本发明属于酵素发酵技术领域，涉及一种玫瑰花酵素的制备，尤其是一种多菌种复合发酵玫瑰花酵素的制备方法。
背景技术：
玫瑰广泛种植于世界各地，中国是玫瑰的主产国，在山东、甘肃、北京、黑龙江、云南、新疆、陕西等省都有种植，尤其以山东平阴、云南的重瓣玫瑰和甘肃苦水的玫瑰最为知名。从玫瑰花朵中提取的精油是国际市场上最受人们喜爱的花香型精油之一，被誉为“液体黄金”。除此之外，玫瑰花还含有具有保健作用的功能性成分，如：多酚、黄酮、多糖和矿物质，是一种典型的“药食同源”花朵，在民间用玫瑰花制作玫瑰蜜饯、玫瑰饼、玫瑰饮料等食品。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种多菌种复合发酵玫瑰花酵素的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
这种多菌种复合发酵玫瑰花酵素的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)玫瑰花酶解提汁
将玫瑰花破碎加水搅拌，其中加水量按玫瑰花重量份，1份玫瑰花中加入4-25份纯净水；搅拌均匀后按总重量分别加入0.01-0.03％的果胶酶和纤维素酶，在酶解温度40℃—45℃条件下酶解3-4h；
步骤2)玫瑰汁过滤
将步骤1)酶解后的玫瑰汁用带有100目不锈钢筛网的三足式离心机分离除渣，获得玫瑰汁；
步骤3)玫瑰茄汁和甘草提汁
按重量份，将干玫瑰茄清洗干净后，在1份干玫瑰茄中加入70-100份纯净水，在95℃—100℃煮沸5-10min，过滤除渣，获得玫瑰茄汁；
按重量份，在1份甘草加入5份纯净水，煮沸10min，沥去汁液，再按甘草初重，在1份甘草中再加入10-15份纯净水，煮沸30min，过滤除渣，获得甘草汁；
步骤4)发酵液配制
分别称取步骤2)获得的玫瑰汁和步骤3)获得玫瑰茄汁和甘草汁，以及蔗糖、乳清蛋白粉、nacl和k2hpo4按以下质量配比进行配料，得到发酵液：
玫瑰汁75-85％，玫瑰茄汁7-14％，甘草汁2-5％，蔗糖8-15％，乳清蛋白粉1-3％，nacl0.5-1.3％，k2hpo40.1-0.2％；
步骤5)发酵液杀菌
将步骤4)配制好的发酵液通过搅拌混合均匀并完全溶解固体物料后，用列管式加热器加热至95℃—100℃，直接通入到无菌乳酸发酵罐中，自然冷却；
步骤6)乳酸发酵
在无菌条件下接种乳酸菌种子液于步骤5)得到的自然冷却的发酵液中，乳酸菌种子接种量按发酵液体积5-7％接入，要求发酵温度控制在37℃—40℃，乳酸发酵罐罐压维持在0.1pa—0.3pa之间，待发酵液总酸含量达到2％时乳酸发酵结束，发酵时间在36-48h之间，得到乳酸发酵好的发酵液；
步骤7)酒精发酵
将步骤6)乳酸发酵好的发酵液转入无菌的酒精发酵罐中，接入高活性干啤酒酵母菌粉，接种量按发酵液重量0.05-0.1％接种；在25℃-28℃发酵4-5天，发酵液酒精度达到6％(v/v)以上时，酒精发酵结束，得到酒精发酵液；
步骤8)醋酸发酵
将步骤7)得到的酒精发酵液置于醋酸发酵罐中，加入上一批醋酸发酵旺盛、发酵液表面已形成醋膜的发酵液，加入量以酒精度为6％的发酵液与上一批醋酸发酵旺盛的发酵液重量比3:1加入，混合均匀后，在室温不低于0℃的自然条件下静置发酵，每天从醋酸发酵罐底部通入无菌空气1次，通气时间5min，通气强度以发酵液顶部仅有很少量气泡溢出为准，通气量为0.10vvm；待发酵液酒精度下降至0.5％(v/v)时醋酸发酵结束；
步骤9)热处理
将步骤8)醋酸发酵结束的玫瑰发酵液加热至65-80℃，保温20min，进行杀菌和热处理，之后迅速冷却至室温，获得玫瑰酵素。
进一步的，以上步骤1)中，所述的玫瑰花为能食用的玫瑰花品种，剔除玫瑰花中的树枝、树叶及其它杂物，用清水冲洗干净，沥干水分备用。
进一步的，以上步骤1)中，当所述玫瑰花为新鲜玫瑰花时，按照1份新鲜玫瑰花中加入4-9份纯净水；当所述玫瑰花为干玫瑰花时，按照1份干玫瑰花中加入20-25份纯净水，且干玫瑰花先用少量水浸泡30min，用锤式粉碎机破碎，再将剩余水加入。
进一步的，以上步骤6)中，乳酸菌种子液的制备方法为：
取已活化好的植物乳杆菌、发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌3株固体试管菌种，分别转接于三角瓶mrs无菌液体培养基中进行培养，在温度37℃下静止培养24h；将已培养好的3株三角瓶乳酸菌液在无菌条件下等体积混合，接入已灭菌的乳酸菌种子培养基中，按种子培养基重量的5-7％进行接种，种子罐温度控制为37-40℃，罐压维持在0.1pa—0.3pa之间，培养时间36-48h，待种子液中乳酸菌数量达到1×109个/ml以上时结束，得到乳酸菌种子液。
进一步，以上所述mrs液体培养基配制为：蛋白胨10g，牛肉粉5g，葡萄糖20g，酵母粉4g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，柠檬酸三铵2g，硫酸锰0.05g，吐温801ml，加入到1000ml蒸馏水中，调节ph6.2～6.4，加热煮沸溶解，分装，在121℃高压灭菌20min。
进一步，以上所述乳酸菌种子培养基配制为：玫瑰汁75-85％，葡萄糖4-6％，蔗糖4-6％，乳酸1％-1.5％，乳清蛋白粉3-5％，nacl1％-1.5％，k2hpo41％-1.5％，mgso40.3-0.5％和mnso40.3-0.5％；将这些物料混合并充分溶解后，在121℃灭菌15min，冷却，备用。
进一步的，以上步骤7)中，接种前先将称取好的酵母菌投入到无菌的5％葡萄糖水溶液中，按干啤酒酵母菌粉与葡萄糖水溶液为1:100加入，静置活化20-40min。
进一步的，以上步骤8)中，首次发酵时，将酒精度为6％的玫瑰发酵液置于醋酸发酵罐中，进行通气发酵，通气量控制在以发酵液顶部仅有气泡溢出为准，通气量为0.20vvm，控制发酵温度30℃，待酒精含量下降为1％(v/v)时，作为第二批的种子液。
进一步的，以上将步骤9)获得的玫瑰酵素用板式过滤器过滤至清亮透明为止，然后装入玻璃瓶中，封盖，放入80-100℃的热水中，保温15min，之后冷却至常温。
本发明具有以下有益效果：
本发明以允许食用的玫瑰花为主料，先经过乳酸发酵，再经过酒精发酵和醋酸发酵生产玫瑰花酵素，多菌种复合发酵使其玫瑰花的芳香物质、功能性成分很好的转移于酵素中，同时经过三种发酵方式，产生乳酸、醋酸、丁酸等功能性物质。为了弥补在多菌种复合发酵中因ph下降，致使玫瑰花发酵液色泽褪色变黄、变浅，发明中添加了天然的可以食用的玫瑰茄花朵，弥补红色。因此本发明生产的玫瑰花酵素一方面具有很好的芳香气味和鲜艳的色泽，另一方面经过多菌种复合发酵赋予其醇厚的风味和功能性，集色、香、味和功能性为一体的饮料。
具体实施方式
本发明的多菌种复合发酵玫瑰花酵素的制备方法具体为：
1、原料及前处理
采用能食用的玫瑰花品种，选用新鲜、花苞尚未完全散开的新鲜无污染花朵或干玫瑰花朵，剔除玫瑰花中的树枝、树叶及其它杂物，用自来水冲洗干净，沥干水分备用。当所述玫瑰花为新鲜玫瑰花时，按照1份新鲜玫瑰花中加入4-9份纯净水；当所述玫瑰花为干玫瑰花时，按照1份干玫瑰花中加入20-25份纯净水，且干玫瑰花先用少量水浸泡30min，用锤式粉碎机破碎，再将剩余水加入。
2、玫瑰花酶解提汁
将玫瑰花用锤式粉碎机破碎，当玫瑰花为新鲜玫瑰花时，按照1份新鲜玫瑰花中加入4-9份纯净水；当玫瑰花为干玫瑰花时，按照1份干玫瑰花中加入20-25份纯净水，且干玫瑰花先用少量水浸泡30min，用锤式粉碎机破碎，再将剩余水加入。
破碎加水搅拌均匀后，按总重量分别加入0.01％-0.03％的果胶酶和纤维素酶，在酶解温度40℃—45℃条件下酶解3-4h。
3、玫瑰汁过滤
将酶解后的玫瑰汁用带有100目不锈钢筛网的三足式离心机分离除渣，获得玫瑰汁。
4、玫瑰茄汁和甘草提汁
选用无污染、无霉变的干玫瑰茄和甘草根，剔除杂质。将干玫瑰茄清洗干净后，按干玫瑰茄与水重量比1:70-100加入纯净水，在95℃—100℃煮沸5-10min，过滤除渣，获得红色玫瑰茄汁；将甘草先加5倍重量的纯净水，煮沸10min，沥去汁液，再按甘草初重加入10-15倍重量的纯净水，煮沸30min，过滤除渣，获得甘草汁。
5、发酵液配制
分别称取不同的物料，并按以下质量百分比配方进行配料，得到发酵液：
玫瑰汁75-85％，玫瑰茄汁7-14％，甘草汁2-5％，蔗糖8-15％，乳清蛋白粉1-3％，nacl0.5-1.3％，k2hpo40.1-0.2％；
6、发酵液杀菌
按配方配制好发酵液，通过搅拌混合均匀并完全溶解固体物料后，用列管式加热器加热至95℃—100℃，直接通入到乳酸发酵罐中，自然冷却。乳酸发酵罐其它管路要求达到无菌程度。
7、乳酸发酵
在无菌条件下接种乳酸菌种子液于自然冷却的发酵液中，乳酸菌种子接种量按发酵液体积5-7％接入，要求发酵温度控制在37℃—40℃，乳酸发酵罐罐压维持在0.1pa—0.3pa之间，待发酵液总酸含量达到2％时乳酸发酵结束，发酵时间在36-48h之间。
乳酸菌种子液的制备方法：
取已活化好的植物乳杆菌(lactobacillusplantarumatcc8014)、发酵乳杆菌(lactobacillusfermentiumatcc11739)和鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosusatcc7469)3株固体试管菌种，分别转接于三角瓶mrs无菌液体培养基中进行培养，在温度37℃下静止培养24h。将已培养好的3株三角瓶乳酸菌液在无菌条件下等体积混合，接入已灭菌的乳酸菌种子培养基中，按种子培养基重量的5-7％进行接种。种子罐温度控制为37℃-40℃，罐压维持在0.1pa—0.3pa之间，培养时间36-48h，待种子液中乳酸菌数量达到1×109个/ml以上时结束。
mrs液体培养基配制：蛋白胨10g，牛肉粉5g，葡萄糖20g，酵母粉4g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，柠檬酸三铵2g，硫酸锰0.05g，吐温801ml，加入到1000ml蒸馏水中，调节ph6.2～6.4，加热煮沸溶解，分装，在121℃高压灭菌20min。
乳酸菌种子培养基配制：玫瑰汁75-85％，葡萄糖4-6％，蔗糖4-6％，乳酸1％-1.5％，乳清蛋白粉3-5％，nacl1％-1.5％，k2hpo41％-1.5％，mgso40.3-0.5％和mnso40.3-0.5％。将这些物料混合并充分溶解后，在121℃灭菌15min，冷却，备用。
8、酒精发酵
将乳酸发酵好的发酵液转入无菌的酒精发酵罐中，接入高活性干啤酒酵母菌粉，接种量按发酵液重量0.05-0.1％接种。接种前先将称取好的酵母菌投入到无菌的5％葡萄糖水溶液中，按干啤酒酵母菌粉与葡萄糖水溶液为1:100加入，静置活化30min左右。在25℃-28℃发酵4—5d，发酵液酒精度达到6％(v/v)以上时，酒精发酵结束。
9、醋酸发酵
将酒精度为6％的玫瑰发酵液置于醋酸发酵罐中，加入上一批醋酸发酵旺盛、发酵液表面已形成醋膜的发酵液，加入量以酒精度为6％的发酵液与上一批醋酸发酵旺盛的发酵液重量比3:1加入，混合均匀后，在室温不低于0℃的自然条件下静置发酵，每天从醋酸发酵罐底部通入无菌空气1次，通气时间5min，通气强度以发酵液顶部仅有很少量气泡溢出为准，通气量为0.10vvm。待发酵液酒精度下降至0.5％(v/v)时醋酸发酵结束。
首次发酵时，将酒精度为6％的玫瑰发酵液置于醋酸发酵罐中，进行通气发酵，通气量控制在以发酵液顶部仅有很少量气泡溢出为准，通气量为0.20vvm，控制发酵温度30℃，待酒精含量下降为1％(v/v)时，作为第二批的种子液。
10、热处理
将醋酸发酵结束的玫瑰发酵液加热至65-80℃，保温20min，进行杀菌和热处理，之后迅速冷却至室温。获得玫瑰酵素。
11、过滤
将热处理后的发酵液用板式过滤器过滤至清亮透明为止。
12、包装、杀菌
将过滤好的玫瑰酵素装入玻璃瓶中，封盖，放入80-100℃的热水中，保温15min，之后冷却至常温。
以下通过试验来进一步说明本发明的技术方案：
一、试验原料
1、玫瑰花：干玫瑰花，采集甘肃省永登县苦水玫瑰。
2、辅料：乳清蛋白粉、大豆蛋白粉、蔗糖、葡萄糖、nacl、k2hpo4，均为食品级。
3、发酵菌种
(1)乳酸菌：植物乳杆菌(lactobacillusplantarumatcc8014)，发酵乳杆菌(lactobacillusfermentiumatcc11739)，鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosusatcc7469)，肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroidesatcc8293)，嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilusncfm)，罗伊氏乳杆菌(lactobacillusreuteridsm17938)。
(2)啤酒酵母菌(saccharomycescerevisiae)安琪酵母股份有限公司提供。
二、测定方法
1、总酸测定：酸碱滴定法，以乳酸计。
2、总酚测定：福林—酚法，儿茶素为标样。
3、酒精度测定：酒精计法。
4、氨基丁酸测定：hplc方法检测，色谱分离柱odshypersilc18柱(250×4.6mm)，紫外检测波长254nm。
hplc方法检测：进样量20μl，柱温30℃，流速0.8ml/min，流动相a：甲醇，流动相b：四氢呋喃-甲醇-0.05mol/l醋酸钠(ph6.2)(5:75:420)。
二、试验设计与结果分析
1、玫瑰花提汁方法研究
将甘肃永登县产的干苦水玫瑰，清洗后按重量比1:4-25倍加入纯净水，按表1试验方法进行设计，测定提取汁液中的总酚和总酸含量。试验结果如下：
表1不同玫瑰花提汁方法比较
玫瑰花中含有丰富的酚类物质和酸性物质，用提取汁液中的总酚和总酸含量可很好评价提取效果。从表1可知，干玫瑰花中加水提取玫瑰汁，不同的提取方法，提取的汁液中的总酚和总酸含量不尽相同。将玫瑰花不经破碎，直接加水浸提，在相同温度条件下，随着浸提时间的延长，汁液中总酚和总酸均是先增加，随后增幅变缓，同一时间，随着提取温度的升高，在提取前期均是呈增加趋势，随后总酚略有下降，而总酸趋于平缓。在70℃浸提2h，总酚达到5.86g/kg，浸提3h，总酸可达5.95g/kg。但是试验发现，尽管升高温度可促进玫瑰花中的营养物质溶出，可是加大了玫瑰花中香味物质的挥发损失，因此玫瑰花提汁，提取温度不宜过高。将玫瑰花破碎、打浆后加入果胶酶和纤维素酶，提取效果明显好于用热水直接提取的，酶解2h，总酚达到1.41g/kg，总酸达到6.03g/kg；酶解3h，总酚达到1.42g/kg，总酸达到6.04g/kg,。虽然酶解3h的总酚和总酸含量均比2h稍高，但变化幅度很小，从提取时间、节约成本考虑，试验选用玫瑰花破碎打浆，加入果胶酶和纤维素酶，在40℃下提取2h得到玫瑰汁效果最佳。
2、玫瑰汁不同营养成分对乳酸发酵的影响
将干玫瑰加入25倍的水，破碎打浆，加入果胶酶和纤维素酶，在40℃酶解2h后获取汁液。在玫瑰汁中加入不同的营养物质，121℃灭菌15min，接入已活化好的植物乳杆菌，在发酵温度38℃下进行乳酸发酵，总发酵时间控制为48h，观测乳酸菌的生长情况和乳酸的生成量。试验结果见表2。
表2培养基成分对玫瑰汁乳酸发酵的影响
因玫瑰汁含有较多的单宁类等酚类物质，试验发现，含有一定量糖类的玫瑰汁，接入植物乳杆菌后，乳酸菌在发酵液中生长缓慢或不生长。从表2可知，在玫瑰汁中加入10％葡萄糖或10％蔗糖，经植物乳杆菌48h发酵，发酵液总酸含量都很低。糖是乳酸菌产酸的主要物质，蔗糖和葡萄糖相比，二者效果相差不大。玫瑰汁中氮源较少。试验选择了食品级的大豆蛋白粉和乳清蛋白粉两种蛋白质作为氮源物质。加入氮源的玫瑰汁，乳酸发酵的速率明显快于不加的，尤其是乳清蛋白粉，其效果优于大豆蛋白粉。但试验发现，乳清蛋白粉加入过多，加入6％乳清蛋白粉于玫瑰汁中，虽然不影响乳酸发酵，但发酵后奶腥味很明显，影响产品口感。在以上试验的基础上又添加了食品级的0.1％k2hpo4和0.9％nacl，其发酵效果明显好于前面5组处理效果，说明k2hpo4和nacl对玫瑰汁乳酸发酵有很好的促进作用。最终试验结果表明，在玫瑰汁中添加12％蔗糖，2％乳清蛋白粉，0.9％nacl和0.1％k2hpo4，植物乳杆菌乳酸发酵效果最好。
3、玫瑰汁乳酸发酵乳酸菌的选择
将干玫瑰花中添加25倍重量的水，按试验1的方法提汁，再添加12％蔗糖，2％乳清蛋白粉，0.9％nacl和0.1％k2hpo4，配制成乳酸菌发酵液，接种已活化的乳酸菌，接种量按发酵液体积5％接入，在一定温度下发酵48h，利用液相色谱测定发酵液中的氨基丁酸。试验结果见表3。
表3玫瑰汁乳酸发酵乳酸菌选择
试验选用了6种发酵乳酸菌进行玫瑰汁发酵试验。从表3可知，发酵菌种不同，发酵48h后，发酵液总酸、功能性物质氨基丁酸的产生量相差较大，发酵液口感也不尽相同。从总酸生成看，植物乳杆菌发酵产酸最高，达到2.31％，其次是发酵乳杆菌。从产生功能性物质氨基丁酸看，鼠李糖乳杆菌最高，达到1.32g/l，其次是发酵乳杆菌，为1.02g/l。从口感分析，植物乳杆菌发酵的玫瑰汁酸味最浓，发酵乳杆菌发酵的汁液有一定的醇厚感。鉴于此，本研究选用植物乳杆菌、发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌三种乳酸菌，将其混合，总接种量控制在5％，对玫瑰汁进行乳酸发酵，结果表明发酵效果很好，最终发酵液酸度达到2.34％，氨基丁酸达1.29g/l。
4、发酵工艺顺序对玫瑰汁乳酸发酵的影响
多菌种复合发酵玫瑰汁主要发酵工艺是乳酸发酵和酒精发酵。酒精发酵工艺在前，还是乳酸发酵工艺在前，严重影响发酵产品的质量和口感。本发明在实验室进行了如下试验，试验设计和试验结果见表4。
表4发酵工艺对乳酸发酵的影响
乳酸发酵是影响玫瑰酵素质量的关键加工工序，通过乳酸发酵可以产生氨基丁酸等功能性成分，其次乳酸发酵的酵素风味醇厚，诸味协调，最后先乳酸发酵，随后酒精发酵和醋酸发酵的玫瑰酵素，在最终总酸变化不大的情况下，因乳酸发酵转化了一部分糖，酒精和醋酸的产生相对减少，使其发酵品酸味适中，减少尖酸和刺激感。试验如表4所示，先乳酸发酵后酒精发酵的发酵液产生乳酸较高，总酸达2.36％，酒精度适中，氨基丁酸为1.31g/l。若先酒精发酵后乳酸发酵，乳酸生成量很少，酒精度较高，氨基丁酸未检测到。若发酵液酒精发酵和乳酸发酵同时进行，其发酵效果基本与2号处理相近。说明玫瑰汁发酵中，酒精发酵有抑制乳酸发酵的作用，可能是酵母菌在发酵液中更易生长，产生的酒精对乳酸菌有抑制作用。因此玫瑰汁多菌种复合发酵时，必须先进行乳酸发酵，在进行酒精发酵，否则乳酸发酵可能失败。
5、醋酸发酵方式对玫瑰酵素产酸影响
醋酸发酵的目的是将玫瑰发酵液中的酒精进一步通过醋酸菌转化为醋酸，一方面增加酵素的酸度，使其最终产品的口感改良，酸度增加可起到杀菌防腐作用，另一方面，由于糖转化为酒精、酒精转化为醋酸，使其产品的稳定性增强。液态醋酸发酵方式一般有液态深层通气发酵和表面静态发酵法两大类。试验4先乳酸发酵后酒精发酵的发酵液，用没有经发酵的玫瑰提取汁调整酒度至6％，再加入作为种子的上一批醋酸发酵旺盛的发酵液，二者的混合比例按重量比3:1配比。利用小型醋酸发酵罐进行试验，试验设计和测定结果见表5。
表5醋酸发酵方式对玫瑰酵素产酸影响
从表5可知，通过不通气自然静置发酵，间隔通气和通气深层发酵三种发酵方式相比较，三种发酵方式最终发酵液中通气发酵的酒精残留量相对较低，三种方式的发酵液总酸基本相同，说明三种发酵方式均能将酒精转化为醋酸。从发酵时间观察，表面静态自然发酵醋酸发酵缓慢，需经过125d才能将发酵液中酒精下降为1％以下，醋酸发酵最快的是不间断通气发酵，只需5d即可将发酵液酒精转化为需要的醋酸，间隔通气需要15d，但从最终发酵液玫瑰香气存留量看，通气发酵的发酵液中玫瑰香气损失严重，而表面静态发酵和间隔少量通气的发酵液玫瑰香味浓郁，仍很好的保存了香气物质。鉴于此，本发明采用间隔通气进行玫瑰发酵液醋酸发酵。