黄芪提取物在制备淡水鱼抗应激剂中的应用及其制备方法与流程

本发明属于鱼类养殖技术领域，具体涉及一种黄芪提取物在制备淡水鱼抗应激剂中的应用及其制备方法。

背景技术：

高密度集约化是当前水产养殖的重要特征。高密度养殖使投饲量提高，水体中养殖废物增多，使水质变差，表现为水中溶氧量降低，氨氮和亚硝酸盐含量超标。已有报道显示：这些因素会导致鱼的氧化应激损伤，进而降低鱼对饲料的消化吸收，降低鱼的生长和免疫功能，提高鱼的发病率和死亡率。高密度养殖也导致化学消毒剂和杀虫剂的超量使用。硫酸铜为水产养殖中最常使用的金属类消毒杀虫剂之一，其在水中的有效使用浓度一般为0.5～1.0mg/l。已有研究证实，养殖水体使用硫酸铜能诱导鱼的氧化应激进而降低鱼的摄食、消化吸收、生长和免疫功能。敌百虫为水产养殖中最常使用的有机磷类杀虫剂之一，是一种胆碱酯酶抑制剂。敌百虫中毒能导致动物肌肉机能紊乱，而失去平衡。已有报道显示，敌百虫可诱导养殖鱼类发生氧化应激并对鱼的消化吸收、呼吸和免疫功能造成不利影响。当鱼类受到这些应激因子的刺激时，副肾皮质肥大，体内糖皮质激素和甾类皮质激素等水平上升，由此引起血淋巴细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞和溶菌酶的活性急剧下降，动物的免疫系统受到抑制；从而导致鱼的发病率和死亡率升高，化学药品使用量增加，鱼肉药物残留升高，严重影响了养殖的经济效益和生态效益。

黄芪(astragalusmembranaceus(fisch.)bunge.)是药食两用植物，作为传统中药组方中的重要成分有上千年的使用历史。在我国，黄芪资源丰富，但利用并不充分，例如入药黄芪加工过程中产生的下脚料，黄芪须和黄芪渣以及非道地黄芪等，利用十分有限。开发黄芪新用途，改善传统的黄芪利用结构，发挥黄芪的综合利用潜力，提高黄芪经济和社会效益，具有十分重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种利用黄芪提取物抑制淡水鱼养殖应激的方法及饲料和饲料制备方法。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

黄芪提取物在制备淡水鱼抗应激剂中的应用。现代药学研究结果显示，黄芪具有多种药理活性，具有清除体内和细胞ros的功能。我们前期的研究显示，黄芪提取物能较好的抑制饲料的脂质氧化。试验发现，黄芪提取物具有抗鱼应激的功能，但目前没有用黄芪提取物作为鱼抗应激剂的报道。

具体地，将黄芪提取物添加到饲料中使用，添加后黄芪提取物与饲料总量的质量比例为4.79～7.00‰。将黄芪提取物作为抗应激剂应用在饲料中，抑制淡水鱼养殖应激反应，降低高密度、硫酸铜和敌百虫等应激因素的影响，降低其发病率和死亡率，同时开发黄芪新用途，有效利用了黄芪资源。

进一步地，所述黄芪提取物为黄芪乙酸乙酯提取物。

一种黄芪提取物的制备方法，包括下述步骤：

1)将黄芪的根烘干、粉碎、过40目筛，将黄芪粉末与环己烷按质量比1：7～9的比例混合，700～900r/min搅拌提取5～7h后过滤得滤液和滤渣；

2)将步骤1)所得滤渣与乙酸乙酯按质量比1：7～9的比例混合，700～900r/min搅拌提取5～7h后过滤得滤液和滤渣；将所得滤液减压蒸馏至恒重，制得黄芪乙酸乙酯提取物。

进一步地，所述步骤1)中，将所得滤渣按照黄芪粉末与环己烷的混合比例和提取方法，再重复提取1～2次。该方法能够大大降低下一步骤所得的黄芪乙酸乙酯提取物中的低极性提取成分，提高提取活性成分的纯度。

所述步骤2)中，将所得滤渣按照步骤1)所得滤渣与乙酸乙酯的混合比例和提取方法，再重复提取1～2次，合并滤液，将所得滤液减压蒸馏至恒重，制得黄芪乙酸乙酯提取物。该方法能够进一步提高提取活性成分的纯度，提取效果更好。

一种淡水鱼抗应激剂，包括上述黄芪提取物或上述制备方法所得的黄芪乙酸乙酯提取物。

一种饲料，包括基础饲料、上述黄芪提取物或上述制备方法所得的黄芪乙酸乙酯提取物。

具体地，所述基础饲料包括以下重量份组分：鱼粉23.00～25.00份、豆粕31.00～33.00份、dl-蛋氨酸0.60～0.80份、面粉36.00～38.00份、鱼油1.30～1.50份、葵花籽油1.70～1.90份、维生素添加剂0.50～1.00份和矿物质添加剂0.50～1.00份。

饲料中，黄芪提取物占饲料总重量的4.79～7.00‰，5.23‰为最佳用量。

其中，维生素添加剂包括以下重量份组分：视黄醇0.80份、维生素d30.48份、dl-α-生育酚20.00份、维生素k30.43份、维生素b10.11份、核黄素0.63份、吡哆醇0.92份、氰钴胺0.10份、d-泛酸钙2.73份、烟酸2.82份、d-生物素5.00份、肌醇52.33份和叶酸0.52份。

矿物质添加剂包括以下重量份组分：feso4·7h2o69.70份、cuso4·5h2o1.20份、znso4·7h2o21.64份、mnso4·h2o4.09份、na2seo3·5h2o2.50份和ki2.90份。

上述饲料的制备方法，包括以下步骤：

将黄芪提取物溶于基础饲料的油脂中，然后与基础饲料混匀，制粒，制得。基础饲料的油脂为鱼油、葵花籽油、大豆油、玉米油、菜籽油、花生油等油脂中的一种或多种构成。

综上所述，本发明具有以下优点：

1.本发明在鱼饲料中添加黄芪提取物作为鱼抗应激剂，抑制养殖高密度、硫酸铜和敌百虫对淡水鱼产生的应激反应，提高淡水鱼的抗应激能力，抑制淡水鱼侧翻，使其摄食量和增重恢复，提高淡水鱼养殖的经济效益。

2.本发明确定了黄芪乙酸乙酯提取物在抗应激饲料中的最佳添加量为5.23g/kg，其中，抗养殖高密度、硫酸铜和敌百虫应激效果最佳的黄芪乙酸乙酯提取物浓度分别为5.23g/kg、4.79g/kg和5.12g/kg。

3.本发明提供了黄芪提取物的提取方法，采用了二步提取，先使用环己烷进行初步提取，再使用乙酸乙酯进一步提取，获得黄芪乙酸乙酯提取物；大大降低了黄芪乙酸乙酯提取物中的低极性提取成分，提取活性成分纯度高，提取效果好。

4.本发明确定了黄芪提取物中抗淡水鱼养殖应激的活性成分为黄酮类化合物，黄芪提取物的螯合金属离子(mca)、恢复鲫鱼摄食和提高其肠道抗超氧阴离子活性(asa)和抗羟自由基活性(ahr)及降低其肠道丙二醛(mda)含量的作用与其黄酮类物质含量存在密切关系，其抗应激的机制是黄酮类物质提高了机体抗氧化功能。其中，黄芪乙酸乙酯提取物的黄酮含量最高，为40.36～43.66g/kg。

5.本发明提供了将黄芪提取物做为淡水鱼抗应激剂添加到饲料中的方法，即通过将其溶解到鱼油、大豆油、玉米油、菜籽油、花生油和/或葵花籽油等油脂中，然后再和其他原料混合、制粒，得到；有效利用了黄芪资源，丰富了黄芪的用途，提高了其经济利用价值。

附图说明

图1为不同极性黄芪提取物体外螯合金属离子活性(mca)和投喂后鲫鱼摄食恢复率示意图；

图2为不同极性黄芪提取物黄酮类含量与其螯合金属离子活性(mca)和鲫鱼摄食恢复率关系示意图；

图3为养殖密度对鲫鱼增重影响的示意图；

图4为养殖密度对鲫鱼饲料效率影响的示意图；

图5为养殖密度对鲫鱼死亡率影响的示意图；

图6为投喂不同极性黄芪提取物的鲫鱼肠道抗超氧阴离子活性(asa)、抗羟自由基活性(ahr)和丙二醛(mda)含量的示意图；

图7为黄芪各提取物黄酮类含量与鲫鱼肠道抗超氧阴离子活性(asa)、抗羟自由基活性(ahr)和丙二醛(mda)含量的关系图；

图8为投喂黄芪乙酸乙酯提取物60天，鲫增重恢复率折线回归分析示意图；

图9为水中不同硫酸铜含量对鲤鱼摄食率的影响示意图；

图10为水中不同硫酸铜含量对鲤鱼死亡率的影响示意图；

图11为水中不同敌百虫含量对鲤鱼侧翻率的影响示意图；

图12为水中不同敌百虫含量对鲤鱼死亡率的影响示意图；

图13为投喂黄芪乙酸乙酯提取物30天，硫酸铜应激后鲤摄食恢复率折线回归分析示意图；

图14为投喂黄芪乙酸乙酯提取物30天，敌百虫应激后鲤侧翻抑制率折线回归分析示意图。

具体实施方式

实施例1

黄芪提取物，其制备方法如下：

(1)将1000g黄芪在50℃鼓风干燥箱内干燥至恒重，粉碎过40目筛，获得黄芪粉末；

(2)取黄芪粉末400g，按黄芪粉末与环己烷1:9的比例混合，800r/min搅拌6h，过滤后获得澄清滤液和残渣，将残渣再重复提取2次，合并3次提取的滤液；

(3)将步骤(2)所得滤液减压蒸馏至恒重除去环己烷，获得黄芪环己烷提取物。

实施例2

黄芪提取物，其制备方法如下：

(1)将1000g黄芪在50℃鼓风干燥箱内干燥至恒重，粉碎过40目筛，获得黄芪粉末；

(2)取黄芪粉末400g，按黄芪粉末与环己烷1:9的比例混合，800r/min搅拌6h，过滤后获得残渣，将残渣再重复提取2次；

(3)将步骤(2)环己烷提取残渣与乙酸乙酯按1:9的比例混合，800r/min搅拌6h，然后将混合液过滤，获得澄清滤液和残渣，将残渣再重复提取2次，合并3次提取的滤液；

(4)将步骤(3)所得滤液减压蒸馏至恒重除去乙酸乙酯，获得黄芪乙酸乙酯提取物。

实施例3

黄芪提取物，其制备方法如下：

(1)将1000g黄芪在50℃鼓风干燥箱内干燥至恒重，粉碎过40目筛，获得黄芪粉末；

(2)取黄芪粉末400g，按黄芪粉末与环己烷1:9的比例混合，800r/min搅拌6h，过滤后获得残渣，将残渣再重复提取2次；

(3)将步骤(2)环己烷提取残渣与乙酸乙酯按1:9的比例混合，800r/min搅拌6h，然后将混合液过滤获得残渣，将残渣再重复提取2次；

(4)将步骤(3)乙酸乙酯残渣与乙醇按1:9的比例混合，800r/min搅拌6h，然后将混合液过滤，获得澄清滤液和残渣，将残渣再重复提取2次，合并3次提取的滤液；

(5)将步骤(4)所得滤液减压蒸馏至恒重除去乙醇，获得黄芪乙醇提取物。

实施例4

黄芪提取物，其制备方法如下：

(1)将1000g黄芪在50℃鼓风干燥箱内干燥至恒重，粉碎过40目筛，获得黄芪粉末；

(2)取黄芪粉末400g，按黄芪粉末与环己烷1:9的比例混合，800r/min搅拌6h，过滤后获得残渣，将残渣再重复提取2次；

(3)将步骤(2)环己烷提取残渣与乙酸乙酯按1:9的比例混合，800r/min搅拌6h，然后将混合液过滤获得残渣，将残渣再重复提取2次；

(4)将步骤(3)乙酸乙酯提取残渣与乙醇按1:9的比例混合，800r/min搅拌6h，然后将混合液过滤获得残渣，将残渣再重复提取2次；

(5)将步骤(4)乙醇提取残渣与水按1:9的比例混合，800r/min搅拌6h，然后将混合液离心，获得澄清滤液和残渣，将残渣再重复提取2次，合并3次提取的滤液；

(6)将步骤(5)所得滤液减压蒸馏至恒重除去水，获得黄芪水提取物。

采用化学法测定实施例1-4所得四种黄芪提取物的黄酮类化合物含量和螯合金属离子(fe²⁺)活性(mca)，其结果见表1和图1。其中数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一指标内，数据肩标字母不同者表示数据间差异显著(p<0.05)。同时，对四种黄芪提取物的mca与其黄酮类含量进行相关性分析，其分析结果见图2，其数据以3个重复的平均数表示。

表1不同极性黄芪提取物中黄酮类化合物含量

由表1可知，黄芪四种提取物中黄芪乙酸乙酯提取物的黄酮类含量最高，为40.36～43.66g/kg。由图1可知，黄芪提取物具有mca，其中以黄芪乙酸乙酯提取物效果最好。由图2可知，黄芪提取物的mca与其黄酮类物质含量存在密切关系。因此，是黄芪提取物中的黄酮类物质螯合了过度金属离子。

实施例5

在四川省内江市当地购得若干鲫鱼苗，在养殖室内暂养一周后，选择体重8.0±0.2g鲫鱼苗720尾，随机分为8个处理组，每组4个鱼缸，8个处理组的鱼尾数分别为：5、10、15、20、25、30、35和40尾/缸。其中，每个鱼缸的形态、大小和颜色相同，尺寸都为30×30×40cm并内置800l/h流量增氧机一台，每个鱼缸31l水。以自来水为水源、缸内水体积为31l。控制养殖室温22±2℃；增氧机持续供氧；投喂鱼粉豆粕型杂食性鱼饲料；每2-3天换水一次，养殖期为60天。60天养殖期后，考察各处理组的鱼增重、摄食量、饲料效率和死亡率。养殖密度对鲫鱼体重和摄食量的影响见表2，养殖密度对鱼增重、饲料效率和死亡率的影响分别见图3-5。其中数据以4个重复的平均数±标准差表示；在同一指标数据中，上标字母不同者表示数据间差异显著(p<0.05)。增重＝末重－初重；饲料效率＝100×增重/摄食量。

表2养殖密度对鲫鱼体重和摄食量的影响

由表2可知，随着养殖密度的提高，摄食量呈先增后减趋势，摄食最多的养殖密度为0.32-0.48尾/l水。由图3可知，随着养殖密度的提高，增重逐渐下降，增重最少的养殖密度为0.97-1.29尾/l水。由图4可知，随着养殖密度的提高，饲料效率逐渐下降，饲料效率最低的密度为0.97-1.29尾/l水，最高为0.16-0.48尾/l水。由图5可知，养殖密度1.13-1.29尾/l水时，鱼开始出现死亡。

由上可知，最佳养殖密度为0.48尾/l水，产生最大密度应激而不引起鱼死亡的养殖密度为0.97尾/l水。

实施例6

根据饲料配方，将黄芪4种提取物按0和2g/kg的浓度添加到饲料中，制成相应的5种抗应激颗粒饲料。

基础饲料配方：

¹每千克维生素添加剂包含：视黄醇(500,000iu/g)0.80g、维生素d3(500,000iu/g)0.48g、dl-α-生育酚(50％)20.00g、维生素k3(23％)0.43g、维生素b1(90％)0.11g、核黄素(80％)0.63g、吡哆醇(81％)0.92g、氰钴胺(1％)0.10g、d-泛酸钙(90％)2.73g、烟酸(99％)2.82g、d-生物素(2％)5.00g、肌醇(99％)52.33g和叶酸(96％)0.52g。

²每千克矿物质添加剂包含：feso4·7h2o(含fe20％)69.70g、cuso4·5h2o(含cu25％)1.20g、znso4·7h2o(含zn23％)21.64g、mnso4·h2o(含mn32％)4.09g、na2seo3·5h2o(含se1％)2.50g和ki(含i4％)2.90g。

上述抗应激饲料的制备方法包括以下步骤：

(1)根据基础饲料配方计算出单位质量饲料中所需鱼油与葵花籽油的质量，称取该质量的鱼油与葵花籽油，将二者混合。

(2)根据设计的饲料中提取物的含量计算出相同单位质量饲料中所需黄芪提取物的质量，称取该质量的黄芪提取物，将黄芪提取物与以上混合油混合，超声振荡40min使其混匀；

(3)将步骤(2)所得混合物加入到相同单位质量饲料的其余组分原料中，混匀后制成直径2mm的颗粒状饲料。

实施例7

在最佳应激密度(0.97尾/l水)和实施例5相同养殖环境条件下，选择体重22.7±1.1g鲫鱼苗495尾，随机分为6个处理组，每组3个鱼缸。6个处理组的鱼尾数分别为：15、30、30、30、30和30尾/缸，分别命名为对照、诱导、黄芪环己烷提取物、黄芪乙酸乙酯提取物、黄芪乙醇提取物和黄芪水提取物组。6个处理组分别投喂含0、0和2g/kg黄芪环己烷提取物、黄芪乙酸乙酯提取物、黄芪乙醇提取物和黄芪水提取物的饲料。每天投喂4次，早上8：00投喂第一次，以后每隔4小时投喂一次，晚上8：00进行最后一次投喂。投喂第1天，每次0.5克/缸；以后每次投喂增加0.1克/缸；直至出现剩料不再增加投喂量。以后每天必须保证有剩料，并于每次投喂后30分钟开始迅速捞出残饵，及时烘干残饵并记录重量；等剩料消失后再增加投喂量。投喂实验进行10天后，统计每个处理组的摄食量和鱼的体重，计算摄食率。停喂1天后，采集鱼的肠道样品，采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)法测定6个处理组肠道组织抗超氧阴离子活性(asa)、抗羟自由基活性(ahr)和丙二醛(mda)含量。

结果见图1和6，其中数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一指标数据中，上标字母不同者表示数据间差异显著(p<0.05)。结果显示黄芪提取物恢复了鲫鱼摄食率和其肠道抗氧化活性；黄芪的乙酸乙酯提取物效果最好。相关性分析结果见图2和7，其中数据以3个重复的平均数表示。结果显示黄芪四种提取物的恢复摄食和抗氧化能力与其黄酮类含量存在密切关系；其恢复摄食功能是由于其黄酮类物质螯合了金属离子和提高了肠道抗氧化能力。

实施例8

将实施例2制得的黄芪乙酸乙酯提取物分别按0、1、2、3、4、5、6和7g/kg的浓度添加到饲料中，按照实施例6中的配方及制备方法，制得相应的抗应激饲料。在最佳应激密度0.97尾/l水和实施例5相同的养殖环境下，选择体重7.18±0.21g鲫鱼苗1020尾，随机分为9个处理组，每组4个鱼缸。9个处理组的鱼尾数分别为：15、30、30、30、30、30、30、30和30尾/缸，分别命名为对照(d)、诱导(y)、1g(e1)、2g(e2)、3g(e3)、4g(e4)、5g(e5)、6g(e6)和7g(e7)组，9个处理组分别投喂含0、0、1、2、3、4、5、6和7g/kg黄芪乙酸乙酯提取物的饲料，投喂60天。60天后测定鲫的生长、摄食量和饲料效率和进行增重恢复率折线回归分析，其结果见表3和图8。表3中数据以4个重复的平均数±标准差表示；在同一指标内，数据肩标字母不同者表示数据间差异显著(p<0.05)。图8中数据以4个重复的平均数表示。增重恢复率(％)＝(e－y)/(d－y)×100(表3)。

表3投喂含黄芪乙酸乙酯(eae)提取物的饲料60天对鲫鱼高密度应激的影响

由表3可知，投喂含黄芪乙酸乙酯提取物的饲料恢复了鲫鱼生长、摄食量和饲料效率；由图8可知，恢复鲫鱼生长效果最佳的乙酸乙酯提取物添加浓度为5.23g/kg饲料。

实施例9

在和实施例5相同的养殖环境下，选择体重25.17±1.05g鲤鱼苗210尾，随机分为7个处理组，每组3个鱼缸，每缸10尾鱼。在7个处理组鱼缸水体内溶解硫酸铜，使其浓度分别0.0、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0mgcu/l水。投喂鱼粉豆粕型杂食性鱼饲料，四天后考察每个处理组的采食量和死亡率，实验结果见图9和图10。其中，图中数据以3个重复的平均数±标准差表示；柱上标记字母不同者表示数据间差异显著(p<0.05)。

由图9和图10可知，随着cu浓度的提高鱼的摄食量逐渐降低；当cu浓度增至0.8mg/l水时，鱼摄食量下降到最低水平；进一步提高cu浓度达0.9mg/l水时，鱼出现死亡。因此，产生最大硫酸铜应激而不引起死亡的cu浓度为0.8mg/l水。

实施例10

在和实施例5相同的养殖环境下，选择和实施例9相同体重鲤鱼苗210尾，随机分为7个处理组，每组3个鱼缸，每缸10尾鱼。在7个处理组鱼缸水体内分别溶解0.0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2和4.0mg敌百虫/l水。四天后考察每个处理组的鱼侧翻率和死亡率，其结果见图11和图12。其中，图中数据以3个重复的平均数±标准差表示；柱上标记字母不同者表示数据间差异显著(p<0.05)。

由图11和图12可知，随着敌百虫浓度的提高鱼的侧翻率逐渐升高；当敌百虫浓度增至2.4mg/l水时，鱼侧翻率达到最高水平；进一步提高敌百虫浓度达3.2mg/l水时，鱼出现死亡。因此，引起最大敌百虫应激而不引起鱼死亡的浓度为2.4mg/l水。

实施例11

在和实施例5相同的养殖环境下，选择体重9.98±0.23g鲤鱼苗480尾，随机分为8个处理组，每组4个鱼缸，每缸15尾鱼。7个处理组分别投喂含0、1、2、3、4、5、6和7g/kg黄芪乙酸乙酯提取物的饲料。30天后，分别从每个处理组随机选择30尾鱼，平均分给3个鱼缸(每缸10尾鱼)；在每个鱼缸水体中溶入0.8mgcu/l的硫酸铜。投喂鱼粉豆粕型杂食性鱼饲料，四天后考察每个处理组的摄食率和进行摄食恢复率折线回归分析。其结果见表4和图13。表4中数据以3个重复的平均数±标准差表示；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(p<0.05)。图13中数据以3个重复的平均数表示。摄食率(％)＝摄食量/体重×100，摄食恢复率(％)＝(e－y)/(k－y)×100。

表4投喂黄芪乙酸乙酯提取物(eae)对硫酸铜应激后鲤鱼摄食率的影响

由表4可知，投喂黄芪乙酸乙酯提取物恢复了硫酸铜诱导的鱼摄食率的降低；由图13可知，添加4.79g/kg饲料的黄芪乙酸乙酯提取物恢复鱼摄食的效果最佳。

实施例12

在和实施例5相同的养殖环境下，按步骤11投喂不同浓度黄芪乙酸乙酯提取物饲料30天后，分别从每个处理组随机选择30尾鱼，平均分给3个鱼缸(每缸10尾鱼)；在每个鱼缸水体中溶入2.4mg/l的敌百虫。四天后考察每个处理组的侧翻率和进行侧翻抑制率折线回归分析，其结果见表5和图14。表5中数据以3个重复的平均数±标准差表示，每个重复为4天侧翻数的平均值；在同一列数据中上标字母不同者表示差异显著(p<0.05)。图14中数据以3个重复的平均数表示。侧翻率(％)＝侧翻鱼数量/鱼总数量×100。

表5投喂黄芪乙酸乙酯提取物(eae)对敌百虫应激后鲤鱼侧翻率的影响

由表5可知，投喂黄芪乙酸乙酯提取物抑制了敌百虫诱导的侧翻；由图14可知，添加5.12g/kg饲料的黄芪乙酸乙酯提取物抑制鱼侧翻的效果最佳。

虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。