一种具有降压功效的雪莲菌发酵绞股蓝乳制备方法

1.本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种具有降压功效的雪莲菌发酵绞股蓝的方法。


背景技术：

2.绞股蓝(学名：gynostemma pentaphyllum(thunb.)makino)葫芦科、绞股蓝属草质攀援植物。茎细弱，具分枝，具纵棱及槽，无毛或疏被短柔毛。性寒、味苦，具有清热解毒、止咳清肺祛痰、养心安神、补气生精之功效，可用于降血压、降血脂、护肝、促进睡眠以及肠胃炎、气管炎、咽喉炎的治疗，并用于多种癌症的抗癌临床辅助治疗。
3.绞股蓝富含丰富的具有降血压活性物质绞股蓝皂苷，被认为是一种可以改善高血压的功能性食品；但目前绞股蓝还多以茶饮为主要消费方式，缺乏进一步深加工的产品；同时绞股蓝茶饮的苦涩味也限制了消费受众，目前少见对其进行发酵的深入研究。
4.雪莲菌又称藏灵菇，是一种乳白色或浅黄色的胶质状的块状物，生长形状无规律，多数呈球状米粒状。表面卷曲在乳中能快速生长，形成似菜花状的菌块，具有弹性，手捏有黏稠感，与雪莲外形相似，所以也称之为“西藏雪莲”。雪莲菌发酵的商品具有降血压保健功能，同时雪莲菌发酵还会赋予乳品香甜气息和令人愉悦的滋味，有着很好的市场接受度。
5.对于绞股蓝和雪莲菌这两种具有降压活性的功能性食品，还没有将其进行组合深加工，以获得新型降压食品的先例。
6.有鉴于此，提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的是寻求一种绞股蓝的全新发酵思路以期制备具有更高降血压活性的发酵乳品。在实验中，申请人意外发现采用雪莲菌可以有效的在牛奶中发酵绞股蓝，重要的是发酵后制备的绞股蓝乳具有显著增加的降压活性，基于此提出本发明。本发明具体提供如下技术方案。
8.本发明首先提供一种雪莲菌发酵绞股蓝的方法，包括如下步骤：
9.1)绞股蓝预处理：取绞股蓝毛茶粉碎制备匀浆液；
10.2)雪莲菌活化：取雪莲菌在无菌牛奶中活化；
11.3)绞股蓝发酵：取绞股蓝匀浆液、无菌牛奶、活化后雪莲菌进行发酵。
12.进一步的，所述步骤3)所述绞股蓝匀浆液和无菌牛奶按0.3～1：1比例混合，所述雪莲菌按照1:50
‑
200的质量比接种，述发酵温度为23～34℃，发酵时间为22～35h。
13.进一步的，所述步骤3)为：绞股蓝匀浆液和无菌牛奶按0.3～1：1比例混合，置于发酵容器内；取活化后雪莲菌按照1:50
‑
200的质量比接种加入发酵容器的混合液中，在23～34℃下震荡发酵22～35h。
14.更进一步的，所述步骤3)具体为：绞股蓝匀浆液和无菌牛奶按0.65：1比例混合，置于发酵容器内；取活化后雪莲菌加入发酵容器的混合液中，在28℃下震荡发酵28h。
15.进一步的，所述步骤1)为：取绞股蓝毛茶粉碎并用5～10倍体积的水在40～45℃下匀浆0.5～2h，过滤后待用。
16.更进一步的，所述步骤1)为：取绞股蓝毛茶粉碎并用10倍体积的水在45℃下匀浆1h，过滤后待用。
17.进一步的，所述股蓝毛茶是来自绞股蓝鲜叶，清洁干燥后经过杀青、揉捻和烘焙，制作成绞股蓝毛茶。
18.进一步的，所述步骤2)为：取雪莲菌，使用无菌在牛奶中震荡发酵，连续培养5～8天，至菌种完全活化。
19.进一步的，所述步骤2)为：取雪莲菌，26
‑
28℃下使用无菌牛奶中震荡发酵，每20
‑
26h(优选24h)将雪莲菌菌体过滤转移到新的牛奶中再进行连续培养5～8天，直至菌种完全激活。
20.本发明还提供给一种绞股蓝发酵乳，由上述方法发酵制备。
21.本发明还提供一种食品组合物，包含上述的绞股蓝发酵乳。
22.本发明还提供一种雪莲菌在发酵制备绞股蓝发酵乳中的应用。
23.进一步的，所述发酵为将绞股蓝匀、牛奶和雪莲菌混合发酵。
24.更进一步的，所述发酵为上述的发酵步骤。
25.与现有技术相比，本发明至少具有如下优势：
26.1)本发明方法首次采用雪莲菌用于绞股蓝的发酵，发酵产物降压效果几乎达到降压药卡托普利级别，超出了实验预期；
27.2)本发明方法通过对整个发酵条件进行优化，获得一种最适降压效果的发酵参数和发酵体系。
28.3)本发明制备的绞股蓝乳具有明显的降血压功效，可制备成各种产品形式，比如发酵饮品等，适于产业推广。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1股蓝匀浆液的随温度增加的绞股蓝总皂苷变化图。
31.图2基于挥发性香气成分指标评估雪莲菌代谢活性。
32.图3绞股蓝茶糖、绞股蓝匀浆和发酵乳绞股蓝中总皂苷的含量。
33.图4发酵时间和绞股蓝匀浆液与无菌牛奶比例的响应面拟合结果。
34.图5发酵温度和绞股蓝匀浆液与无菌牛奶比例的响应面拟合结果。
35.图6发酵时间和发酵温度的响应面拟合结果。
36.图7连续灌胃4周后测定大鼠尾动脉血压以评价降血压的活性。
具体实施方式
37.下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施
例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
39.除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
40.如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由
…
组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
41.在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
42.本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的
±
10％，优选
±
5％。
43.此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
44.本发明所述雪莲菌发酵绞股蓝的方法大体如下：
45.1)绞股蓝预处理：取绞股蓝毛茶粉碎制备匀浆液；2)雪莲菌活化：取雪莲菌在无菌牛奶中活化；3)绞股蓝发酵：取绞股蓝匀浆液、无菌牛奶、活化后雪莲菌进行混合发酵。
46.可以理解本发明的核心在于发现绞股蓝的全新发酵模式，即基于牛奶活化的雪莲菌能够有效发酵绞股蓝并产生高降压活性发酵乳，因此不做限制，但凡利用雪莲菌发酵绞股蓝的方法都在本发明的范畴内。
47.在一些实施方式中，本发明的绞股蓝预处理步骤为：取绞股蓝毛茶粉碎并用5
‑
10倍体积的水在40
‑
45℃下匀浆0.5
‑
2h，过滤后待用。
48.根据本发明的最优实施方式，所述步骤1)为：取绞股蓝毛茶粉碎并用10倍体积的水在45℃下匀浆1h，过滤后待用，在该具体方式下绞股蓝的预处理效果最好，但该最优实施方式并不限制本发明范围，其他预处理同样能够满足本发明的需要。
49.上述股蓝毛茶可以是从本领域多种来源获得，在一些实施方式中，其来自绞股蓝鲜叶，清洁干燥后经过杀青、揉捻和烘焙，制作成绞股蓝毛茶。
50.在一些实施方式中，本发明所述的雪莲菌活化为：取雪莲菌，在一定温度下使用无菌在牛奶中震荡发酵，连续培养5～8天，至菌种完全活化。
51.在一些优选的实施方式中，所述雪莲菌活化为：取雪莲菌，26
‑
28℃下使用无菌牛奶中震荡发酵，每20
‑
26h(优选24h)将雪莲菌菌体过滤转移到新的牛奶中再进行连续培养不超过8天，直至菌种完全激活。
52.根据本发明的最优实施方式，取一定量的雪莲菌，在28℃下使用无菌牛奶中震荡发酵，每24h将雪莲菌菌体过滤转移到新的牛奶中再进行连续培养5～8天，直至菌种完全激
活。该最优实施方式能够获得代谢活性最为旺盛的雪莲菌，但其不限制本发明，其他实施方式制备的雪莲菌同样能够用于绞股蓝发酵。
53.在一些实施方式中，本发明所述的绞股蓝发酵中，具体绞股蓝匀浆液和无菌牛奶可以一定比例混合，比如按0.3～1：1比例混合；所述雪莲菌可以按照本领域通常比例，例如1:50
‑
200的质量比接种；发酵温度可以为23～34℃，发酵时间可以为22～35h。
54.在一些实施方式中，所述步骤3)绞股蓝匀浆液和无菌牛奶按0.25～0.65：1比例混合，置于发酵容器内；取活化后雪莲菌加入发酵容器的混合液中，在23～34℃下震荡发酵22～35h。
55.根据本发明的最优实施方式，所述步骤3)具体为绞股蓝匀浆液和无菌牛奶按0.65：1比例混合，置于发酵容器内；取活化后雪莲菌加入发酵容器的混合液中，在28℃下震荡发酵28h。本发明经响应面实验证实该条件下发酵产物体外ace酶抑制活性最大。
56.本发明还涉及一种利用上述发酵方法的绞股蓝发酵乳，不作限制，任何通过上述方法的发酵乳或相应的发酵乳产品都属于本发明的权利范围。这些发酵乳产品包括但不限于对该发酵乳进行的后续任何形式的加工、包装等，比如食品、饮品、药品类等，这些产品可以是药品级或食品级。
57.下面为具体的实施例。
58.实施例1绞股蓝匀浆的制备优化
59.1)将绞股蓝毛茶用粉碎机粉碎，过100目筛后，按照1：10的比例添加纯净水，分成若干份，并分别在25
‑
60℃的范围匀浆浸提0.5～2h。
60.2)浸提后的匀浆在8000g下离心，上清液使用0.22μm膜过滤，用于分析其中绞股蓝皂苷的含量。绞股蓝皂苷含量使用高效液相色谱法进行测定，绞股蓝皂苷xlix和绞股蓝皂苷xvii作为外标进行定量，液相条件如下：色谱柱shim
‑
pack c18(4.6mm
×
250mm,5μm)，流速1ml/min，流动相：a水(0.1％甲酸)，b乙腈(0.1％甲酸)，洗脱条件为：0min，35％b；0～20min，35％～40％b；检测波长：203nm；进样量10μl，柱温35℃。
61.结果如图1所示：以绞股蓝总皂苷为指标评价绞股蓝匀浆液的制备情况，随着温度的增加，绞股蓝总皂苷在匀浆液中的含量持续增加，但温度超过45℃之后就绞股蓝皂苷的提取率增长减缓，而过高的温度不仅浪费能源，且会使绞股蓝匀浆产生“煮熟”的味道，因此绞股蓝匀浆的制备温度为40
‑
45℃，最优选的为45℃。
62.实施例2雪莲菌活化优化
63.1)雪莲菌活化步骤：雪莲菌冻干粉置于无菌牛奶中震荡培养，培养温度28℃，每24h小时将雪莲菌菌体过滤分离，转移到新鲜的牛奶中继续培养，连续培养14天。
64.2)雪莲菌发酵活力的测定：使用气相
‑
离子迁移谱测定发酵牛奶中的挥发性成分，以反映雪莲菌的活性。从培养雪莲菌的牛奶中取样200μl，加入800μl含有3％氯化钠的水，60℃震荡孵育15分钟，使用顶空进样0.3ml。气相色谱条件如下：色谱柱为se54(15m),载气的流速梯度设置为：2.00ml/min保持2min，在8min内线性增至10.00ml/min，在10min内线性增至120.00ml/min后保持15min。载气和漂移气均为高纯氮气。
65.结果如图2所示：选择27个雪莲菌发酵的特征挥发性物质作为指标，反应雪莲菌的活化程度，从发酵第二天开始，发酵基质牛奶中挥发性成分开始增加，在第5天到第8天的时候香气成分增加最多，最后香气成分开始减少，这表明，雪莲菌在培养的过程中，第5～8天
的时候代谢活性最为旺盛，随后雪莲菌的代谢活动开始变得单一。因此为了最终产品的品质，选择使用无菌牛奶活化不超过8天的雪莲菌菌体作为制备雪莲菌发酵乳的激活菌。
66.实施例3雪莲菌发酵绞股蓝乳的制备和总皂苷含量比较
67.1)绞股蓝发酵乳的制备：将制备的绞股蓝匀浆与无菌牛奶按照0.25的比例混合，然后接入活化的雪莲菌菌体，在28℃下恒温震荡发酵24h，过滤后使用巴氏杀菌法对发酵乳进行灭菌。
68.2)发酵乳中绞股蓝皂苷的测定：将同样质量的绞股蓝粉碎加入10倍体积的清水，制备绞股蓝茶汤；分别取绞股蓝茶汤和绞股蓝匀浆按照0.25：1的比例与牛奶基质混合。使用实施例1中的方法分别测定绞股蓝茶汤、绞股蓝匀浆和发酵乳绞股蓝总皂苷的含量，以评价三种方法处理绞股蓝对于绞股蓝总皂苷释放率的影响。
69.结果如图3所示：使用雪莲菌发酵后可以极大的提高绞股蓝总皂苷的含量，表明发酵乳具有更好的降血压潜力。
70.实施例4雪莲菌发酵绞股蓝乳优化
71.1)优化条件的选择：选择绞股蓝匀浆和牛奶的比例(茶乳比)、发酵时间(t)以及发酵温度(t)作为三个因素优化最优发酵条件，以发酵乳对体外血管紧张素转化酶(ace)的抑制活性为指标进行优化。ace作为一种控制血压的关键酶，其可以将催化血管紧张素i生成血管紧张素ii从而引起血压上升，对于该酶活性的抑制可以缓解高血压的症状，可作为本发明评判指标。雪莲菌的接种量占到整体发酵组合物的1/50。响应面实验设计如表1。
72.表1响应面实验设计
[0073][0074]
2)体外ace抑制活性的测定：取待测样品用硼酸盐缓冲液调节ph值至8.3，10000g离心后取50μl上清液和50μl浓度为6.5mm的马尿酰
‑
组氨酰
‑
亮氨酸组合物的硼酸盐缓冲液(ph＝8.3)，混合均匀后加入10μl使用上述硼酸盐缓冲液溶解的ace酶以启动反应。30min后整个反应体系在95℃下灭活5min，然后加入等体积甲醇，经过0.22μm滤膜过滤后用于液相
分析产物马尿酸的量。用硼酸盐缓冲液代替样品重复上述反应作为对照组。液相测定条件如下：hypersil gold(50
×
2.1mm，1.9μm)，流动相为含有0.1三氯乙酸的25％乙腈的水溶液，流速0.3ml/min；紫外检测波长228nm；柱温：35℃；进样量：3μl。
[0075]
响应面拟合结果如表2和图4所示，模型极显著(model p
‑
value<0.0001)，表明响应面实验合理，通过响应面预测，最佳发酵条件为：ratio＝0.65，t＝26.2，t＝27.91。这表明，模型预测在绞股蓝匀浆和牛奶比例为0.65时，27.91℃下发酵26.2小时可以让最终产品的体外ace酶抑制活性最大。综合按60％抑制率来看发酵温度23～34℃，发酵时间22～35h小时都满足发酵要求。另外，考虑绞股蓝匀浆的比例过大会使最终产品有过浓的“草腥”味和涩味，同时改变绞股蓝匀浆和牛奶的比例对于体外ace酶抑制活性影响较小，因此，0.31～1之间都是合理的范围。较小比例的绞股蓝匀浆有利于产品的口感，较大比例的绞股蓝乳可以提升产品的降血压活性。再者，考虑工业实际生产的动态控制需要和雪莲菌增值速率，实际生产中可以适当调整发酵温度，缩短或延长发酵时间，以提高产品的生产效率或避免生产过剩。因此本发明最终确立较优秀的条件为：料液比0.3～1，发酵温度23～34℃，发酵时间22～35h小时。可以理解，这里的条件并不限制本技术，其他参数也能够实现本技术的基本要求。
[0076]
表2响应面实验拟合结果
[0077][0078]
实施例5动物实验证实雪莲菌发酵绞股蓝乳的降血压活性
[0079]
选择自发性发高血压(shr)大鼠作为动物模型，每九只作为一组，共分为5组，分别是灌胃生理盐水的对照组、灌胃常用降压药卡托普利的阳性对照组、灌胃用雪莲菌发酵牛奶(开菲尔)组、灌胃未发酵的绞股蓝茶汤组和灌胃雪莲菌发酵的绞股蓝发酵乳组。每只大鼠均每次灌胃2ml体积的液体，其中卡托普利组给药浓度为10mg/kg；绞股蓝茶汤采用1：10的料液比在45℃浸提1h制备，冷却至室温；绞股蓝发酵乳使用和前者同样的绞股蓝茶汤与无菌乳按0.65：1的比例，接种2％比例的雪莲菌在28℃下混合发酵24小时制备。所有大鼠连续灌胃4周，并测定尾动脉血压以评价降血压的活性。
[0080]
结果：对照组shr大鼠的血压始终较高，灌胃绞股蓝乳的shr大鼠血压出现了明显的降低，血压降低幅度与灌胃降压药的shr大鼠相近。此外，灌胃未添加绞股蓝匀浆的雪莲菌发酵乳(开菲尔)和灌胃绞股蓝茶汤的shr大鼠的血压没有明显的降低。上述结果表明，使用雪莲菌发酵的绞股蓝乳具有良好的降血压功效，且效果可以达到商品化降压药的水平，该效果超出了实验预期。
[0081]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。