借助于移动的凹液面对大分子进行序列比较的方法及应用的制作方法

专利名称：借助于移动的凹液面对大分子进行序列比较的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及对大分子，如具有生物活性的多聚体或大分子，尤其是DNA或蛋白质进行序列比较的方法。本发明也涉及该方法在检测、测量样品中分子内距离分离和/或分析大分子的过程中的应用。
控制大分子的构象代表着一种主要的工业挑战，例如在传感器(sensors)或受控的分子装配的生产，或者作为选择也存在于检测和分析的问题中。具有延伸的分子构象也许会有用。举例来说，在多聚体转移到一底物上的情况下，有人提出可经过电场、流动，或光镊(optical tweezers)的作用来延伸它们。尤其在生物学中，通过电泳(Zimmermann and Cox Nucl.Acid Res.22，p492，1994)、自由流动(free flow)(Parra and Windle，Nature Genetics，5，P17，1993 and WO93/22463)、或在一凝胶中(Schwartz et al.Science262，P110，1993and USP 33531)或在光镊的帮助下(Perkins et al.，Science 264P819，1994 and also USP5079169)的DNA序列比较开辟许多在定位或在病原体检测方面的可能性。
这些方法一般仅能进行不完全的序列比较，或者作为选择为一种短暂的序列比较——这就是说一旦应力(stress)消失，分子的松驰便发生。在光镊的情况下，方法昂贵，限于一次仅一个分子，并且对于不合格的工作人员难以完成。
一种在细胞溶解后接着干燥，通过流动(flow)对DNA进行序列对比的特殊技术被提出(I.Parra and B.Windle and WO 93/22463)。获得的序列对比很不完全和不均一，并且观察到许多未发生序列对比的材料。
本发明的主题是一种新的而且简单的在一支持物表面S上对大分子进行序列比较的方法，其特征在于由于溶剂A和表面S的接触以及使介质B在所述的表面S上移动而形成的三重线S/A/B(凹液面)，所述的大分子有一部分，尤其是一端锚定于表面S上，其它部分，尤其是另一端溶解于溶剂A中。
按照本发明，观察到仅仅是凹液面通过一部分锚定于一底物上，分子其余部分自由存在于溶液中的分子使得均匀地、垂直于移动凹液面对它们进行序列比较成为可能，让它们留在凹液面后面吸附于表面上。该现象在这里称为“分子梳”(molecular combing)。
更具体地说，分子自由部分的伸展由三重线S/A/B的通过来完成，三重线在表面S、溶剂A和介质B之间形成凹液面，介质B可以是气体(一般为空气)或另一种溶剂。
在一具体的实施例中，凹液面为水/空气凹液面，这就是说溶剂A是水溶液并且介质B是空气。
此外，可以扩展这里所用的空气/水凹液面，以使分子伸展于其它系统如油/水或尤其是水/表面活性剂/空气中。
凹液面的移动可通过任何流体A和流体B相对于表面S的相对移动手段来完成。在一实施例中，表面S可从溶剂A撤离，或者反过来，溶剂A可从表面S撤离。
特别是凹液面可通过机械手段移动，尤其是通过用抽吸(aspi-rating)或吹气的气动手段，或尤其是通过用推动或抽吸溶剂A或介质B的水力手段。
这样，凹液面移动可通过溶剂A的逐渐蒸发来完成。
当凹液面机械性移动完成以后，或者是通过界面A/B的平移，或者通过表面S的平移完成。
在一具体的实施例中，溶剂置于2个支持物之间，其中至少一个与所述的表面S对应并且凹液面通过如蒸发来移动。
对于“支持物”，这里应理解为任何具足够粘滞性以抵抗凹液面流过的底物。
支持物可至少在表面包括一有机或无机多多聚体，一金属尤其是金，一金属氧化物或硫化物，一半导体元素或一半导体元素的氧化物，如氧化硅或其结合物如玻璃或陶瓷。
可特别提及一些玻璃、表面氧化的硅，石墨、云母以及钼硫化物。
作为“支持物”，可以使用一个单一的支持物如载片(slide)、玻璃珠(beads)，尤其是多聚体小球，但也可以是如棒形、纤维形或一有结构的支持物的任何形式，并且也可以是微粒，或者是粉末状，尤其是硅粉，已知在各种分析技术中它们还可被制成磁性、发荧光或有色物。
支持物以盖玻片的形式比较有利。最好支持物很少或不具荧光。
诸如普通多聚体或诸如DNA、RNA或蛋白质的生物多聚体的大分子可通过一般方法锚定于一支持物上。
要进行序列对比的大分子可选自生物大分子如蛋白质，尤其是抗体、抗原、配体或其受体，核酸，DNA，RNA或PNA，脂类，多聚糖或其衍生物。
按照本发明观察到张力在紧邻凹液面范围内起作用，它与分子长度、锚定的分子数目，且在一定宽度范围内与凹液面速度无关。这些特征对均一地并且可重复地对分子进行序列比较尤其重要。
根据本发明，能够向溶剂A和/或介质B添加表面活性剂成分，这将改变界面的性质。按照本发明，伸展的确可以通过添加表面活性剂，或通过一充分的表面处理加以控制。
过高的表面一大分子吸引力(如一过高水平的吸附力)会干扰通过凹液面进行的分子序列比较，这些无需伸展的分子保持吸附于表面上。最好，表面对所述的大分子展示出一低比例的吸附，以使得仅被锚定的分子进行序列比较，其余的被凹液面带走。
然而，改变大分子的一部分，尤其是其端部和它其余部分(尤其对于如DNA或胶原这类长分子)之间的吸附差异是可能的，以使得通过一部分，尤其是仅它们的末端用吸附作用将分子锚定于各种表面上并通过上述的凹液面流动对它们进行序列比较，分子的其余部分自由存在于溶液中。
大分子在表面上的吸附可通过PH或介质中离子介质浓度或用于表面上的电压手段容易地控制。表面电荷以及表面和分子间静电(排斥的或吸引的)相互作用因此而改变，因而使得从分子在表面上的完全吸附状态过渡到完全缺乏吸附是可能的。在这两种极端情况之间，存在一个控制参数范围，(在此范围内)吸附通过分子末端优先发生并且因此被优先用于将它们锚定于表面上，然后通过凹液面移动对它们进行序列比较。
一旦进行序列比较，分子便强烈地吸附于表面。在DNA的情况下，可以在对它们进行序列比较数目后用荧光观察。
本发明因而与Parra和Windle提出的方法有很大的不同，因为按照本发明，分子锚定于表面上并且然后通过凹液面的移动均匀地进行序列比较，而在Parra和Windle的方法中，使用一流体动力流非均一地伸展分子，分子将会变得非特异性地吸附于表面上。
别的技术也可导致分子的伸展和序列比较。因此，一端被锚定的溶液中的分子动力学方向可通过电泳或通过一水力流(hydraulicflow)来获得。然而，观察结果显示这些技术比凹液面的使用效果差得多。
通过“锚定”大分子于表面上，应该懂得通过共价键和非共价键(如由理化相互作用产生的连接，如上述的吸附)产生的化学反应性的附着。
这种大分子的锚定可直接在(或用)表面来完成，或间接完成，那就是说通过一连系物如另一个分子，尤其是另一个具有生物活性的分子。当锚定间接完成时，大分子可经化学方法转移到所述的连系物上，或者能够与所述的连系物发生理化相互作用，尤其当所述的中介连系物是一个具有识别并与所述的大分子发生相互作用之生物活性的分子。
在一个实施例中，大分子与所述的连系物均为具有生物活性的相互间发生作用(如分别为抗原和抗体，互补的核酸或脂类)的分子。在这些场合，大分子的非共价吸附由以下类型键组成抗原—抗体，配体—受体，互补核酸片段间的杂交或脂类物质之间的疏水亲水或相互作用。
因此可利用很高特异性及高度选择性的某些生物反应，尤其是抗原抗体反应，DNA或RNA杂交反应，蛋白质间相互作用或抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素/生物素型反应以及配体与它们的受体间的反应。
因此，为了进行大分子在表面S上的直接或间接锚定，使用一个具有一定特异性的固体表面是可能的。尤为特别的是使用特定预处理的使其能够吸附特定蛋白质或DNA(无论修饰或未修饰过的)的表面是可能的。
这种表面以各种形式在商业上可得到(如Covalink，Costar，Estapor，Bangs，Dynal)，如它们的表面上具有COOH，NH2或OH基团。
在这种情况下，用一反应基团如一个氨基功能化(functionalize)DNA并与这些表面发生反应是可能的。然而，这些方法需要特异的DNA功能化以被吸附。
一种允许无需DNA前处理的锚定方法也已被描述过。该方法在于使DNA分子5＇端自由磷酸基与表面(NH Covalink表面)仲胺发生反应。
如果分子末端和其中间部分之间吸附有差异，可通过PH、介质离子浓度或表面上电压的应用手段控制表面电荷，以通过分子末端的吸附来完成吸附的锚定。按照本发明，未功能化的DNA分子可因此被锚定。例如，位于覆盖有末端具有乙烯基(vinyl)或氨基(例如多聚赖氨酸分子)之分子的表面上，或各种表面如玻璃，覆盖有末端具乙烯基或氨基的硅烷型分子，或者作为选择，预先经酸浴清洗过的盖玻片。在这后一种情况中，玻璃表面的确具有SiOH基团。
在所有这些场合，在DNA被锚定的PH范围选择在完全吸附和无吸附状态之间，后者位于一较碱性的PH状态。应懂得该技术很普通并且能被本领域熟练的技术人员推成多种类型表面。
为了使其与一覆盖有第二反应基团或一蛋白质P1(各自相互间能发生特异反应，这就是说如P1与P0间)的表面发生反应，用第一反应基团或蛋白质P0功能化DNA是可能的。例如P0/P1对可以是以下类型对生物素/抗生蛋白链菌素(zimmermann and Cox)或例如异羟基毛地黄毒/抗体介导的抗异羟基毛地黄毒(抗-DIG)(Smithet al.，Science 258，1122(1992))。
优选的是，要锚定的表面将具有一低的荧光水平以使在它们进行序列比较后不干扰分子的检测，尤其如果检测是通过荧光来完成。
按照本发明，优选使用在反应条件下，具有仅对大分子一部分具有亲和性，大分子其余部分自由存在于溶液中的表面的固体支持物。
在一个实施例中，使用的固体支持物表面至少具有一层有机化合物，该化合物外层具有一个对可以是所述分子本身或一识别并/或与其相互作用的带有生物活性的一类分子具有亲和性的裸露基团。
支持物可因此具有覆盖有反应基团或具有生物活性分子的表面。
通过“亲和”，这里应该懂得在分子向裸露基团吸附的任选条件下，化学反应性和任何类型的吸附均会被修饰或不被修饰。
在一个实施例中，表面实质上是紧密的，那就是说为了将非特异性相互作用减到最小，它限制具有生物活性的大分子进入到内层和/或支持物中。
使用覆盖有反应裸露基团(如NH2，COOH，OH，CHO)或具有生物活性的能够吸附分子任选修饰部分的大分子(例如蛋白质，如抗生蛋白链菌素或抗体，核酸如寡聚核苷酸，脂类，多糖及其衍生物)的表面也是可能的。
因此，按照已知方法(“Chemistry of Protein Conjugation andCross-linking”，S.C Wong，CRC Press(1991))涂有抗生蛋白链菌素或一抗体的表面能够吸附一个在特定位点具有一生物素或一抗原的大分子。
同样，表面经处理以使单链寡核苷酸能够适宜于将具有互补序列的DNA/RNAs锚定于其上面。
在具有一裸露反应基团的表面上，应提及以下一些裸露的基团-COOH，-CHO，NH2，-OH基团，或含有一本身被利用或可被激活以使特异地达到-CHO，-COOH，NH2或OH基团的双键-CH＝CH2的乙烯基团。
按照本发明，具有高度特异性表面的支持物可用各种方法获得。可列举如下(A)一层至少1nm厚，具有下面定义的反应基团的具任选分枝的含碳多聚体和(B)通过沉积或锚定一个或更多分子层于一固体支持物上而获得的表面；后者可通过由非共价键吸附而形成的连续层而获得，作为非局限性例子如Langmuir-Blodgett薄膜，或通过分子自身装配，这允许通过共价键吸附导致一层的形成。
在第一种场合，表面可通过至少一个单体的聚合作用在多聚体表面产生所述的裸露基团而获得，或者作为选择通过一多聚体表面的部分去聚合作用以产生所述的裸露基团，或者作为选择，通过多聚体沉积获得。
在这过程中，形成的多聚体具有乙烯键如多聚(烃)衍生物，尤其是人工橡胶型的表面，如聚丁二烯、聚异戊二烯或天然橡胶。
在第二种场合，高度特异性的表面包括在支持物上一实质上有延伸结构有机化合物的单分子层，至少具有·对支持物有吸附作用的吸附基团以及·在吸附条件下对所述支持物及所述的吸附基团没有或具很少吸附的裸露基团，但经吸附后的化学修饰后，任选地对一种生物分子具有吸附。
吸附首先可以是非共价(键)型，尤其是亲水/亲水和疏水/疏水型，如在Langmuir Blodgett薄膜中(K.B.Blodgett，J.Am.Chem.Soc.57，1007(1935))。
在这种情况下，裸露的基团或吸附基团将或者是亲水性的，或者是疏水性的，尤其是如CH3，CF3，CHF3，CH2F的烷基或卤代烷基，其它亲水的基团。
吸附也可以是共价型的，在这种情况下，吸附基团将与支持物发生化学反应。
在电子领域已提及类似结构的某些表面尤其当吸附是共价型的(L.Netzer and J.Sagiv，J.Am.Chem.Soc.105，674(1983)and US-A-4 539061)。
在吸附基团中，必须更特别地提及金属酚盐(alkoxide)或半导体型基团，例如硅烷，尤其氯硅烷、硅醇(silanol)、甲氧及羟乙硅烷、silazane，以及磷酸盐、羟基、酰肼、肼、胺、酰胺、重氮基、吡啶、硫酸盐-砜(sulfonic)、羧化(物)、硼化(物)、卤素、卤酸、醛基。
尤为特别的是，作为吸附基团，能够与一相邻等价基团发生交联反应以给出横桥键的基团将被优选使用；例如它们将会是金属酚盐或半导体类型(例如硅烷，尤其二氯硅烷、三氯硅烷、二甲硅烷或二羟乙基硅烷以及三甲或三羟乙基硅烷。
吸附基团的选择将显然依赖于支持物的性质；硅烷型基团十分适合在玻璃和二氧化硅上吸附。
至于裸露基团，不管其表面，它们将被优先选自乙烯基、乙炔基或芳香基团、伯、叔或仲胺、酯、腈、醛、卤素。但是它们最突出地也许是乙烯基；的确，后者能在吸附后被化学修饰以给出如一个羧基或羧基衍生物，如醇基、醛基、酮基、酸基、伯胺、肿胺或叔胺，或导致一诸如核酸及蛋白质生物大分子的PH依赖性的直接锚定，没有表面或大分子的化学修饰。
最好，连接裸露基团与吸附基团的链至少带有1个碳原子，最好多于6个并且一般从3到30个碳原子。
对于支持物本身，一般来说，玻璃、表面被氧化的硅、多聚体或表面经过或未经过前处理的金被优选使用。
在玻璃或硅的情况下，可优先地使用已知的应用硅烷衍生物的表面活化技术，例如Si-OH-Cl3-Si-R-CH＝CH2产生Si-O-Si-R-CH＝CH2，R由诸如(CH2)4组成。文献中，使用超纯溶剂的反应是已知的。反应导致一分子层，它们在表面上的C＝C末端裸露于外界中。
在使用金的情况下，这种底物上的一薄层形式是任选的，已知的表面活化技术使用硫醇类衍生物，例如Au＋HS-R-CH＝CH2产生Au-S-R-CH＝CH2，R由诸如(CH2)4组成。在液体介质中描述了这样的一个反应并且与先前的三氯硅烷-硅反应一样，导致其表面上的C＝C末端暴露于外界的分子层。
当然，术语“支持物”既可包括如一载玻片的单一表面，但也可是微粒，或者是硅粉或者是多聚体小球，并且也可以是一般形式如棒状，纤维状或有结构的支持物，此外，正如在各种分析技术中已知的，它们还可制成是磁性的、发荧光的或有色的。
当检测通过荧光完成时，选择的支持物最好不具或很少具荧光。
按照上面方法(A)或方法(B)获得的表面具有(i)很低的内部荧光水平，必要时，荧光背景噪音(100×100μm的一典型表面积)小于要被检测的单分子荧光信号；(ii)检测具有与分子数目无关的S/N比的分离分子的可能性，通过下述的并且基于对与表面有一周非特异性反应的宏观标记物之存在进行鉴定的高S/N比率的各种技术特征可实现这种可能性。
这样获得的表面最好用选自下面的具有生物活性的大分子涂层，— 蛋白质，— 核酸— 脂类— 多糖及其衍生物。
在蛋白质中，应提及抗原和抗体，配体，受体，抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素型产物，以及这些化合物的衍生物。
在RNAs和DNAs中，也应提及α、β衍生物以硫衍生物和诸如PNAs的复合化合物。
附着如糖肽及脂多糖的复合化合物或者作为选择如病毒，尤其是细胞，或者如生物素的化学化合物的其它成分也是可能的。
生物大分子的附着可以是共价的或非共价的，如通过吸附、氢键、疏水、离子相互作用如用已知方法(“Chemistry of Protein Coniu-gation and Crosslinking”，S.C.Wong，CRC Press(1991))转移的分子中优选形成交联且这样是为了增强它们的粘附力。
正如上面所提及，具有一个允许与有生物活性分子直接反应的裸露基团是可能的，但想象一下经附着后对裸露基团的处理以便于按照上述，在吸附生物分子之前，转化为一羟基、胺基、醇基、醛基、酮基、COOH基或一这些基团的衍生物也是可能的。
当这些基团被暴露，如蛋白质和/或DNA的附着技术已知，它们的确是对已用于生物分析的表面执行的反应，尤其是costar表面、Nunc表面或诸如生物目的分子、DNA、RNA、PNA蛋白质或抗体锚定于其上的如Estapor，Bang以及Dynal微球。
在裸露基团为一-CH＝CH2基(这以后称为“表面C＝C“或”具乙烯键的表面”)的情况下，没有提及尤其是DNA或蛋白质的直接锚定方面的资料存在。
在本发明的框架里，这些表面具有对PH高度依赖的反应性已被证实。这个特征使利用PH范围和可经常通过PH控制的反应速度锚定核酸或蛋白质成为可能。
DNA的锚定可通过其末端至具有乙烯双键基团的表面，通过使DNA与表面在PH不到8的情况下接触。
尤为特别的是，反应是在PH5～6之间进行，在PH为8时停止。
这样，对于PH5.5的DNA，锚定反应在1小时(如果其不受扩散限制)完成并且通过末端进行。另一方面当PH＝8时，附着很低(反应速度小5～6个等级)。这种末端特异的PH依赖性吸附效应较其它需要DNA(生物素、DIG、NHS以及类似物)活化或在-NH2和-COOH或-POOH之间形成肽键或磷酰键的特异性试剂(碳化二亚胺，二甲庚二酸盐)的表面是一个进步。
通过仅吸附其末端于一涂有多赖氨酸或具一胺基末端的硅烷基的表面来完成DNA锚定也是可能的。
为了通过其末端在一涂有胺基的表面上完成DNA的锚定，使DNA在PH8与10之间与表面接触。
同样，通过其末端于一预先经酸浴处理的玻璃表面来完成DNA的锚定是可能的，通过使DNA在PH5～8之间与所述表面接触。
不用说，本发明在同一实质上包括所有生物类大分子的任选PH依赖性吸附。
同样，这些表面能够直接锚定蛋白质(蛋白质A、抗-DIG、抗体、抗生蛋白链菌素及相关物质)。已观察到(i)分子的活性可被保持和(ii)为了感兴趣分子的单独反应性，备用表面(起始为C＝C)的反应性被完全遮住。因此，从一个相对较高的起始反应性开始，过渡到一个具有很高特异性反应性(如一蛋白质上的特异位点的反应性)的表面是可能的。
通过锚定一具体的抗体(如抗-DIG)于表面上，产生一限于抗原(如DIG基团)反应性的表面。这表示起初的化学基团被转移的抗体全部遮掩住。
转移其它具有生物活性的分子，尤其是病毒或其它成分尤其是膜、膜受体、多糖、PNA到反应(化学或生化)表面也是可能的。
附着生物类(如PCR)反应产物于准备好的表面也是可能的。
按照本发明的方法允许检测和/或生物分子的定量，但也可是分子内距离的测量，某些生物分子尤其是用抗原/抗体和/或DNA/RNA藕联技术的样品的分离。
尤为特别的是，本发明的主题是检测一大分子的方法，包括DNA序列或一样品中的蛋白质，按照本发明，其特征在于— 使大分子溶于其中的相应于溶剂A的样品与支持物的表面在形成-DNA/DNA，DNA/RNA杂交产物或形成蛋白质/蛋白质反应产物的条件下接触— 杂交产物或用于标记杂交或反应产物的大分子一部分被锚定，其余部分自由存在于溶液中，它被通过溶剂和表面的接触而形成的凹液面移动而伸展，以使定向杂交产物或所述的标记大分子并且杂交产物或因此定向的标记大分子的观察或测量得以完成。
具有优势的是，附着的DNA与样品的DNA有颜色差异并且伸展以后，相对于样品DNA末端的互补序列位置被测量。
在适当情况下，ELISA或FISH检测方法可被使用。
DNA样品可以是DNA酶扩增(如PCR)的产物或底物，那就是说一旦在其被按照本发明方法锚定和序列比较后或其锚定或序列比较前，DNA扩增便可开始。
以杆状形式线形伸展分子的凹液面移动，如果它们被标记，使其更容易检测。此外，这些延伸的分子在空气中稳定并且甚至在数月以后可以被观察而不显示明显的降解。
在一个再水化过程中，DNA分子可保持吸附和延伸状态。此外，在延伸分子上开展杂交是可能的。
此外，通过它们的延伸特点显示相关和一致方向的信号，这些分子是与周围噪音有区别的。因而很容易忽略灰尘，无特殊空间相关的不均一性。序列比较也重要因为在溶液中，一随机卷曲形式的分子要想波动，因而导致它们优选在较浅范围内聚集的荧光信号的很高差异并且限制它们的观察。本发明因而允许用很高的信号对噪音(S/N)比对分离分子的观察。
该比例与锚定分子数目无关是较显著的。分子检测所用的S/N比相当于10,000。此外，该伸展技术使容易地区分不同长度的分子成为可能。
为了更进一步改善S/N比，优选继续下面的阶段— 分子是静止的，其荧光信号可被整合。— 显微镜观察显示减小的视野(典型的为100μm×100μm，以一×100油镜，N.A.＝1.25)。对于一个1cm2样本，可进行扫描，或设想一下低放大倍数镜头(×10或×20)也是可能的，但必需具有高的数值孔径。— 杆总是平行的，为了进一步增加S/N比，设想使用光学空间过滤方法是可能的。— 其它诸如在European Patent Application EP 103426中描述的球形荧光方法可以使用。— 分子线形化是在生理化学锚定的范围内和免疫型键(DIG/anti-DIG)情况下观察。— 一旦表面暴露于空气中，DNA分子是稳定(它们甚至在几周后保持完整)和发荧光的。为了延迟锚定分子的锚定时期和定位/计数时期，该特性可被优选使用。例如如果该测定要进行，但又没有被荧光显微镜限定。这种用法被包括在本发明中。— 能够使用一对(或多个)荧光技术以提高S/N比或检测一双功能性。
·延伸的分子可通过各种酶学方法或其它方法如荧光，放射或非放射探针的使用来显示。它们的检测可通过测量球形信号(如荧光)或通过用荧光显微镜、电子显微镜、局部探测法(STM、AFM以及其它)对分子的单个观察来完成。
这样，一般来说，本发明允许在一样品中，通过特征在于使用了能够特异性吸附所述分子的表面和检测、分离或分析是用检测附着分子存在的试剂、荧光或其它(物质)来完成的方法对一分子的检测、分离和/或分析。
在试剂当中有荧光试剂和非荧光试剂。
荧光试剂包括荧光分子，优选的是大于0.1μm的长分子并且与预处理的表面特异地、直接或间接地反应。例如，(但没有限定被暗示)一通过荧光探针(溴化乙锭，YOYO，带荧光的核苷酸及诸如此类)染色的双链DNA分子能够通过一个或多个末端直接锚定于一任选具有乙烯或胺基及诸如此类(基团)的表面上，尤其通过明智的PH或介质离子浓度的选择或通过在表面上一电压的应用。
为了锚定其于一具有互补位点(抗-DIG，抗生蛋白链菌素及诸如此类)的表面上的一个或多个位点，对分子(DIG，生物素及诸如此类)使用一特殊的活化也是可能的。
按照本发明允许对先前进行过序列对比的分子进行检测的非荧光试剂可由尤其是通过另一个特异地、直接或间接附着于进行序列比较的分子锚定的并与表面仅具一微弱的非特异性相互作用的空心小球或微粒组成。
例如，按照本发明，可能提及涂有抗生蛋白链菌素的允许锚定于进行过序列比较的生物素化DNA的空心小球。
依据对所需分子是直接用荧光检测还是通过上述试剂手段间接检测，检测将被描述为“直接检测”或“信号(flag)检测”。
为了限制与反应时间太慢的有关的问题，试剂向表面的扩散时间可用小的反应体积被优先减小。例如，(但并不意味着是限制)，通过在由一个被处理以具有反应位点另一个在反应条件下失活或被处理以不具反应位点的两个表面间的空间所决定的几微升体积里进行反应。
小数量(典型地1～1000)序列比较的分子数目检测可通过一既不需要电镜也不需要放射性及必需PCR的低噪音宏观有形测试来完成。
按照本发明，序列比较和检测过程可由仅具有限实验室经验的人来完成。
一些生物反应的特异性也许会受到限制。这样，在杂交范围内，当配对数目减少并因此结合质量较低时，杂交也许是不完美的(与其定位点反应)。本发明也涉及到测试获得键质量阶段的可能应用。这种测试使离解通过吸附，疏水力、不完美氢键、尤其是不完美杂交而微弱和非特异性配对的产物是可能的。
因此，在上述的检测或分析过程中，本发明也涉及为了破坏检测前的错配而对具有生物活性分子与样品分子间的反应产物进行加压的方法。
除了破坏错配对的可能性外，该方法提供使测量或观察变容易的偶联产物定向的可能性。
因此，在互补成分的附着后，在表面上使用由单一或结合因素构成的压力是可能的— 离心，— 应用于非荧光试剂的磁场梯度，在这种场合，包括可磁化的或磁性小球，— 搅拌，— 液体流，— 凹液面移动，— 电泳，— 温度变化及/或温度梯度然后用上述的低噪音检测技术来测定保持完整的或被毁坏的系统数目。
按照本发明描述的序列对比和检测技术可用于多种应用中，其中包括(但不局限于此)— 可有优势地使用于病原体诊断或基因组的物理图谱的DNA或RNA序列的一个或多个成分的鉴定。尤其特别的是上述的技术使无需中间克隆步骤的使用而获得直接关于基因组DNA的物理图谱是可能的。应理解相对其结晶学长度被延伸的被梳分子，相关测量被完成。因此，用一200nm分辨率的光学方法或1nm如AFM或STM的近场(near freld)方法去观察和测量于被序列比较后DNA上的探针间距离，测量DNA片段大小和片段间距离是可能的。这自然导致1)基因组序列缺失、添加或易位的检测，尤其在遗传病(如Duchennés肌病)的诊断；2)通过测量调节序列和表达序列之间的距离对各种基因启动子的鉴定；3)通过鉴定它们沿DNA的位置或它们靶序列的位置对调节蛋白的定位；4)通过用近场显微镜(如AFM或STM)测量属于已知长度的单碱基寡核苷酸杂交探针间距离进行部分的或完整的测序，— 在被序列比较的DNA上原位酶促扩增；— 用检测微量(可能不到1000)免疫反应的可能性提高ELISA技术的灵敏度。
因此，无需中间使用克隆步骤，可直接地在基因组DNA上完成物理测序。提取基因组DNA、纯化并任选地用一种或多种限制酶裂解，然后按照本发明方法在表面上梳洗。
然后，基因组DNA中所需基因的大小和位置通过用对所述基因(尤其是从上述所需基因产物的互补DNA(cDNA)部分中提取的)特异性的探针杂交来测定。
同样，通过对梳洗过的基因组DNA进行杂交，然后与被荧光或任何其它允许杂交被定位的标记物标记的总体cDNA一起变性，鉴定目的基因的外显子位置大小和数目，并且从其中推断其大小和遗传结构(外显子、内含子、调节序列)。
基因的位置按照上面所述测定或已知后，通过杂交鉴定该基因的侧翼序列就成为可能。为做到这点，为了鉴定杂交于基因两侧任一侧的两个或更多个探针，通过用如从寡核苷酸文库中获得的标记探针进行杂交可有利地完成该程序。
根据这种测定，通过诸如原位PCR(Nuovo G.J.PCR in situ hy-bridizationprotocols and applications，Raven Press(1992))的酶促扩增技术可扩增由能作为反应引物的侧翼探针所限定的，含有所需基因及其具有组织或发育特异性的能被分离和纯化的调节区域之片段。
为了提取如Mortier etal(Yeast 5,321,1989)提及的与基因侧翼序列互补的DNA片段，通过在目的基因的cDNA中提取的引物上进行原位聚合反应也可完成该方法。然后这些片段可用于该基因及其侧翼序列酶促扩增过程引物的制备中。
也可使用由A.Thierry和B.Dujon(Nucl.Acid Research 20 5625(1992))引用过的，通过同源重组或随机将已知核酸内切酶特异性的位点插入到基因组DNA或基因组DNA片段中的方法。通过上述的原位杂交方法，该DNA的梳洗允许对感兴趣的基因及特异插入位点进行鉴定。如果感兴趣位点是与基因靠近的感兴趣区域，通过该鉴定方法并且优选将它们用作目的基因及其侧翼序列酶促扩增(原位及诸如此类)反应的引物。
然后，所需基因的扩增可用通过组成cDNA的外显子而得到的引物或相应于侧翼序列的引物，以诸如PCR的已知酶促扩增技术在上述的扩增片段上进行扩增。
通过对基因组DNA和类似物的梳洗，通过杂交也可测定特异性邻近基因调节序列的存在或缺失，从该序列，将可测定调节该基因的可能的蛋白质家族(例如螺旋-环-螺旋、锌-指亮氨酸拉链)。
按照本发明，在尤其是DNA/RNA/PNA序列和另一分子(DNA，RNA，蛋白质)之间的特异反应可在分子序列比较前或比较后进行。
这样，在遗传诊断及物理测序领域里，已知的FISH方法(Pinkelet al.，Proc.Nat.Aced.Sci.USA 83，2934(1986))有利于杂交用先进行过序列比较然后变性的DNA标记的单链寡核苷酸。杂交结果显示将以在距离测量中分辩率以0.2μm(光学上)到1nm(通过近场显微镜；AFM，STM及类似仪器)的已知技术(荧光、微球及诸如此类)来完成。
作为选择，可首先将荧光标记物DNAs与单链DNA在溶液中杂交，然后在其转化为双链DNA并锚定于一适当的平面上后，通过凹液面行为对该结构进行序列比较。
也可使用本发明方法检测病原体的存在。例如，依据在通过凹液面的序列比较之前或之后发生识别反应(杂交、蛋白质吸附)用两种不同的方式来完成该方法。
这样，通过举例，一个或几个寡核苷酸探针被锚定于表面上的一个或多个区域。在严格的条件下进行潜在病原体DNA的原位杂交以使得只锚定杂交的分子。按照本发明，在经过凹液面的序列比较后进行它们的检测和定量。
作为选择，潜在病原体DNA先进行序列比较，然后变性并在严格的条件下与寡核苷酸探针杂交。然后杂交的检测通过上述的已知方法，尤其是FISH方法进行。
同样地，可检测诸如蛋白质、脂类、糖或抗原的小批量分子。对ELISA技术略作修改将具有优势，因为普通的检测方法被按照本发明进行过序列比较并且与ELISA反应试剂之一相偶联的荧光分子之检测所替代。
此外，正如K.R.Allan等(US 84114)所提及的，遗传图谱可通过测量DNA片段的大小来完成。现在，上述(通过凹液面伸展)的伸展分子的新技术允许测量伸展分子的长度，并且这是在很小的样品中(几千个分子)进行的。
例如(但不局限于此)，按照下面方式完成步骤是可能的一切割DNA样品(通过限制酶手段)，用荧光团染色，然后锚定于表面上。分子然后通过凹液面伸展并且伸展片段的大小用一分辩率及最大为1000bp(0.3μm)大小的荧光显微镜测定。
为达到这个目的，而且需要对很长分子(≥10μm)进行序列比较，为了限制在其处理过程中长分子的降解(由水力切割)，已知的技术将被优先使用。
因此，正如D.C.Schwartz所提及的，在它们的处理过程中，通过浓缩剂(例如精胺或醇)对分子的浓缩将被优先执行。任选地，在溶剂A和锚定表面S之间的接触过程中，它们的解浓缩将会发生。
为了减少通过凹液面伸展过程中大分子的降解，可用使水力剪切降到最小的凹液面平移技术。例如，但并不意味着限定通过从溶剂A的有形体积(≥100μl)极缓慢地撤走(≤200μ/秒)表面S。
具一种或多种类型按照本发明获得的进行过序列比较的大分子的表面也是本发明的主题。尤其特别的是，可获得一个或一叠具有各向异性光学或电学性质的表面。
本发明的目的还有对DNA进行序列比较和测定的方法，其中按照本发明通过序列比较方法伸展DNA，然后进行变性并用特异性探针杂交以测定一个或多个特异性序列的位置和大小。
本发明的目的还有对基因组DNA中某一基因进行物理图谱绘制的方法，其中按照本发明方法对DNA进行序列比较和检测。
具体地说，基因组DNA中所需基因的位置和大小通过用对要被作图的所述基因具有特异性的探针进行杂交来测定。
本发明的目的还有—按照本发明对开展作图过程有用的试剂盒，由参考宿主的总基因组DNA组成，—具有按本发明方法允许对病人的DNA进行锚定和序列比较的表面的一支持物，—对要被作图基因具有特异性的探针以及用于DNA杂交和检测的试剂。
本发明的目的还有对DNA进行序列比较和检测的方法，其中为了测定所述序列比较DNA中一个或更多个DNA序列的存在与否，先伸展DNA，然后变性并与特异性探针杂交。
本发明使涉及对病理特异的DNA序列的存在与否的病理学诊断的方法得以实施，其中使用按照本发明的序列比较方法。
本发明的目的还有按照本发明对完成诊断方法有用的试剂盒，其特征在于其包含按照本发明方法其表面可对病人DNA锚定和序列比较的支持物，对涉及所寻病理学基因特异的探针以及DNA杂交和检测的试剂。
本发明的目的还有按照本发明对完成诊断方法有用的另一试剂盒，其特征在于它含有表面具有对涉及病理学基因、尤其按照本发明方法被序列比较过的任选标记的病原体DNA及任选变性的基因特异的探针的支持物；用于为杂交(例如光生物素、缺口转译或随机引物试剂盒)而制备和标记病人DNA的试剂以及用于按照上述原位杂交技术进行DNA杂交和检测的试剂。
应懂得关于不同病原体的被梳洗的探针可置于不同的支持物上或相同的支持物上。相应病原体的鉴定可在杂交以后，以空间上(例如在其梳洗之前，不同探针通过光化学锚定而被空间分离)或通过源自一先前探针的分化标记而导致不同杂交产物荧光光谱的差异而进行。
最后，本发明的主题是一制备基因的方法，其中按照本发明方法被序列比较的位于基因组DNA中的所述基因位置通过对所述基因、所述基因序列特异的探针手段鉴定，并且任选地其侧翼序列尤其被通过原位PCR的酶促扩增所扩增。
因此，本发明使通过借助于含有按上面基因制备方法制备的所述外源基因的载体定向插入一外源基因而在真核细胞基因组中完成基因替代的方法成为可能。
定向插入可根据WO90/11354描述的技术，通过用一含有其两侧夹在受体基因中与所需插入位点相邻的2个基因组序列的要被插入的外源DNA的载体转染真核细胞来完成。插入DNA可包括编码序列，或者调节序列。选择侧翼序列以使通过同源重组，依据情况，允许在受体基因调节序列控制下插入DNA编码序列表达，或者是在插入DNA调节序列的控制下，受体基因编码序列表达。
基因组基因及用按照本发明的定位基因方法获得的cDNAs可被插入到能够被插入原核、真核或病毒宿主细胞表达的载体中。本发明包括获得的蛋白质、多肽及肽。
下面是参考附图所做的描述—

图1以图示描述了用通过与锚定分子杂交的荧光DNA分子对病原体的检测；— 图2图示了通过DNA延伸和标记DNA的使用进行的遗传图谱；— 图3图示了通过借助于“信号”(flag)分子(用作反应标记物的荧光DNA)对免疫反应的检测(ELISA)；— 图4为一通过凹液面移动显示入噬菌体DNA延伸的荧光显微图，从左边可看到通过平行于凹液面的蒸发流而在溶液中被伸展的DNA分子，经垂直于凹液面伸展后暴露于空气中的DNA分子可在右边看到；— 图5(a)和5(b)分别是显示在覆盖有抗-DIG的表面上被di-gogixenine[sic](DIG)标记的并被凹液面伸展的DNA和，作为对照，在抗-DIG表面上的未标记DNA的荧光显微图；表面的极高特异性和非特异性锚定的缺失被注明；— 图6描述了通过凹液面移动DNA伸展的简单模型。溶液中的DNA被锚定于处理过的表面上。DNA溶液以未处理的圆形盖片覆盖；— 图7描述了玻璃表面上被梳洗的λDNA分子长度的直方图a)用末端具有胺基的硅烷分子覆盖，b)用多聚赖氨酸覆盖，c)在过氧化氢/硫酸混合物中清洗；— 图8显示了涂有多聚赖氨酸表面上的被梳洗的DNA分子。可注意到通过其两个末端被吸附的分子形成环；— 图9显示了通过从这些分子的溶液中撤离处理过的盖片而被梳洗的YACs；— 图10显示通过原位杂交对YAC上的质粒存在和大小的鉴定。
在“诊断”模式中，探针(“锚定物”)具有一个按照本发明(例如具有锚定一抗-DIG抗体或抗生蛋白链菌素的位点)能够特异地锚定于表面的反应基团(DIG，生物素及诸如此类)。锚定反应的检测可直接通过对被荧光分子(溴化乙锭，YOYO，荧光核苷酸)染色的DNA分子荧光的检测来完成(图1)。其也可通过“信号分子”(能够附着到DNA/RNA分子(如通过杂交、蛋白质DNA相互作用及类似作用)，但对探针的锚定位点不具亲和力的试剂)的检测间接完成。
在“作图”模式中，可使用原位杂交技术(FISH)。设想其它技术如通过在溶液中，按照本发明用具有荧光试剂的探针杂交DNA也是可能的。按照本发明探针位置的检测是在对分子进行序列比较后进行的。实施例1材料和方法λDNA和单克隆抗体(抗-DIG)获自Boehringer-Monnheim。三氯硅烷获自Roth-Sochiel。荧光核酸探针(YOYO1，YOYO3及POPO1)获自Molecular Probes。超净盖玻片获自Erie Scientific(ES-CO)盖片)。磁性颗粒获自Dynal。显微镜是NIKKON Diaphot倒置显微镜，装有表面荧光(epifluorescence)氙灯和Hamamatsu增强的CCD视像相机。表面处理玻璃盖片在氧气环境中通过紫外辐射(通过臭氧的形成)清洗1小时。然后将它们立即置于一预先用氩气流吹净水的干燥器中。将体积约100～500μl的合适的三氯硅烷(H2C＝CH-(CH2)w-Sicl3)引入表面在12小时(n＝6)或1小时(n＝1)后从其中撤出的干燥器。到取出时，表面洁净且无水。
这些双键表面(H2C＝CH-)的功能基团可通过将上述处理过的盖片浸于在1l水中含有25mgKMno4、750mgNaIO4的溶液中约10分钟转换成羧基(-COOH)，然后用超净水洗三次。
这样活化的盖片可与蛋白质起反应。300μl体积的蛋白质(蛋白质A、抗生蛋白链菌素及类似物)水溶液(20μg/ml)置于用(H2C-CH-基团活化的盖片上。盖片在室温下温育约2小时，然后用超净水冲洗三次。经这样处理的表面洁净且湿润。用蛋白质A处理的表面然后可通过在20μg/ml抗体溶液中温育，与如抗-DIG的抗体起反应。
此外，在具有羧基的表面上，可嫁接具有胺末端(-NH2)的寡核苷酸，将200μlMES溶液(50mM，PH55)，碳化二亚胺(1mg/ml)及5μl氨基-寡-核苷酸(10pmol/140μl)置于羧化的表面上并在室温下温育约8小时。盖片最后在NaOH(0.4M)中冲洗3次并且然后用超净水洗4次。这样制备的盖片可杂交与锚定寡核苷酸互补的DNA。
在双键表面上天然DNA的锚定将不同浓度的并且位于不同缓冲液(分子总数＜107)的一滴2μl的荧光标记λDNA(YOYO1，POPO1或YOYO3，但不具特异的末端标记)置于预处理过的盖片(C＝C)上并且用未处理的玻璃盖片(直径18mm)覆盖。制备样品在饱和水蒸汽环境中室温下温育约1小时。实际上，在0.05M MES缓冲液(PH＝5.5)中，观察到DNA分子的普通锚定。相反，在0.01M Tris缓冲液(PH＝8)中，事实上没有被锚定的分子(比率＞106)。这种依赖性使通过PH控制表面的激活/失活(关于DNA)成为可能。
凹液面对分子的作用限于其邻近。在凹液面前面溶液中分子的部分自由地波动并且留在凹液面后面粘附在表面的部分对凹液面方向变化不敏感。因此，分子的延伸比率是一致的并且与其大小无关。通过凹液面作用对锚定的序列比较和检测通过把先前的制品转移至干燥的环境中，溶液将依靠蒸发，垂直于凹液面地伸展锚定于表面上的DNA分子。DNA分子的毛细力量(几十皮可牛顿)的确足以完全地伸展分子(大于熵的弹性力)，但太微弱而不能打断分子末端和被处理表面之间的键。由于DNA已被荧光标记，因此可单个地并且容易地观察到伸展的分子(总长度约22μm)。由于表面和DNA之间的锚定限于末端，故入噬菌体YAC、DNA，或者E.coli(总长度大于400μm)DNA可伸展。该伸展的、发荧光的并且暴露于空气中的DNA制品在数日内是稳定的并且可通过表面荧光(带有一个×100镜头的Nikkon Diaphot倒置显微镜，O.N.1.25)用非破坏性方式观察。特异的锚定和检测按照上述用特异的单克隆抗体处理表面，可很准确地控制它们的特异性。因此，在涉及与互补于CoS末端寡聚核苷酸杂交的并拥有毛地黄苷毒基团(DIG)的λDNA中及涉及非杂交的DNA中，测试了抗一DIG处理过的表面的特异性。在第一种情况，通过凹液面作用，观察到了被锚定分子的实际上是普通的伸展。在第二种情况下，在整个样品中仅观察到了少数几个被锚定的DNA分子(＜IO)。因此，按照本发明，估计本方法的特异性大于106。
按照上述，λDNA也用互补于CoS末端之一的寡核苷酸杂交并且附着于羧化的表面。杂交条件(纯水40℃)不严格，因为在严格条件(高盐)下YOYO1探针的荧光消失并且被杂交的DNA不能看到。对通过凹液面移动被这样杂交的DNAs序列比较也是可能的。检测的敏感性为了测定通过凹液面延伸的检测方法的敏感性，2.5μl含有总量为105，104及1000分子的溶于0.05M MES(PH＝5.5)中的λDNA溶液滴被置于双键表面。锚定和序列比较按上述完成。然后以表面荧光显微镜观察盖片以测定被梳洗分子的密度。后者的确与估计的那个相对应对于总量为105的DNA分子，每视野(100μm×100μm)约4～6个DNA分子。对于最低浓度，观察到约10个通过凹液面作用延伸的分子。这个数目实际上受到要求覆盖整个样品(约25,000)的视野的大数目所限制，这将使人工搜索困难，但其可自动地或者也用较弱的但具有大视野的镜头有利地完成。总之，按照本发明该方法的敏感性使不到1000个DNA分子的检测和单个计数得以实现。
伸展对表面处理的依赖嫁接于不同表面并且然后通过凹液面移动而进行序列比较的λDNA长度直方图显示良好的限定峰但因不同表面而不同。因此，在涂有末端具乙烯基的硅烷的表面上，对于以胺基(-NH2)硅烷化的表面，DNA被伸展至约22μm(见上)，直方图在21μm有一峰(图7(a))并且在干净玻璃上在约18.5μm处(图7(c))。
因此，伸展依赖于表面处理。实施例2在不同表面上DNA分子的梳洗观察了用不同方法处理的玻璃表面上DNA的分子梳洗利用了在分子末端和分子其余部分之间的吸附差异。通过吸附带正电荷的多聚体于玻璃表面上，增强了对带负电荷的DNA分子的吸附，然而当这种电荷较大时，粘住了DNA分子的整个长度，因此梳洗是不可能的。然而，可通过改变PH条件来改变吸附于玻璃上多聚体电荷，事实上，例如可通过NH2基携带正电荷，它在低于相应碱的PK的PH条件下传递给质子化状态的NH3+。在碱性PH，电荷消失并且表面不再吸附DNA。通过精细地控制PH，在溶液中可观察到DNA分子从完全吸附于表面状态过渡到仅其末端被锚定的中间时期并且然后过渡到表面不再对DNA吸附的时期。在中间时期，可完成分子梳洗。
研究了涂有末端具NH2的硅烷的表面，在其上面，观察到PH＜8时完全吸附，并且梳洗在8.5＜PH＜9.5。被梳洗分子的数目在PH＝8.5时最大，PH＝9时减半，PH＝9.5时减少到四分之一。正如在描述玻璃表面上被梳洗的λDNA分子长度直方图的图7中的直方图2中所看到的一样，也测定了在这种对应于1.26表面上的相对延伸a)涂有末端具氨基的硅烷；b)涂有多聚赖氨酸；c)在过氧化氢/浓硫酸混和物中清洗过。
涂有多聚赖氨酸的表面也被测试并且发现对于PH显示类似的吸附特征梳洗区8.5并且显示出更短的相对延伸1.08。典型的实施例可在描述涂有多聚赖氨酸玻璃表面上梳洗的DNA分子的图8中获得。可观察到通过其2个末端被吸附的分子形成环。
最后，相同的行为在被过氧化氢/浓硫酸混和物新洗过的玻璃表面上发现。这些表面是高度湿润的并且很快被污染；然而，观察到PH在5.5～7.4之间的梳洗区而强吸附区位于PH＝4.5。分子的相对延伸对应于1.12。实施例3YAC一致的且定向的序列比较在其琼脂糖填料中通过YOYO1荧光探针手段预先染色的1μgYAC加热至68℃，脱琼脂糖(agarased)并且然后稀释于10mlMES(50mM PH5.5)。将两个硅烷化的盖片(C＝C表面)在该溶液中温育约1.5小时，然后以约170μm/sec(速度)撤离。所有YAC分子以平行于盖片撤离的方向进行序列比较(图9)。这样进行序列比较的分子的整体性好于通过在两盖片间沉积后的蒸发。具有梳洗YAC质粒的杂交按前面描述染色的YAC被锚定于C＝C表面(两盖片之间)上，然后在溶液蒸发过程中通过凹液面进行序列比较。探针(质粒)用随机引物技术通过生物素化的核苷酸的插入被标记。被标记探针(100ng)和5μg sonicated鲑鱼精DNA(≈500bps)用在醋酸钠及乙醇中沉淀来纯化，然后在福尔马林中变性。
被梳洗的YAC在80℃加热板上用120μl变性液(70％福尔马林，2×SSC)在两个盖片间变性3分钟。预先变性的探针(20ng)置于用橡胶泥封闭的盖片覆盖的杂交液(55％福尔马林，2×SSC，10％硫酸葡聚糖)中的盖片上。杂交在37℃温室中过夜完成。
杂交的检测按照已知的在去凝集染色体上的原位杂交方法完成(D.Pinkel et al.，PNAS USA 83，2934(1986)and PNAS USA 85，9138(1998))。
诸如在图10中所示的杂交片段然后用荧光显微镜观察。该实施例显示了可用于诊断目的或基因组物理图谱的检测DNA分子上基因存在的可能性。
权利要求
1.对一个大分子(多个大分子)在支持物表面S上进行序列比较的方法，其特征在于引起在溶剂A、表面S和介质B之间接触形成的三重线S/A/B(凹液面)在所述的表面S上移动，所述的大分子具有一部分，尤其是一个末端被锚定于表面S上，另一部分尤其是另一端存在于溶剂A的溶液中。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于凹液面的移动通过溶剂A的蒸发来实现。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于凹液面的移动通过A/B界面相对于表面S的相对移动来实现。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于为了移动凹液面，使表面S从溶剂A撤离或溶剂A从表面S撤离。
5.根据权利要求1至4之一的方法，其特征在于凹液面是水/空气凹液面。
6.根据权利要求1～5之一的方法，其特征在于支持物至少在表面由有机或无机多聚体、金属、金属氧化物或碳化物、诸如硅的半导体元素或半导体元素氧化物或其结合物之一组成。
7.根据权利要求1～6之一的方法，其特征在于支持物至少在表面由玻璃、表面氧化的硅、金、石墨、钼硫化物或云母组成。
8.根据权利要求1～7之一的方法，其特征在于支持物是以平板、小球、纤维或颗粒系统形式存在。
9.根据权利要求1～8之一的方法，其特征在于要进行序列比较的大分子存在于其中的溶剂A置于两支持物之间，其中一个至少对应于表面S的所述支持物，并且凹液面通过蒸发来移动。
10.根据权利要求1～9之一的方法，特征在于大分子的锚定是通过理化作用，尤其是通过吸附或通过共价键，通过表面和大分子之间直接的或者表面与识别和/或与所述大分子相互作用的另一分子之间间接的相互作用来实现。
11.根据权利要求1～10之一的方法，其特征在于使用了表面具有裸露的对所述的大分子或对能够识别所述大分子的具有生物活性的分子具有亲和力的反应基团的支持物。
12.根据权利要求1～11之一的方法，其特征在于表面用选自乙烯基、胺基、羧基、醛基或羟基的基团覆盖。
13.根据权利要求10和12两者之一的方法，其特征在于表面包含— 在支持物上，基本上为延伸结构的有机化合物单分子层，至少具有·对支持物具有亲和力的附着基团和·对所述支持物和所述附着基团在附着条件下不具有或具有很小亲和力的裸露基团，但经下面附着后的化学修饰后，对所述大分子或具有生物活性的分子任选地具有亲和力。
14.根据权利要求1～13之一的方法，其特征在于大分子一部分的锚定通过在表面上的吸附完成，通过使所述大分子与所述表面在测定的PH区域或介质离子浓度下接触或通过在锚定表面上施用测定的电压。
15.根据权利要求1～14的方法，其特征在于进行锚定的PH选自完全吸附状态所需的PH和无吸附状态所需的PH之间的范围。
16.根据权利要求1～15之一的方法，其中核酸或蛋白质的锚定是通过在具有含乙烯双键或胺基基团的表面上，用使核酸或蛋白质与表面在测定的PH或介质离子浓度范围内接触的吸附来完成。
17.根据权利要求16的方法，其特征在于未活化DNA的锚定是通过在用末端具有乙烯基或胺基的分子覆盖的表面上的吸附来完成。
18.根据权利要求17的方法，其中DNA的锚定是通过其末端在具有乙烯双键基团的表面上，用使DNA与表面在PH＜8的条件下接触来完成。
19.根据权利要求18的方法，其特征在于反应在PH5～6之间进行，然后在PH＝8时终止。
20.根据权利要求17的方法，其特征在于DNA的锚定是通过其末端在用多聚赖氨酸或末端具有胺基的硅烷基覆盖的表面上来完成。
21.根据权利要求17的方法，其特征在于DNA的锚定是其末端在涂有胺基的表面，用使DNA与表面在PH8～10之间接触来完成。
22.根据权利要求17的方法，其特征在于DNA的锚定是通过其末端在预先在酸浴中被处理的玻璃表面上，使DNA与所述表面在PH5～8之间接触来完成。
23.具有根据权利要求1～22之一的方法获得的进行过序列比较的大分子的表面。
24.在样品中检测、分离和/或分析大分子的方法，其特征在于使用了根据权利要求1～23之一的序列比较方法，其中能够识别所述样品大分子的具有生物活性的分子被附着于表面S上，并且其特征在于检测、分离或分析是用检测附着分子或所述大分子存在的试剂、荧光或其它物质来完成。
25.根据权利要求1～24之一的方法，其特征在于所述的大分子和具有生物活性的分子是选自蛋白质、核酸、脂类、多糖及其衍生物。
26.根据权利要求24的方法，其特征在于所述大分子和具有生物活性的分子是选自抗体、抗原、DNAs、RNAs、配体或其受体以及其衍生物。
27.根据权利要求24-26的方法，其特征在于附着的DNA含有与样品中待分离的DNA序列互补的序列。
28.根据权利要求24～26的方法，其特征在于附着蛋白质能够特异性地识别和附着样品中待分离的蛋白质。
29.根据权利要求24～26的方法，其特征在于所述具有生物活性的分子是选自生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素及其衍生物或抗原抗体系统。
30.根据权利要求24～26的方法，其特征在于表面显示低荧光并且在于试剂是发荧光的。
31.根据权利要求24～26的方法，其特征在于试剂由小球组成。
32.根据权利要求24～26之一的方法，其特征在于检测是通过光学或近场显微镜来完成。
33.根据权利要求24～26之一的方法，其特征在于为了破坏检测前的错配，对具有生物活性的分子与样品的大分子之间的反应产物进行强制。
34.根据权利要求24～33之一的检测由样品中DNA序列或蛋白质组成的大分子的方法，其特征在于— 在形成DNA/DNA，DNA/RNA杂交物或形成蛋白质/蛋白质反应产物的条件下，使所述大分子溶于其中的相应于溶剂A的样品与支持物表面接触，— 由于标记杂交物或反应产物的杂交物或大分子一部分被锚定，其余存在于溶液中，因此，它通过由溶剂和表面间的接触而形成的凹液面的移动被伸展以定向杂交物或所述的标记大分子并且完成对由此定向的杂交物或所述标记大分子的测量或观察。
35.根据权利要求24～34之一的方法，其特征在于附着的DNA和样品DNA有区别地被“着色”并且延伸以后，测量相对于样品DNA末端的互补序列位置。
36.根据权利要求24～35之一的方法，其特征在于使用ELISA或FISH检测方法。
37.根据权利要求24～36之一的方法，其特征在于样品是核酸酶促扩增的产物或底物。
38.根据权利要求24～37之一的方法，其特征在于DNA被延伸，然后变性并且用特异的探针杂交以测定一个或更多个测定的DNA序列的位置或大小。
39.对基因组DNA中某一基因进行物理图谱的方法，其中DNA根据权利要求1～38之一的方法被序列比较和/或检测。
40.根据权利要求39的方法，其特征在于基因组DNA中的所需基因的位置和大小通过用对待作图的所述基因特异的探针杂交而被测定。
41.对完成根据权利要求39和40两者之一的方法有用的试剂盒，其中包括—来自参考宿主的总基因组DNA，—具有允许对DNA锚定和序列比较的表面的支持物，—对要被作图的基因特异的探针和—DNA杂交和检测的试剂。
42.根据权利要求34～37之一的方法，其特征在于DNA被延伸，然后变性并以特异的探针杂交以测定一个或更多个给定DNA序列的存在或缺失。
43.诊断涉及对所述病因特异的给定DNA序列之存在或缺失的病因的方法，其中使用了根据权利要求42的方法。
44.对完成根据权利要求43的诊断方法有用的试剂盒，特征在于其包括—其表面允许病人DNA的锚定和序列比较的支持物，—对涉及所寻病因的基因特异的探针和—用于DNA杂交和检测的试剂。
45.对完成根据权利要求43的诊断方法有用的试剂盒，其特征在于其包含—支持物，其表面具有对涉及目的病因中的基因特异的探针，所述探针在表面上被锚定和序列比较；—用于标记DNA，尤其是病人DNA的试剂；—用于DNA杂交和检测的试剂。
46.从基因组DNA中制备基因的方法，其特征在于用权利要求1～27之一的方法被序列比较的基因组DNA中的所述基因的位置借助于对所述基因特异性的探针来鉴定并且完成所述基因和/或其侧翼序列的酶促扩增和分离扩增产物。
47.含有用权利要求46的方法制备的基因的DNA构建体，任选地与同源或异源调节序列相联系。
48.用根据权利要求46的方法获得的基因的应用，用于制备在真核细胞基因组中以外源基因的定向插入取代某一基因的方法中有用的DNA构建体，所述外源基因通过用权利要求46的方法获得。
49.在通过所述外源基因的定向插入在真核细胞基因组中取代某一基因的方法中有用的载体，其特征在于所述外源基因根据权利要求46的方法制备。
全文摘要
在支持物的表面(S)上对一个或多个大分子进行序列比较的方法，其中由于溶剂(A)与表面(S)接触而形成三重线S/A/B(凹液面)并且介质(B)移动于所述的表面上，所述的大分子有一部分，尤其是一末端锚定在表面(S)上，且别的部分或另一末端溶于溶剂(A)。还公开了用于揭示、测量样品中的分子内距离，分离和/或分析大分子的方法，其中进行所述的序列比较方法。
文档编号C12Q1/68GK1144540SQ9519217
公开日1997年3月5日 申请日期1995年2月10日 优先权日1994年2月11日
发明者D·本希蒙, A·本希蒙, F·汉斯罗特 申请人:巴斯德研究所, 国家科研中心