扩展其应用范围。
2013年dai等发现动植物的初级代谢物产物（糖、氨基酸、胆碱类、有机酸）以适当的比例混合时形成了天然低共熔溶剂，可易提取难溶性大分子如蛋白质、淀粉、dna等。近年来天然低共熔溶剂以其高效廉价、无毒可降解成为当前富有潜力的新型绿色溶剂，已用于生物催化转化、难溶的生物活性大分子的提取分离。2017年lores等结合超声技术研究天然低共熔溶剂（葡萄糖-柠檬酸-水、葡萄糖-酒石酸-水、果糖-柠檬酸-水、蔗糖-柠檬酸-水）对小麦蛋白有较好的促溶效果，并显著高于醇水溶液和单独的柠檬酸溶液。基于该研究，本发明进一步首次发现其对小麦蛋白促溶的同时对小麦蛋白脱酰胺改性也具有很好的协同促进效果，因此将有机酸型天然低共熔溶剂作为小麦蛋白脱酰胺改性试剂，具有广阔的推广应用前景。
技术实现要素：
本发明的目的正是基于上述现有的技术状况提出的一种使用新型廉价、绿色环保的有机酸型天然低共熔溶剂促脱酰胺改性小麦蛋白的方法，可在相同条件下比单纯的有机酸脱酰胺明显提高脱酰胺程度10%-20%。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种使用有机酸型天然低共熔溶剂促脱酰胺改性小麦蛋白的方法，其具体包括如下步骤：
（1）天然低共熔溶剂的制备和稀释：
将柠檬酸/苹果酸/酒石酸/乳酸和葡萄糖/果糖/蔗糖以摩尔比为1:1和适量的水混合，50-80℃磁力搅拌30-120min，直至形成澄清透明的液体。将合成的酸和糖组分总浓度为2.0mol/l-5.0mol/l的天然低共熔溶剂（100%）与水按体积比4:1-1:9稀释成所需浓度：80%-10%；
（2）小麦蛋白悬浮液的制备：
室温下将小麦蛋白溶于步骤（1）所得的稀释后的天然低共熔溶剂中配置成蛋白质量分数为2%-15%的悬浮液，35℃水化2-12h；
（3）脱酰胺改性小麦蛋白的制备：
将步骤（2）所得的蛋白悬浮液放入杀菌锅在121℃下湿热处理10-30min，将得到的上清液于-4℃透析24h除去盐离子后冷冻干燥，得到改性蛋白样品。
本发明的突出优点是：
（1）本发明将常用于小麦蛋白脱酰胺改性的可食性有机酸（三元羧酸柠檬酸、二元羧酸苹果酸、酒石酸、一元羧酸乳酸）和天然单糖和双糖（葡萄糖/果糖/蔗糖）作为组分合成天然低共熔溶剂。所用溶剂原料易得，制备简单，高效廉价，绿色环保。
（2）本发明在基于有机酸对小麦面筋蛋白脱酰胺改性促溶的基础上，可进一步提高面筋蛋白溶解性，蛋白质回收率高达94.83%。
（3）本发明可在相同条件下比单纯的有机酸脱酰胺明显提高脱酰胺程度10%-20%。从而更易获得较高脱酰胺改性的小麦蛋白，大大提高了工业效率。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
以摩尔比1:1称取柠檬酸、葡萄糖固体粉末加入到含有适量水的圆底烧瓶，50℃磁力搅拌加热30-60min，直至形成澄清透明的液体。将合成的组分总浓度为2.8mol/l的柠檬酸-葡萄糖（100%）与水按照1:4混合稀释至20%，将小麦蛋白溶于稀释后的柠檬酸-葡萄糖天然低共熔溶剂配置成蛋白质量分数为5%的蛋白悬浮液，35℃水化2h后，121℃加热反应10min。脱酰胺反应结束后快速放气取出并冷却，9500rpm/min离心10min，-4℃透析24h。
实施例2
以摩尔比1:1称取苹果酸、葡萄糖固体粉末加入到含有适量水的圆底烧瓶，50℃磁力搅拌加热30-60min，直至形成澄清透明的液体。将合成的组分总浓度为2.8mol/l的苹果酸-葡萄糖（100%）与水按照1:4混合稀释至20%，将小麦蛋白溶于稀释后的苹果酸-葡萄糖天然低共熔溶剂配置成蛋白质量分数为5%的蛋白悬浮液，35℃水化2h后，121℃加热反应10min。脱酰胺反应结束后快速放气取出并冷却，9500rpm/min离心10min，-4℃透析24h。
实施例3
以摩尔比1:1称取酒石酸、葡萄糖固体粉末加入到含有适量水的圆底烧瓶，50℃磁力搅拌加热30-60min，直至形成澄清透明的液体。将合成的组分总浓度为2.8mol/l的酒石酸-葡萄糖（100%）与水按照1:4混合稀释至20%，将小麦蛋白溶于稀释后的酒石酸-葡萄糖天然低共熔溶剂配置成蛋白质量分数为5%的蛋白悬浮液，35℃水化2h后，121℃加热反应10min。脱酰胺反应结束后快速放气取出并冷却，9500rpm/min离心10min，-4℃透析24h。
对比例1
将小麦蛋白溶于单纯的0.28mol/l柠檬酸溶液（与实施例1含有等量的柠檬酸）配置成蛋白质量分数为5%的蛋白悬浮液，35℃水化2h后，121℃加热反应10min。脱酰胺反应结束后快速放气取出并冷却，9500rpm/min离心10min，-4℃透析24h。
对比例2
将小麦蛋白溶于单纯的0.28mol/l苹果酸溶液（与实施例2含有等量的苹果酸）配置成蛋白质量分数为5%的蛋白悬浮液，35℃水化2h后，121℃加热反应10min。脱酰胺反应结束后快速放气取出并冷却，9500rpm/min离心10min，-4℃透析24h。
对比例3
将小麦蛋白溶于单纯的0.28mol/l酒石酸溶液（与实施例3含有等量的酒石酸）配置成蛋白质量分数为5%的蛋白悬浮液，35℃水化2h后，121℃加热反应10min。脱酰胺反应结束后快速放气取出并冷却，9500rpm/min离心10min，-4℃透析24h。
1.蛋白质回收率的测定：
(1)绘制标准曲线：首先取12支试管分两组，分别加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的标准蛋白液，用水补足到1.00ml，然后加入4.00ml双缩脲试剂，充分摇匀，在室温下静置30min，最后用未加蛋白溶液的试管作为空白对照组，在540nm处调零，测定样品吸光度。
(2)取离心后的水解蛋白液0.20ml，加入蒸馏水补足到1.00ml，然后加入4.00ml双缩脲试剂，振荡器震荡摇匀后，在室温下静置30min，每个样品做两组平行，同时做空白组,以空白管于540nm处调零，测定样品吸光度。
2.脱酰胺程度的测定：
脱酰胺程度(dd)（%）＝（样品脱酰胺产生的氨÷样品完全脱酰胺产生的氨）×100
(1)样品完全脱酰胺产生的氨的测定：将0.5g小麦面筋蛋白样品密封于装有10ml3mol/l盐酸的安倍管中，放入杀菌锅（121℃）湿热处理90min后，用康微皿法测定其氨的释放量。
(2)样品脱酰胺产生的氨的测定：于微量弥散皿中央加入3ml硼酸、综合指示剂3滴，外围加入1ml样品及3ml饱和氢氧化钠溶液，随后立即盖上涂抹了水溶性阿拉伯胶的皿盖弥散皿；平放桌面12h后，用0.02mol/l的标准盐酸溶液滴定，直至综合指示剂由蓝变化红。
表1不同天然低共熔溶剂和有机酸改性小麦蛋白的蛋白质回收率和脱酰胺程度对比
由表1可见与单纯的有机酸对比例1、2、3相比，同等条件下天然低共熔溶剂实施例1、2、3改性小麦蛋白可提高蛋白质回收率0.21-5.65%，脱酰胺程度显著提高10.10-18.23%。在基于有机酸脱酰胺改性小麦蛋白促溶的基础上，实施例1、2、3三种有机酸型天然低共熔溶剂进一步提高了小麦蛋白的溶解性和脱酰胺程度。由以上试验可见，有机酸型天然低共熔溶剂是促脱酰胺改性小麦蛋白的有效方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。