本发明属于食品质量与安全领域，具体涉及一种peg-acs/si-luxr复合物的制备及在大黄鱼贮藏中的应用，旨在降低贮藏中生物胺的含量。
背景技术
生物胺是一种低分子量的含氮有机碱，包括脂肪族、芳香族和杂环结构，属于极性或半极性化合物。生物胺主要是由细菌产生的氨基酸脱羧酶对氨基酸的作用或细菌对醛和酮类物质转氨基作用所产生的。当人体摄入过量的生物胺时会引起头痛，恶心，低血压，高血压，偏头痛，皮肤过敏和食物中毒的消化问题等。并且，生物胺是亚硝胺的前体，其与致癌和致突变活性具有一定的关系。生物胺性质稳定，在高温下不易降解，目前降低生物胺的主要方法有超高压法、辐照法等，这些方法存在着操作要求高，成本高，效果不明显，易降低食品品质等缺点，难以在生产中应用和推广。
大黄鱼口感鲜美，营养丰富，是我国东南沿海最具商业价值的海洋品种，深受消费者喜爱。但是研究发现，在大黄鱼贮藏过程中主要腐败菌波罗的海希瓦氏菌可将大黄鱼中的蛋白质、氨基酸等含氮物质降解为生物胺从而降低了大黄鱼的品质，并可引发生物胺安全问题。因此采用一种高效、简单、实用、安全的方法降低大黄鱼贮藏中的生物胺对提升其品质和食用安全有着重要的意义。
rna干扰技术是通过具有同源性的双链rna(dsrna)诱导序列特异的目标基因的沉默，阻断其基因活性。研究表明，rna干扰技术可通过将dsrna经dicer酶作用下剪切形成具有大约20～30核苷酸长度的sirna(小干扰核糖核酸)来达到使目的基因沉默的目的。
本发明制备的壳聚糖sirna-peg微粒，研究表明能够有效抑制大黄鱼中主要产胺菌波罗的海希瓦氏菌(shewanellabalticaos678)(nc016901)的群体感应受体蛋白调节基因的表达，从而降低波罗的海希瓦氏菌对信号分子的感应，进而降低其生物胺产生能力。其中，壳聚糖和聚乙二醇(peg)都是国家允许的食品添加剂，能够安全用于大黄鱼生物胺的抑制。在无需传统的构建基因缺失株的情况下，通过与靶基因mrna的结合就能有效降低靶基因的表达，因此具有非常广泛的应用前景。目前rna干扰技术在食品领域上暂无应用，本发明将peg-acs/si-luxr复合物应用于降低贮藏中的大黄鱼生物胺含量中具有一定的理论原始创新性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种peg-acs/si-luxr复合物的制备方法及应用策略，能够抑制大黄鱼贮藏中主要产胺菌波罗的海希瓦氏菌的群体感应受体蛋白合成基因luxr的调节基因的表达，从而抑制波罗的海希瓦氏菌的群体感应，进而降低大黄鱼贮藏中生物胺的含量。针对大黄鱼目前所存在的质量安全问题提供了一种高效、易操作的降低生物胺含量方法，对提高大黄鱼产品的食用安全性有着重要的意义。
本发明的技术方案如下：
一种peg-acs/si-luxr复合物，其特征在于，根据大黄鱼贮藏中主要产胺菌波罗的海希瓦氏菌(shewanellabalticaos678)(nc016901)群体感应受体蛋白合成调节基因(sbal678_rs45835geneid:11774396)序列(seqno：1)设计si-luxr，si-luxr与peg化的精氨酸修饰的壳聚糖反应得到peg-acs/si-luxr复合物。
进一步，其中si-luxr为双链，其序列为：
正义链：5'-gucucgaauuguugcgauacc-3'
反义链：5'-uaucgcaacaauucgagacuu-3'。
进一步，所述peg化的精氨酸修饰的壳聚糖采用以下步骤制备：
精氨酸修饰壳聚糖的制备：壳聚糖溶于temed/hcl缓冲溶液中，然后向该溶液中加入1-乙基-3(3-二甲胺丙基)碳二亚胺、n-羟基-丁二酰亚胺偶联剂，搅拌均匀后，再加入壳聚糖氨基50％～100％摩尔量的精氨酸，在磁力搅拌下连续室温反应6～10h，然后经脱盐水透析和冷冻干燥处理得到精氨酸修饰的壳聚糖；
peg-acs的制备：取精氨酸修饰的壳聚糖，加入过量peg-spa，室温下反应，使用截留分子量为14000的透析袋透析，去掉未反应的peg，得到peg化的精氨酸修饰的壳聚糖。
进一步，所述peg-acs/si-luxr复合物的制备：
sirna溶液的制备：用depc水溶解sirna，制备浓度为18～25μm的sirna溶液；
将peg-acs溶解于naac/hac缓冲溶液中，与sirna溶液分别置于50～55℃恒温水浴加热10～15min，然后将两种溶液混合，其中peg-acs与sirna质量比为90～110:1；迅速在涡旋混合器上混合30～40s，得peg-acs/si-luxr微粒。
进一步，根据大黄鱼贮藏中主要产胺菌株波罗的海希瓦氏菌群体感应受体蛋白合成调节基因的相关序列设计si-luxr序列。
si-luxr序列为：
正义链：5'-gucucgaauuguugcgauacc-3'；
反义链：5'-uaucgcaacaauucgagacuu-3'。
si-luxr的制备：t7启动子模板dna为5'-taatacgactcactataggagacagg-3'，取3μlsirna分子正义链(100umol/l)和3μlt7启动子引物模板(100umol/l)混合，90～100℃预变性2～5min，冰浴15～30min，再加入1～5μl10xklenow缓冲液，5～10μl三磷酸脱氧核苷(dntp)(10μmol/l)，1～4μl去离子水，1～5μlklenow酶(2u/μl)，30～40℃水浴20～40min。取6μl反应液，加入3～6μl缓冲液，4～7μl三磷酸核苷(rntp)混合物(25mmo1/l)，1～4μl去离子水和1～4μlt7rna聚合酶，30～40℃水浴1～4h。相同的方法制备反义链dna产物。将两种dna转录产物混合，30～40℃下水浴16～24h。通过转录试剂盒的方法消化dna模板，并用酚-氯仿法纯化sirna分子，于-80℃下保存备用。
精氨酸修饰壳聚糖(acs)的制备：1g分子量5x104d，脱乙酰度为80～85％壳聚糖，溶于ph4.5～5.0的temed/hcl缓冲溶液中，然后向该溶液中加入等摩尔量的1-乙基-3(3-二甲胺丙基)碳二亚胺(edc)、n-羟基-丁二酰亚胺(nhs)偶联剂，搅拌均匀后，再加入壳聚糖氨基50％～100％摩尔量的精氨酸，在磁力搅拌下连续室温反应6～10h，然后经脱盐水透析和冷冻干燥处理得到最终产品精氨酸修饰的壳聚糖。
peg-acs的制备：取2.5ml，10mg/ml精氨酸修饰的壳聚糖，加入25mg的peg-spa，室温下反应4h。使用截留分子量为14000的透析袋透析，去掉未反应的peg，得到peg化的精氨酸修饰的壳聚糖。
sirna溶液的制备：用depc水溶解sirna，制备浓度为18～25μm的sirna溶液，-20℃保存备用。sirna反复冻融不得超过5次。
peg-acs/si-luxr复合物的制备：用复凝聚的方法制备peg-acs/si-luxr复合物：将peg-acs溶解于naac/hac缓冲溶液(ph4.5～5.5)中，至peg-acs的质量分数为0.02％，过滤灭菌后置于4℃冰箱保存。将一定量的peg-acs溶液和sirna溶液分别置于50～55℃恒温水浴加热10～15min，然后将两种溶液按一定比例混合(peg-acs与sirna质量比为90～110:1)。迅速在涡旋混合器上混合30～40s，即得peg-acs/si-luxr微粒。制备的复合物置于4℃冰箱中保存。
进一步，所述的peg-acs/si-luxr复合物微粒的粒径为150～250nm。
进一步，peg-acs/si-luxr微粒的复合率大于或等于80％。
进一步，壳聚糖的分子量5x104d，脱乙酰度为80～85％。
本发明还提供一种peg-acs/si-luxr复合物在大黄鱼贮藏中的应用。
进一步，大黄鱼贮藏前在0.3～0.4mmol/l的peg-acs/si-luxr微粒溶液中浸泡3min～5min。
本发明还提供一种降低大黄鱼贮藏中生物胺含量的方法，大黄鱼贮藏前在0.3～0.4mmol/l的上述的peg-acs/si-luxr微粒溶液中浸泡3min～5min。
本发明的有益效果如下：
1.peg-acs/si-luxr微粒中所含的壳聚糖、聚乙二醇均是国家允许的食品添加剂，具有良好的生物相容性、生物降解性等特点。
2.peg-acs/si-luxr微粒能显著降低大黄鱼贮藏中生物胺的含量。
3.peg-acs/si-luxr微粒的添加不会影响大黄鱼的感官特征，并且对大黄鱼的品质还有一定的改善作用。
附图说明：
图1为4℃下贮藏下经peg-acs/si-luxr微粒处理(treated)和未处理(control)大黄鱼生物胺含量对比。
图2为25℃下经peg-acs/si-luxr微粒处理和未处理大黄鱼生物胺含量对比。
具体实施方式
实施例1：
peg-acs/sirna复合物的制备：
(1)根据大黄鱼贮藏中主要产胺菌株波罗的海希瓦氏菌群体感应受体蛋白合成调节基因的相关序列设计si-luxr序列(参见附录)。si-luxr序列为：
正义链：5'-gucucgaauuguugcgauacc-3'；
反义链：5'-uaucgcaacaauucgagacuu-3'。
(2)si-luxr的制备：t7启动子模板dna为5'-taatacgactcactataggagacagg-3'，取3μlsirna分子正义链(100umol/l)和3μlt7启动子引物模板(100umol/l)混合，95℃预变性4min，冰浴20min，再加入3μl10xklenow缓冲液，8μl三磷酸脱氧核苷(dntp)(10μmol/l)，4μl去离子水，3μlklenow酶(2u/μl)，30～40℃水浴20～40min。取6μl反应液，加入4μl缓冲液，7μl三磷酸核苷(rntp)混合物(25mmo1/l)，4μl去离子水和4μlt7rna聚合酶，37℃水浴2h。相同的方法制备反义链dna产物。将两种dna转录产物混合，37℃下水浴20h。通过转录试剂盒的方法消化dna模板，并用酚-氯仿法纯化sirna分子，于-80℃下保存备用。
(1)acs的制备：称取1g壳聚糖，溶于ph4.8的temed/hcl缓冲溶液中，然后向该溶液中加入偶联剂edc1.13g、nhs0.685g，搅拌均匀后，再加入与壳聚糖氨基等摩尔量的精氨酸，在磁力搅拌下室温反应7.5h，然后经脱盐水透析和冷冻干燥处理得到精氨酸修饰的壳聚糖。
(4)peg-acs的制备：取2.6ml，9mg/ml精氨酸修饰的壳聚糖，加入23mg的peg-spa，室温下反应4h。使用截留分子量为14000的透析袋透析，去掉未反应的peg。得到peg化的精氨酸修饰的壳聚糖。
(5)sirna溶液的制备：用125μldepc水溶解10dsirna，制备浓度为20μm的sirna溶液，-20℃保存备用。
(6)peg-acs/sirna的制备：将peg-acs溶解于naac/hac缓冲溶液(ph5.6)中，至peg-acs的质量分数为0.02％，过滤灭菌后置于4℃冰箱保存。将peg-acs溶液和sirna溶液分别置于52℃恒温水浴加热13min，然后按peg-acs与sirna的质量比为100:1迅速在涡旋混合器上混合40s，即得peg-acs/sirna微粒。制备的复合物置于4℃冰箱中保存。
(7)得到的微粒通过动态光散射法测得粒径为155nm，用sybr核酸染料法测得peg-acs/si-luxr微粒的复合率为82％，并将得到的peg-acs/si-luxr微粒溶于0.5％甘油中，制成0.32mmol/l的peg-acs/si-luxr微粒溶液。
peg-acs/si-luxr复合物的应用，即降低大黄鱼贮藏生物胺含量的方法为：
将鲜活养殖大黄鱼采用碎冰处死，用冷水将冰冲洗干净并淋干。将大黄鱼浸于4℃的peg-acs/si-luxr溶液(0.32mmol/l)，浸泡4分钟取出沥干后装入无菌袋中，于4℃冰箱中保存。
将大黄鱼于4℃冰箱中保存10天后将大黄鱼取出，采用高效液相色谱测定大黄鱼生物胺含量，并对大黄鱼的质构和气味进行评定，生物胺平均含量测得结果如表1所示。
表1不同处理下大黄鱼生物胺含量
根据结果图1所示，peg-acs/si-luxr微粒的添加能够极显著地降低4℃贮存下大黄鱼中腐胺和尸胺的含量，显著降低精胺的含量。同时处理组与未处理组比较肉质具有更好的弹性。
实施例2：
peg-acs/sirna复合物
其中sirna的制备与实施例1中相同。
(1)acs的制备：称取1g壳聚糖，溶于ph4.5的temed/hcl缓冲溶液中，然后向该溶液中加入偶联剂edc1.13g、nhs0.685g，搅拌均匀后，再加入与壳聚糖氨基一半摩尔量的精氨酸，在磁力搅拌下室温反应7h，然后经脱盐水透析和冷冻干燥处理得到精氨酸修饰的壳聚糖。
(2)peg-acs的制备：取2.5ml，10mg/ml精氨酸修饰的壳聚糖，加入25mg的peg-spa，室温下反应4h。使用截留分子量为14000的透析袋透析，去掉未反应的peg。得到peg化的精氨酸修饰的壳聚糖。
(3)sirna溶液的制备：用depc水溶解10dsirna，制备浓度为17μm的sirna溶液，-20℃保存备用。
(4)peg-acs/sirna的制备：将peg-acs溶解于naac/hac缓冲溶液(ph5.4)中，至peg-acs的质量分数为0.02％，过滤灭菌后置于4℃冰箱保存。将peg-acs溶液和sirna溶液分别置于55℃恒温水浴加热10min，然后按peg-acs与sirna的质量比为95:1迅速在涡旋混合器上混合30s，即得peg-acs/sirna微粒。制备的复合物置于4℃冰箱中保存。
(5)得到的微粒通过动态光散射法测得纳米粒的粒径为235nm，用sybr核酸染料法测得peg-acs/si-luxr复合率为85％，并将得到的peg-acs/si-luxr微粒溶于0.5％甘油中，制成0.36mmol/l的peg-acs/si-luxr溶液。
peg-acs/si-luxr复合物的应用，即降低大黄鱼贮藏生物胺含量的方法为：将鲜活养殖大黄鱼采用碎冰处死，用冷水将冰冲洗干净并淋干。大黄鱼浸于4℃的peg-acs/si-luxr溶液(0.36mmol/l)，浸泡3分钟后取出沥干后装入无菌袋中，于室温25℃下放置36小时。
将大黄鱼从无菌袋中取出，采用高效液相色谱测定大黄鱼中生物胺含量，并对大黄鱼的质构和气味进行评定。生物胺含量测得结果如表2所示。
表2不同处理下大黄鱼生物胺含量
根据结果图2所示peg-acs/si-luxr微粒的添加能够极显著地降低25℃储存下大黄鱼腐胺和尸胺的含量，能够明显降低精胺和亚精胺的含量。同时处理组和未处理组比较，肉质更有弹性。
sequencelisting
<110>浙江工商大学
<120>peg-acs/si-luxr复合物及其应用和降低大黄鱼贮藏中生物胺含量的方法
<130>2018
<160>1
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>546
<212>dna
<213>波罗的海希瓦氏菌（shewanellabaltica）
<400>1
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