本发明涉及一种混菌分段发酵余甘子酵素产品的制备工艺及制备的酵素产品，属于果蔬发酵产品技术领域。
背景技术：
食用酵素是以动物、植物、食用菌等为原料，经微生物发酵制得的含有多酚、黄酮、功能性糖、多肽、氨基酸、有机酸、维生素、益生菌及/或功效酶等多种健康有益成分的固态或液态发酵食品。不同原料及不同发酵工艺而得到的酵素其健康功能的侧重点也不尽相同，这些健康功能主要包括清热祛痰、止咳润肺、美容养颜、解酒护肝、改善食欲、改善记忆、促进心血管健康、提高免疫力等。
将水果加工成食用酵素是增加水果附加值的一种有效途径。余甘子又名油柑子，广泛分布于(亚)热带，在中国主要分布于云南、福建、两广和海南等几个省区。1998年余甘子被国家卫生部列入首批药食兼用名单。余甘子性凉，味甘、酸、苦、涩，含有多种有益成分，现代研究表明余甘子具有抗氧化、抗菌、抗病毒、降血脂、抗肿瘤、抗诱变突变等生理和药用功能，且无明显的毒副作用。
然而，余甘子生食口感不佳，也不耐储藏，每年大量的余甘子被浪费。因此，为了更好地利用余甘子，许多公司开始尝试使用余甘子进行发酵等加工。由于余甘子的发酵加工难度较大，障碍多，目前，市面上余甘子的加工产品还很少。
现有公开的余甘子酵素生产技术主要包括两类：(1)单一水果余甘子酵素，例如中国专利申请107668683a；和(2)复合水果余甘子发酵，例如中国专利申请105146520a，但目前这两种产品公开的发酵技术都具有超声波耗能、设备工艺复杂、易染菌、发酵时间漫长等缺点。
因此，余甘子酵素产品的开发利用有很大的空间。
技术实现要素：
针对余甘子的食用、功能、储藏、加工现状等特性及现有余甘子酵素技术存在的不足，本发明提供一种混菌分段发酵余甘子酵素产品的制备工艺及制备的酵素产品，发酵周期短，耗能低，成本低，酵素得率高，易于产业化。
本发明通过以下方案达到上述目的：
发明人通过研究现有技术以及反复试验发现，现有的余甘子酵素生产存在以下3个方面的主要瓶颈：1、现有的余甘子酵素生产技术存在人工或机器去核打浆的步骤，这一步骤一方面增加了生产成本，另一方面容易引入杂菌污染；2、现有的技术都需要采用超声波处理，这一方面增加了设备、增加了能耗、增加了生产流程，导致生产成本增加，另一方面，还限制了产量的扩大化。而且，现有的技术，如中国专利申请107668683a中，其中的“超声波处理”还存在明显的科学性问题，即，其采用300w超声波处理清洗干燥后的余甘子3分钟以消毒，而紧接着却又采用人工或机器对余甘子进行脱核(原文为壳)打浆，这样的工艺使得超声波消毒失去了意义。因为超声波消毒要求被处理的物品处于被液体淹没的状态，否则，超声波就不能对表面干燥的物品进行消毒。而在中国专利申请107668683a中都是对干燥的余甘子直接进行超声波消毒的，所以这个消毒步骤实际上是存在科学问题的，而在中国专利申请105146520a中，在发酵之前也采用了超声波处理以辅助酶制剂酶解原料-水混合浆液(1:2)，其中超声功率为860w，超声时间300min，ph4.5，超声温度50℃。这样的生产工艺，必然会因为能耗、超声设备、酶制剂、生产流程增加等而导致成本增加，同时，超声波处理量的限制必然会导致酵素的生产量受限；3、现有有的余甘子生产技术的发酵时间都特别漫长，分别为615天和390天，这大大降低了余甘子酵素的生产效率。另外，现有技术中，中国专利申请105146520a中采用pe桶作为长时间(550天)的发酵容器，存在pe塑料桶中的有害物质转移到发酵液中的安全隐患，容易导致余甘子酵素品质下降甚至是产品不安全的问题。
因此，发明人针对现有余甘子酵素生产技术中存在的超声波耗能、去核打浆易污染、酶制剂成本高、发酵时间长、产业化生产受限制等缺点，发明人采用水果浅表割破处理代替去核打浆，使用多种微生物分段发酵，开发出一种节能高效的混菌种分段发酵的余甘子酵素产品的制备工艺，具有节能、发酵时间短，生产成本低、酵素得率高、易于产业化等显著优点。其中，水果的浅表切割处理可以提升了酵素的品质及得率，而霉菌有氧预发酵、耐高糖酵母的添加及超滤膜滤过洁净水的采用等工艺使得发酵周期大量缩短，同时，也极大地提高了酵素的理化品质、感官品质及得率。
在本发明的第一方面，提供一种混菌分段发酵余甘子酵素产品的制备工艺，包括：
(1)原料选择及清洗：选择余甘子为主要原料而其他水果为辅助原料，其中，以重量百分比计，余甘子为65％-100％，将原料清洗后晾干或吹干表面水分；
(2)水果浅表切割处理：将水果进行浅表切割，果肉切割深度为1.5-2mm，切割的原则是不破坏果核；
(3)预发酵：将切割过的水果原料转移到发酵罐中，接入原料重量1％的米曲霉液态菌种及1％的黑曲霉液态菌种，搅拌均匀，向发酵罐中通入无菌空气，在24-28℃搅拌发酵30-48小时，通过测量游离氨基酸及游离多酚的含量来判断发酵终点；
(4)主发酵：向发酵罐中加入原料重量20％-30％的食用白糖、和/或黄糖和/或红糖以及70％-80％的经过超微滤膜过滤的洁净水，拌匀，接种原料重量5-8％的液态乳酸菌菌种及2％液态酵母菌菌种，拌匀，22-25℃，静置厌氧发酵80-110天，以游离氨基酸及游离多酚为指标判断发酵终点；
(5)粗过滤：将发酵混合物经过不锈钢管道由气压推送板框式压滤机压滤得到粗滤液；
(6)制备酵素产品：取粗滤液经过0.05-1微米的中空纤维滤膜过滤后，得到余甘子酵素产品。
优选的，在步骤(5)粗过滤后，还包括粗滤渣的浸淋：采用滤渣重量的3倍的洁净水，分3次对粗滤渣进行浸淋、压滤，得到酵素浸出液。
其中，所得的酵素浸出液可以转入不锈钢罐或桶中，于10-13℃暂时保存，24小时内使用。
其中，上述浸淋后所得的终滤渣，可以用于动物饲料辅料或者用于有机肥料的原料。
优选的，所述步骤(6)的制备酵素产品还可以采用：取酵素粗滤液及酵素浸出液按1:3-4的比例混合均匀后，再经过0.05-0.1微米的中空纤维超滤膜过滤，则得到余甘子酵素饮料产品。
其中，上述两种方法制备的酵素产品都具有多种活性成分，具有生津止渴、清火利咽、提高免疫力、抗疲劳等健康功效，其中未经酵素浸出液稀释的酵素产品是酵素口服液，而经过酵素浸出液稀释的酵素产品是酵素饮料。
优选地，步骤(1)中的其他水果包括但不限于雪梨、棠梨。
优选地，步骤(1)中的其他水果包括但不限于浆果类水果例如覆盆子、五味子、枸杞子。
优选地，步骤(1)中，所述余甘子为新鲜的、无腐烂、无霉变的余甘子。
其中，步骤(2)中，水果浅表切割的要求是：使果核不会被切割到，通过切割水果浅表部位，不仅能加速后续发酵(相对于不切割而言)而且可以免除将余甘子或辅料水果去核打浆的步骤，具有节能且降低污染的特点。
在步骤(2)中，将表面干燥的余甘子，采用刀片高度可调的清洁的切割机对余甘子或其他需要进行表皮割破的辅料水果进行浅表切割，调节刀片高度。
其中，步骤(2)中，对于浆果类水果不需要浅表切割。
优选的，在步骤(3)中，发酵终点是以游离氨基酸及游离多酚测定值在12小时内的增加量小于10％为发酵终点。
优选地，步骤(3)的发酵罐为不锈钢发酵罐。
优选地，所述步骤(3)中，发酵罐为可温控的(10-100℃)、具有搅拌功能的、可密封的、发酵罐盖子上具有通气及排气孔的、带夹层不锈钢发酵罐。
优选地，所述步骤(3)中，所述黑曲霉菌种的制备方法包括：采用土豆-葡萄糖液态培养基，通气培养24-36小时液态黑曲霉菌种。此时的黑曲霉菌种处于旺盛生产阶段。
上述土豆-葡萄糖液态培养基的制备方法包括：以重量百分比计，去皮土豆20％、葡萄糖2％，其余为水，100℃煮沸10分钟，过滤，滤液经121℃灭菌15分钟。
优选的，步骤(4)中，发酵终点判定是以游离氨基酸及游离多酚测定值在3天内(72小时)的增加量小于10％为发酵终点。
优选地，所述步骤(3)中，游离氨基酸含量的测定方法采用茚三酮比色法测定，以亮氨酸作标准曲线：y＝7.2366x-0.0197，r2＝0.9991。
优选地，所述步骤(3)中，游离多酚的检测方法为：采用福林酚法测定游离多酚，以没食子酸作标准曲线回归方程：y＝34.149x+0.0135，r2＝0.9991。
优选地，所述步骤(4)中，所用的洁净水为经过熔喷式pp棉滤芯、超微滤膜(0.1-1微米)滤芯、椰壳活性炭滤芯、除重金属滤芯、超微滤膜(0.1-1微米)滤芯共计5级滤芯而净化所得的水。
上述净化所得的水是含有矿泉水中所含有的钙、镁、铁等矿物质，不含泥沙、铁锈、铜锈、不含次氯酸、不含细菌的健康有营养的水，可以加速酵素的发酵，也可以使得所制备的酵素营养更丰富、口感更优。
优选地，所述步骤(4)中，所采用的液体乳酸菌菌种为一种或几种乳酸菌的液态培养液，所采用的乳酸菌包括嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌，菌种添加量比例为3-1:5:1-3:0-1(液态菌种体积比)。
优选地，所接种的液态乳酸菌的制备方法为：向乳酸菌液态培养基接种乳酸菌，在28-33℃搅拌培养18-24小时，使乳酸菌的浓度达到每毫升107个。
其中，上述乳酸菌液态培养基组成为蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，蔗糖2％，葡萄糖0.5％，乙酸钠0.5％，k2hpo40.2％，mgso40.1％，caco30.3％；
优选地，所述步骤(4)中，所采用的酵母菌菌种为液态耐高糖酿酒酵母菌菌种，添加量为2％。
优选地，所接种的液态酿酒酵母菌菌种的制备方法为：向酵母液态培养基接种耐高糖度酿酒酵母菌，在22-25℃搅拌培养18-24小时，使酵母菌的浓度达到每毫升107个。
其中，酵母液态培养基为改良ypd培养基，其组成为蛋白胨2％，酵母提取物1％，蔗糖4％，葡萄糖2％，氯化钠0.2％，k2hpo40.2％，mgso40.1％。
优选地，所述步骤(4)中，乳酸菌液态菌种的接种量为5-8％，酵母菌的接种量为2％，厌氧发酵80-110天。
其中，步骤(5)中，压滤机采用的最大压力不超过0.3mpa。
其中，步骤(5)的粗滤液放入不锈钢存储罐，于15-18℃存储。
优选地，所述步骤(5)中，板框式压滤机的滤布为涤纶，滤布的滤孔直径为130-180目。
优选地，所述步骤(6)中，所采用的中空纤维滤膜的孔径为0.05-0.1微米。
在本发明的第二方面，提供一种上述制备工艺制备得到的余甘子酵素产品。
所述余甘子酵素产品包括酵素口服液和酵素饮料。
经试验证实，本发明的制备工艺制备得到的酵素口服液产品含游离氨基酸大于1.2mg/ml、游离多酚大于2.0mg/ml，维生素c大于1.6mg/g，粗蛋白质大于10.0mg/ml。并含有多种活性酶、多肽、寡肽、功能性寡糖、维生素及矿物质元素等营养成分；所得酵素饮料产品含游离氨基酸大于0.3mg/ml、游离多酚大于0.5mg/ml，维生素c大于0.4mg/g，粗蛋白质大于2.0mg/ml。并含有多种活性酶类、多肽、功能性寡糖、维生素及矿物质元素等。
与现有技术相比，本发明的有益方面表现在：
1、本发明不需要对余甘子进行去核打浆，而仅对整果进行浅表切割处理，样品损失少，设备简易、效率高，因而，减少了工艺步骤，减少了污染的机会，降低了生产成本，同时还提高了原料的利用率，提高了产品的营养价值。
2、本发明没有采用超声波杀菌或超声波酶解余甘子果浆工艺，因此，既节省了成本，也不会限制余甘子酵素的工业化生产时的投产量。
3、本发明采用自余甘子表皮中分离得到的黑曲霉活菌进行预发酵，相比于3种酶制剂酶解工艺而言，不仅节约了成本，而且由于黑曲霉的所产生的酶的种类齐全、活性高，因此，加速了余甘子果胶、纤维素、蛋白质、多糖及多酚的酶解反应，而且也丰富了余甘子酵素产品的风味。
4、本发明采用了经过多级膜过滤的无余氯、无重金属、含有益矿物质的洁净水为发酵用水有利于酵素发酵速度的提高，更重要的是提高了酵素的口感及营养价值。
综上所述，本发明的酵素发酵新制备工艺与现有余甘子酵素生产技术相比，生产同样量的酵素而言，生产设备成本降低30％以上，酵素得率提高8％以上，发酵效率由目前的615天和390天，缩短为80-100天，极大地提高了酵素的产生效率。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明进行进一步的详细说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例，本领域的技术人员根据本发明的内容做出的非本质的改进和调整也属于本发明保护的范围。
实施例1：
1、原料选择(余甘子处理)：挑选新鲜、无腐烂、无霉变的广东省普宁地区余甘子野生小果余甘子50公斤，采用自来水用手工清洗，于阴凉处自然晾干表面水分。
2、余甘子整果切割：将表面干燥的余甘子，采用刀片高度可调的清洁的切割机对余甘子进行余甘子浅表切割，调节刀片高度，使果肉切割深度约1.5-2mm。即刻，将割破表面的余甘子转移到灭过菌的、可温控的、具有搅拌功能的、可密封的、带夹层不锈钢发酵罐中(100l)；该余甘子游离氨基酸及游离多酚的含量分别为2.60mg/g及7.80mg/g。
3、霉菌有氧预发酵：往不锈钢发酵罐中接入相当于余甘子重量1200ml黑曲霉液态菌种和1200ml米曲霉液态菌种，搅拌均匀；向发酵罐中通入无菌空气，在28℃静置发酵32小时，这时测量余甘子游离氨基酸及游离多酚的含量分别为4.16mg/g及9.17mg/g。
4、乳酸菌及酵母菌无氧主发酵：向发酵罐中加入15公斤的韩国产黄砂糖及40l的洁净水，启动发酵罐的拌匀功能，搅拌5分钟，然后接种4l的液态乳酸菌菌种和1l液态酵母菌菌种，其中乳酸菌有三种，且其添加量的比例为嗜酸乳杆菌：双歧杆菌：保加利亚乳杆菌等于2:5:3(液态菌种体积比)，启动发酵罐的拌匀功能，搅拌10分钟，然后停止搅拌，进入无氧发酵的主发酵阶段，在24℃，静置厌氧发酵80天。
5、粗过滤：主发酵结束后，发酵混合物经实验室小型板框式压滤机压滤，滤布的孔径为130-180目，得粗滤液73.2l，得率为146.4％，转入不锈钢容器中，于15-16℃保存。
6、粗滤渣的处理：所得的粗滤渣重量共计36.1公斤，采用108.3l的洁净水，分三次对粗滤渣进行浸淋、过滤，得酵素浸出液109.0l，于10-13℃保存于不锈钢容器中，备用。
7、余甘子酵素饮料的制备：取36.33l的粗滤液与109.0l的酵素浸出液进行混合均匀，再经0.05-0.1微米的中空显微滤膜过滤，得到余甘子发酵酵素饮料144.8l，得率为289.6％，(与水果总原料的重量相比)，经无菌灌装，即得余甘子酵素饮料产品。所得酵素饮料含游离氨基酸0.58mg/ml、游离多酚0.93mg/ml，维生素c0.81mg/g，蛋白质3.0mg/ml，并含有多种余甘子及微生物活性酶、多肽、功能性寡糖、维生素及矿物质元素等，该饮料具有生津止渴、促进食欲、提高免疫力、抗疲劳等保健作用。
8、余甘子酵素口服液的制备：剩余37.2l的余甘子粗滤液经0.1-1微米的中空显微滤膜过滤，得到余甘子发酵酵素口服液约36.4l，得率为72.8％，(与水果总原料的重量相比)。经无菌灌装，即得余甘子酵素口服液产品。该工艺生产的余甘子酵素口服液含游离氨基酸2.30mg/ml、游离多酚3.70mg/ml，维生素c3.26mg/g，蛋白质12.0mg/ml，另含有多种活性酶、多肽、寡肽、功能性寡糖、维生素及矿物质元素等营养成分。该饮料具有生津止渴、促进食欲、提高免疫力、抗疲劳等保健作用。
实施例2：
1、余甘子、雪梨处理：挑选新鲜、无腐烂、无霉变的广东省普宁地区余甘子野生小果余甘子30公斤，雪梨20公斤，采用自来水用手工清洗，于阴凉处自然晾干表面水分。
2、余甘子、雪梨整果浅割处理：将表面干燥的余甘子、雪梨，采用刀片高度可调的清洁的切割机对余甘子进行表面切割，调节刀片高度，使果肉切割深度约1.5-2mm。即刻，将割破表面的余甘子转移到灭过菌的、可温控的、具有搅拌功能的、可密封的、带夹层不锈钢发酵罐中(100l)；余甘子、雪梨(3:2)混匀后，测得游离氨基酸及游离多酚的含量分别为1.77mg/g及5.30mg/g。
3、预发酵：往不锈钢发酵罐中接入相当于余甘子重量1000ml黑曲霉液态菌种和1000ml米曲霉液态菌种，搅拌均匀；向发酵罐中通入无菌空气，在22℃静置发酵48小时，这时测量余甘子游离氨基酸及游离多酚的含量分别为2.88mg/g及6.21mg/g。
4、主发酵：向发酵罐中加入14公斤的韩国产黄砂糖及38l的洁净水，启动发酵罐的拌匀功能，搅拌5分钟，然后接种5l的液态乳酸菌菌种和1l液态酵母菌菌种，其中乳酸菌有四种，且其添加量的比例为嗜酸乳杆菌：双歧杆菌：保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌等于1:5:3:1(液态菌种体积比)，启动发酵罐的拌匀功能，搅拌10分钟，然后停止搅拌，进入无氧发酵的主发酵阶段，在22℃，静置厌氧发酵90天。
5、粗过滤：主发酵结束后，发酵混合物经实验室小型板框式压滤机压滤，滤布的孔径为130-180目，得粗滤液74.5l，得率为149％，转入不锈钢容器中，于15-16℃保存。
6、粗滤渣的处理：所得的粗滤渣重量共计34.1公斤，采用102.3l的洁净水，分三次对粗滤渣进行浸淋、过滤，得酵素浸出液102.6l，于10-13℃保存于不锈钢容器中，备用。
7、余甘子酵素饮料的制备：取34.2l的粗滤液与102.6l的酵素浸出液进行混合均匀，再经0.05-0.1微米的中空显微滤膜过滤，得到余甘子发酵酵素饮料135.3l，得率为270.6％，(与水果总原料的重量相比)经无菌灌装，即得余甘子酵素饮料产品。所得酵素饮料含游离氨基酸0.37mg/ml、游离多酚0.62mg/ml，维生素c0.69mg/g，蛋白质2.81mg/ml，并含有多种余甘子及微生物活性酶、多肽、功能性寡糖、维生素及矿物质元素等，该饮料具有生津止渴、清热去火、促进食欲、提高免疫力、抗疲劳，美白等保健作用。
8、余甘子酵素口服液的制备：剩余40.3l的余甘子粗滤液经0.1-1微米的中空显微滤膜过滤，得到余甘子发酵酵素口服液约38.8l，得率为77.6％，(与水果总原料的重量相比)。经无菌灌装，得余甘子酵素口服液产品。该工艺生产的余甘子酵素口服液含游离氨基酸1.56mg/ml、游离多酚2.48mg/ml，维生素c1.97mg/g，蛋白质10.59mg/ml，另含有多种活性酶、多肽、寡肽、功能性寡糖、维生素及矿物质元素等营养成分。该饮料具有生津止渴、清热利咽、促进食欲、提高免疫力、抗疲劳，美白等保健作用。
实施例3：
1、余甘子、棠梨清洗：挑选新鲜、无腐烂、无霉变的广东普宁地区野生小果余甘子500公斤，梅州地区的野生棠梨果100公斤，采用自来水及鼓风式清洗机(清洗量0.5t/h)进行清洗,然后，采用鼓风机干燥机吹干水果的表面水分。
2、余甘、棠梨的表皮浅割处理：采用刀片高度可调的清洁的切割机对余甘子、糖类梨进行果皮切割处理，调节刀片高度，使果肉切割深度约1.5-2mm。即刻，将割破果皮的余甘子、棠梨转移到灭过菌的、可温控的、具有搅拌功能的、可密封的、带夹层不锈钢发酵罐中(1200l)；余甘子、棠梨(5:1)混匀后，测得游离氨基酸及游离多酚的含量分别为2.87mg/g及9.30mg/g。
3、预发酵：往不锈钢发酵罐中接入相当于余甘子重量18l黑曲霉液态菌种和18l米曲霉液体菌种，搅拌均匀；向发酵罐中通入无菌空气，在28℃静置发酵40小时，这时测得平均游离氨基酸及游离多酚的含量分别为3.28mg/g及10.62mg/g。
4、主发酵：向发酵罐中加入120公斤的国产白砂糖及480升的洁净水，启动发酵罐的拌匀功能，搅拌10分钟，然后接种40l的液态乳酸菌菌种及12l液态酵母菌菌种，其中乳酸菌有4种，且其添加量的比例为嗜酸乳杆菌：双歧杆菌：保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌等于3:5:1:1(液态菌种体积比)，启动发酵罐的拌匀功能，搅拌15分钟，然后停止搅拌，进入无氧发酵的主发酵阶段，在26℃，静置厌氧发酵90天。
5、粗过滤：主发酵结束后，发酵混合物经实验室小型板框式压滤机压滤，滤布的孔径为130-180目，得粗滤液875.0l，得率为145.8％，(与水果总原料的重量相比)转入不锈钢容器中，于15-16℃保存。
6、粗滤渣的处理：所得的粗滤渣重量共计273公斤，采用819l的洁净水，分三次对粗滤渣进行浸淋、过滤，得酵素浸出液834l，于10-13℃保存于不锈钢容器中，备用。
7、余甘子酵素饮料的制备：取278l的粗滤液与834l的酵素浸出液进行混合均匀，再经0.05-0.1微米的中空显微滤膜过滤，得到余甘子发酵酵素饮料1106l，得率为184.3％，(与水果总原料的重量相比)，经无菌灌装，即得余甘子酵素饮料产品。所得酵素饮料含游离氨基酸0.56mg/ml、游离多酚0.98mg/ml，维生素c0.76mg/g，蛋白质2.81mg/ml，并含有多种余甘子及微生物活性酶、多肽、功能性寡糖、维生素及矿物质元素等，该饮料具有润肺止渴、清热利咽、促进食欲、提高免疫力、抗疲劳，美白等保健作用。
8、余甘子酵素口服液的制备：剩余597l的余甘子粗滤液经0.1-1微米的中空显微滤膜过滤，得到余甘子发酵酵素口服液约590l，得率为98.3％，(与水果总原料的重量相比)。经无菌灌装，得余甘子酵素口服液产品。该工艺生产的余甘子酵素口服液含游离氨基酸2.26mg/ml、游离多酚3.97mg/ml，维生素c3.06mg/g，蛋白质10.6mg/ml，另含有多种活性酶、多肽、寡肽、功能性寡糖、维生素及矿物质元素等营养成分。该饮料具有润肺止渴、清热利咽、促进食欲、提高免疫力、抗疲劳、美白等保健作用。
试验例1：前发酵曲种对余甘子酵素游离氨基酸和总酚含量的影响
保持发酵原料为普宁余甘子，前发酵36h、主发酵90d、双歧杆菌的接种量为6％，酵母菌的接种量为2％的条件不变，各曲霉的添加量为0.6％的条件下，其他条件与实施例3相似，改变前发酵曲种，测定主发酵90d后的余甘子酵素发酵原液中的游离氨基酸和游离总酚含量，结果见表1。
表1前发酵曲种对余甘子酵素游离氨基酸和游离总酚含量的影响
注：表中同一指标的小写字母不同表示两者差异显著(p<0.05)，每组实验重复3次；发酵容器：1.6l玻璃瓶。
由表1可知，米根霉+黑曲霉发酵得到的余甘子酵素的游离氨基酸含量最高，为2.63mg/ml，显著高于对照组和其他曲种(p<0.05)；在游离总酚含量上，米曲霉+黑曲霉的发酵得到的余甘子酵素最高，为3.87mg/ml，与其他组之间均差异显著(p<0.05)。因此，米曲霉+黑曲霉的发酵效果最好，确定为最佳的发酵曲种。
试验例2：前发酵时间对余甘子酵素游离氨基酸和总酚含量的影响
保持发酵原料为普宁余甘子，米曲霉+黑曲霉，菌种添加量为0.6％，主发酵90d、双歧杆菌的接种量为6％，酵母菌的接种量为2％的条件不变，其他条件与实施例2相似，改变前发酵时间，测定主发酵90d后的余甘子酵素发酵原液中游离氨基酸和游离总酚含量，结果如表2所示。
表2前发酵时间对余甘子酵素原液中游离氨基酸和游离总酚含量的影响
注：表中同一指标的小写字母不同表示两者差异显著(p<0.05)，每组实验重复3次；发酵容器：1.6l玻璃瓶。
由表2可知，酵素原液中游离氨基酸含量和总酚含量随着前发酵时间的变化趋势均为先上升后下降，余甘子酵素在前发酵为48h，再经过主发酵90d后，其酵素发酵原液中的游离氨基酸和游离总酚含量分别达到最高值2.73mg/ml和3.86mg/ml。
试验例3：耐高糖酵母菌的添加对总发酵时间的影响
保持发酵原料为普宁余甘子，前发酵菌种为米曲霉和黑曲霉，菌种添加量分别为0.6％，前发酵时间48小时，前发酵结束后，接种双歧杆菌液态菌种，接种量为6％，考察耐高糖酵母菌添加量对总发酵时间的影响，以游离氨基酸及游离总酚为考察指标。结果见表3。
表3发酵曲种对余甘子酵素游离氨基酸和游离总酚含量的影响
注：表中同一指标的小写字母不同表示两者差异显著(p<0.05)，每组实验重复3次；发酵容器：1.6l玻璃瓶。
由表3可知，添加酵母具有加速酵素发酵的作用，且耐高糖酵母的促进作用比普通安琪酵母的促进作用强，添加量以2％的液态菌种效果最好。
以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。