本发明涉及一种杏鲍菇多糖的制备方法，属于食品、医药领域，也可以归入食用菌深加工技术领域。
背景技术：
杏鲍菇（pleurotuseryngiiquel）别名剌芹侧耳，隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，是近年来开发栽培成功的集食用、药用、食疗于一体的珍稀食用菌新品种。目前，国内杏鲍菇已实现工厂化栽培，成为老百姓餐桌上的一种常见菜肴。杏鲍菇栽培和加工过程会产生大量的副产物（如畸形菇、菇头等），其产量可达总生物量的20%以上，因为菇头形状各异并且容易夹带不可食用的栽培料，常常无法作为商品进行销售而丢弃。尽管如此，数量巨大的杏鲍菇菇头仍可作为杏鲍菇多糖的制备原料，具有良好的开发前景。另一方面，大量研究表明，杏鲍菇多糖具有抗肿瘤、抗氧化、抑菌、降血脂、降血脂、降胆固醇、抗疲劳、抗衰老等多种生物活性，具有较高的开发利用价值。
杏鲍菇多糖通常采用常压沸水法提取。然而，采用这种方法得到的杏鲍菇水提物中的多糖含量通常低于20%，蛋白质杂质含量通常高于20%，非多糖碳水化合物（即：单糖和低聚糖）杂质含量可达50%以上，并且加热蒸煮后的异味浓重，影响后续的产品应用，因此需要进一步提纯才能成为杏鲍菇多糖产品。
杏鲍菇沸水水提物中的非多糖成分有：大分子量的蛋白质和其他小分子（无机盐、单糖、色素、脂肪等）。其中，海藻糖杂质含量可占水提取物的50%左右，蛋白质含量为20%左右。这些小分子物质大多溶于水，可以通过水洗从残渣中除去，而大多数不溶性蛋白质也可以先用蛋白酶酶解转化成小分子氨基酸和肽，而后通过水洗从残渣中除去。由于不同种类蛋白酶的酶切位置不同，所以采用单一蛋白酶往往无法获得较高的水解度，实践中往往采用多种蛋白酶组合水解蛋白质。
由于常压沸水法提取物中的多糖含量比较低，为进一步提高杏鲍菇多糖含量，需要再利用三倍体积的乙醇沉淀溶液中的多糖和蛋白质，将小分子海藻糖等小分子分离出去，然后用sevag法（即：氯仿-正丁醇法）去除乙醇沉淀物中的蛋白质，进而获得纯度更高的粗多糖产品，以便一进步使用色谱柱提纯多糖或作为多糖保健产品进行销售。但该方法存在明显不足，这主要是因为，乙醇沉淀法和sevag法中使用了大量挥发性可燃有机溶剂，溶剂回收比较困难，成本较高，并且有燃烧和爆炸的风险。
相反，本发明先用酶解水洗法去除杏鲍菇多糖提取原料中的蛋白质和可溶性小分子杂质，然后利用高温裂解作用将杏鲍菇残渣中的不溶性大分子多糖分解为分子量较小的可溶性多糖成分和单糖（其中：葡萄糖占单糖组分的90%以上）而溶出，再经过酒精发酵，将溶液中的单糖转化为可挥发性的酒精，使多糖成分得到富集。本发明过程不使用可溶性有机溶剂，安全环保且成本较低，同样可获得提取物具有较高的多糖纯度。同时，由于经过蛋白质酶解和水洗处理，杏鲍菇提取原料中的蛋白质含量和还原糖含量大大降低，再结合微酸性环境，大大减少了因高温浸提而产生美拉德反应，因此降低了因高温而产生的异味和颜色加深现象。经过酒精发酵，提取液的气滋味也得到较大改善。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有常压沸水提取杏鲍菇多糖技术的不足，是要提供一种改进的杏鲍菇多糖制备方法。与现有的常压沸水提取法结合sevag去蛋白制备技术相比，本发明的多糖制备过程不使用有机溶剂，提取效率更高，且产品同样具有较高的纯度。
为实现上述目的，本发明采用如下技术手段：
一种杏鲍菇多糖的制备方法，首先利用两种以上蛋白酶组合水解杏鲍菇，将杏鲍菇内的不溶性蛋白质水解成可溶性的肽或氨基酸后过滤除去；接着将所得酶解残渣用纯净洗涤数次，洗去蛋白酶解物、海藻糖及其他可溶性的非多糖杂质；然后将水洗残渣置于高压反应釜内，使用加压热水浸提，浸提结束后，将浸提液过滤、收集滤液高压灭菌、接种酒精酵母发酵，先将提取液中的单糖转化为可挥发性酒精，再通过干燥除去酒精，使多糖得到富集，最终获得具有较高纯度并且气味清淡的杏鲍菇粗多糖粉末。
具体包括以下步骤：
（1）蛋白酶组合酶解
将新鲜杏鲍菇或杏鲍菇加工副产物烘干，磨成粉末，以1:10～1:40固液比加水分散，使用1mol/lnaoh或hcl溶液调节分散液的酸碱度至第一种蛋白酶酶解的适宜数值，加入第一种蛋白酶，置于水浴锅中，以适宜的温度酶解，期间不断地滴加1mol/lnaoh溶液，以保持溶液ph值不变，酶解结束后，加热煮沸使蛋白酶灭活；冷却后，使用1mol/lnaoh或hcl溶液调节分散液的酸碱度至第二种蛋白酶酶解的适宜数值，加入第二种蛋白酶酶解，酶解结束后，加热煮沸使蛋白酶灭活；过滤后收集固体残渣，弃去滤液；
（2）水洗
将步骤（1）所得酶解残渣用5～10倍重量的去离子水水洗3～5次，使用滤布过滤后，收集固体残渣，弃去滤液；
（3）加压热水浸提
将步骤（2）所得残渣置于高压反应釜内，加入20倍重量的去离子水，制成分散液，使用1mol/lhcl溶液调节分散液的酸碱度至微酸性，加压浸提，冷却后过滤，得到滤液，弃去残渣；
（4）酒精发酵
将步骤（3）所得清液旋转蒸发，浓缩至固形物含量为6～10wt%，使用1mol/lhcl溶液调整溶液ph值为4.5，无菌条件下接种酿酒酵母，置于32℃恒温培养箱发酵48h，而后离心分离，弃去酵泥，收集上清液；
（5）干燥
用1mol/lnaoh溶液将步骤（4）的发酵上清液的ph值调整为7，而后干燥处理，即获得杏鲍菇粗多糖粉末。
步骤（1）中杏鲍菇粉末为100~200目。
步骤（1）中所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、酸性蛋白酶或胃蛋白酶中的一种。
步骤（3）中浸提工艺参数为：初始ph4～6，浸提温度为155～165℃，浸提时间1～60min。
步骤（4）中接种酿酒酵母浓度为109~1010cfu/ml，接种量为10%～20%，发酵温度为28～32℃，发酵时间为48～72h。
本发明的有益效果在于：
1、采用本发明后，与现有杏鲍菇多糖的制备技术相比，本发明多糖提取得率提高2～4倍；
2、不使用有机溶剂、不产生大量的强酸；具有经济、无毒无害、不会燃烧爆炸的优点；
3、在加压高温条件下，由于多糖在水中的溶解度得到大幅度提高，并且加压高温提取液在冷却至常温过程中，其中高浓度的、处于过饱和状态的多糖仍可保持溶解状态，因此制备得到的加压高温提取液中多糖浓度可高达2%以上，大大高于常压沸水提取液0.3%；因此，提取同样质量多糖所需的水溶液体积大大减少，这极大地降低了后续多糖脱水操作的难度和成本，更容易实现产业化；
4、采用本发明所述的先去蛋白后提取多糖技术后，结合调整溶液酸性环境，由高温产生的美拉德反应得到抑制；杏鲍菇粗多糖制品色泽较浅、异味较轻，具有更为广泛的应用范围。
5、经过酒精发酵，去除了高压提取液中的单糖，不仅使杏鲍菇多糖产品的纯度得到进一步提高，而且产品气滋味得到改善，由“菇”味而产生的异味得到抑制。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
（1）蛋白酶组合酶解
将新鲜杏鲍菇或杏鲍菇加工副产物烘干，磨成粉末，过100目筛，以1:100固液比加水分散，使用1mol/lnaoh溶液调节分散液的酸碱度至ph8，以2%（w:w）比例加入碱性蛋白酶，置于水浴锅中，以55℃酶解2小时，期间不断地滴加1mol/lnaoh溶液，以保持溶液ph值不变，酶解结束后，加热煮沸使蛋白酶灭活。冷却后，使用1mol/lhcl溶液调节分散液的酸碱度至ph6，以1%（w:w）比例加入复合风味蛋白酶酶解，以45℃酶解2小时，酶解结束后，加热煮沸使蛋白酶灭活。过滤后收集固体残渣，弃去滤液；
（2）水洗
将步骤（1）所得酶解残渣用5倍重量的去离子水水洗3次，使用滤布过滤后，收集固体残渣，弃去滤液；
（3）加压热水浸提
将步骤（2）所得残渣置于高压反应釜内，加入20倍重量的去离子水，制成分散液，使用1mol/lhcl溶液调节分散液的酸碱度至ph6，以155℃加压高温浸提，冷却后过滤，得到滤液，弃去残渣；
（4）酒精发酵
将步骤（3）所得清液旋转蒸发，浓缩至固形物含量为6wt%，使用1mol/lhcl溶液调整溶液ph值为4.5，无菌条件下接种酿酒酵母，置于32℃恒温培养箱发酵48h，而后5000rpm离心分离5min，弃去酵泥，收集上清液。
（5）干燥
用1mol/lnaoh溶液将步骤（4）的加压热水浸提液ph值调整为7，再经过冷冻干燥处理，即获得杏鲍菇粗多糖粉末。
采用此法后，能够将杏鲍菇水提物中的多糖含量从常压沸水提取法的20%提高到80%，多糖的提取得率从8%提高到35%（以干制杏鲍菇为原料计），色泽较浅，异味较轻。
实施例2
（1）蛋白酶组合酶解
将新鲜杏鲍菇或杏鲍菇加工副产物烘干，磨成粉末，过200目筛，以1:20固液比加水分散，使用1mol/lnaoh溶液调节分散液的酸碱度至ph7，以2%（w:w）比例，加入中性蛋白酶，置于水浴锅中，以50℃酶解2小时，期间不断地滴加1mol/lnaoh溶液，以保持溶液ph值不变，酶解结束后，加热煮沸使蛋白酶灭活。冷却后，使用1mol/lhcl溶液调节分散液的酸碱度至ph6，再以1.5%（w:w）比例，加入木瓜蛋白酶酶解，50℃酶解2小时，酶解结束后，加热煮沸使蛋白酶灭活。过滤后收集固体残渣，弃去滤液；
（2）水洗
将步骤（1）所得酶解残渣用5～10倍重量的去离子水水洗3～5次，使用滤布过滤后，收集固体残渣，弃去滤液；
（3）加压热水浸提
将步骤（2）所得残渣置于高压反应釜内，加入20倍重量的去离子水，使用1mol/lhcl溶液调节分散液的酸碱度至ph5，以165℃加压高温浸提，冷却后过滤，得到滤液，弃去残渣；
（4）酒精发酵
将步骤（3）所得清液旋转蒸发，浓缩至固形物含量为8wt%，使用1mol/lhcl溶液调整溶液ph值为4.5，无菌条件下接种酿酒酵母，置于32℃恒温培养箱发酵36h，而后5000rpm离心分离10min，弃去酵泥，收集上清液。
（5）干燥
用1mol/lnaoh溶液将步骤（4）的加压热水浸提液ph值调整为7，再经过喷雾干燥处理，即获得杏鲍菇粗多糖粉末。
采用此法后，能够将杏鲍菇水提物中的多糖含量从常压沸水提取法的20%提高到65%，蛋白质杂质含量从20%降低到3.5%，提取多糖的得率从6%提高到38%（以干制杏鲍菇为原料计），色泽较浅，异味较轻。