Dna序列的制作方法

专利名称：Dna序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码人体因子IX(fIX)的DNA序列。该序列可用于包括转基因动物在内的因子IX表达系统，并具有潜在的基因治疗用途。
要想在异源系统，尤其是转基因系统中获得因子IX的高表达产率是困难的。例如，尽管由β-乳球蛋白驱动的人体因子IX在转基因动物，如羊的乳里的转基因表达(如WO-A-8800239所公开的)基本方法是有效的，但所得到的产率很低。这似乎是由两个主要原因造成的错误的表达。因子IXcDNAs的使用通常会遇到这样一个问题，即难于获得理想水平的适当的fIX转录物。这一问题可通过转基因拯救方法(见WO-A-9211358，“Increased Expression by a SecondTransferred Sequence in Transgenic Organisms”)得以部分地解决。在该现有公开文件中，β-乳球蛋白(BLG)与编码人体因子IX的构建物FIXD的共整合，会导致能表达高水平FIXD mRNA的鼠系的产生。但在这些动物的乳中只含有极少的fIX。
异常剪接。通过严格检查BLG+FIXD鼠中的FIXD mRNA转录物证明，它比预计的长度短了大约450bp。据推测，这些碱基很可能是由于mRNA的异常剪接而从内部缺失的(Clark等，Bio/Technology10，1450～1454，(1992))。
在J.Biol.Chem.270，5276-5281(1994)(Kurachi等)中对人体因子IX mRNA在肝细胞中的剪接进行了讨论。这篇文章指出，剪接信号序列的存在能导致因子IX表达的增加，因为剪接复合体在前体mRNAs从细胞核中转移出来之前起着保护其免受随机降解的作用。
业已证实，异常剪接确实是因子IX在异源或转基因表达系统中产率低的一个原因。而且，最明显的是弄清了隐敝剪接位点在编码因子IX的人体基因上的位置。这一发现使得我们能够制造出编码因子IX的DNA序列，以避免所观察到的异常剪接。
根据本发明的第一个方面，提供了一种带有编码一种具有人体因子IX活性的蛋白质的序列的DNA，其中，对该DNA进行修饰，以便影响至少下列隐敝剪接位点之一的功能(a)包括mRNA核苷酸1086的供体位点；和(b)包括mRNA核苷酸1547的受体位点；采用的是附图的图2中的mRNA核苷酸编号。
本发明的DNA能使fIX的表达水平比迄今所公开的通过修正fIX序列的异常剪接所能达到的水平高。
核前体mRNA(即在剪接产生输送到细胞质中的mRNA之前短暂地存在于细胞核中的初级基因转录物)上的供体位点带有核苷酸GU，剪接之后它成为切除的内含子的5’末端核苷酸。核前体mRNA上的受体位点带有核苷酸AG，剪接之后它成为切除的内含子的3’末端核苷酸。在前一段落中给出的核苷酸编号是分别针对(5’)供体位点的G残基和(3’)受体位点的G残基的。
本发明的优选DNA能编码野生型人体因子IX。不过，编码变体(特别是来自共有序列的等位变体)、保守突变或其它蛋白质的DNA也在本发明的范围内，只要该蛋白质与人体因子IX基本上同源。正如在本领域中普遍理解的，“基本上同源”既可在蛋白质水平上评价也可在核酸水平上评价。例如，在蛋白质水平上，如果候选蛋白质与人体因子IX的氨基酸同源性至少为40、60、80、90、95或99％，而且越高越好，就可以说是基本上同源。在核酸水平上，如果候选DNA序列与人体因子IX的DNA序列至少有80、90、95或99％同源性，而且越高越好，就可以说是基本上同源。
应该知道，本发明可应用于编码因子IX(或具有因子IX活性的其它蛋白质)的各种DNA序列。具体地讲，本发明可应用于cDNA序列、具有天然内含子的完整补体的基因组序列和带有存在于编码因子IX的基因组DNA上的某些而不是所有内含子的“小基因”序列。
为了避免或至少是显著降低异常剪接，有多种修饰本发明的DNA以便影响隐敝供体/受体位点的功能的方法。
首先，在附加的内含子5’或3’与隐敝剪接以某种方式“竞争”的基础上，该构建物的内含子/外显子结构可以改变。不过，这种方法比较复杂，而且仅能部分抑制异常剪接。
其次，可以用工程法除去隐敝供体位点。mRNA供体位点上的G或U可被其它碱基取代，或者两者都被取代，只要这种变化不产生终止密码即可。该方法在技术上比上述的竞争内含子法简单，但必需改变因子IX的氨基酸序列，因为供体位点上的GU残基构成了缬氨酸密码子的前两个核苷酸，而且所有的缬氨酸密码子都是由GU开始。这可能不是缺点，而且，如果要制造次级或下一代因子IX的变体的话可能还是优点。然而，如果必须至少在供体位点范围内保留野生型因子IX序列的话，它就不合适了。
再者，而且在多数情况下理想的是，可用工程法除去隐敝受体位点。该位点位于因子IX DNA的3’非翻译区，所以与氨基酸序列无关。mRNA受体位点的A或G可以缺失或是被其它碱基所取代，或者这两个碱基同时缺失或被取代。事实上，在本发明的一些最简单的实施方案中，该受体位点的缺失，仅要求产生在3’末端被截短的因子IX cDNA片段(或者，当然也可以是被相应地截短了的DNA而不是cDNA)。在其它实施方案中，可将定点诱变技术专门用于改变受体位点(或当然也可以是供体位点)。
本发明的DNA可用于用来表达因子IX(或类似蛋白质)的系统。
根据本发明的第二个方面，提供了一种表达宿主，它包括与一个表达控制序列可操作地连接的根据本发明的第一方面的DNA。表达控制序列通常包括一个启动子，并且还可以有其它调节序列。
尽管本发明可普遍用于各种不同的细胞类型和培养的细胞，但它特别适用于转基因动物表达系统，因为原则上讲可由该技术获得高产率。因此，在某些优选实施方案中，表达宿主是动物，如哺乳动物。
用于产生异源蛋白质的优选转基因系统涉及转基因的有胎盘非人哺乳动物，特别是羊和其它产乳动物，这些动物可以在乳蛋白启动子，特别是乳清蛋白β-乳球蛋白的控制下，在(成年雌性的)乳腺中表达转基因，参见WO-A-8800239、WO-A-9005188和WO-A-9211385。
不过，本发明并不局限于这些优选转基因系统的应用。预计编码因子IX的序列可用于血友病的基因治疗方法，例如，用逆转录病毒载体或直接转染技术将其导入干细胞。不会发生异常剪接的改善的fIX序列的优点是不言而喻的。
可以对本发明每一方面的特征做必要的变化。
将通过以下的实施例对本发明进行说明。实施例与附图相应，其中

图1与例1相应，它是用于证实FIXD构建物的异常剪接的示意图；图2也与例1相应，引自Anson等，The EMBO Journal3(5)1053-1060(1984)，它表示因子IX mRNA中隐敝供体和受体位点的位置；图3与例1相应，更详细地表示供体和受体位点如何相互作用；该图还表示用于供体和受体位点的通用共有序列；图4表示人体因子IX基因的总体结构，包括隐敝剪接位点的位置；图5与例2相应，表示用于区分不同表达系统中不同构建物的未剪接和异常剪接的mRNA的以PCR为基础的示意图；图6与例3相应，表示被称为FIXD Δ3’剪接体的构建物的构建；图7与例4相应，表示的是对来自能高产率表达人体因子IX的转基因鼠的乳的Western印迹分析结果。在非还原条件下对来自FIXD Δ3’剪接体系(313 1.2和31.3)的两种动物的乳样进行电泳。乳样被稀释1/200，分别加样5μl或10μl。fIX，10ng fIX；CM，对照乳；CM+fIX，对照乳+10ng fIX；和图8也与例4相应，它表示以因子IX-特异性探针进行检测的来自FIXD-Δ3’剪接体鼠的典型RNA样品的Northern印迹。将来自高度和中度表达BIX鼠(BIX33.1和BIX34.1)的乳腺RNAs与来自FIXDΔ3’剪接体转基因鼠(标记的BIXΔ3’3.10-BIXΔ3’44.2)的乳腺样品进行比较。用标记过的来自p5G3’CVII(一种带有人体fIX cDNA序列的质粒)的插入片段对印迹进行检测，并用GAPDH进行再检测，以控制加样量。转录物的大小得到确认。FIXDΔ3’-剪接体转录物明显大于来自BIX鼠的转录物。例1构建物FIXD的异常剪接通过用RT-PCR对来自鼠表达系之一的乳腺RNA转录物进行克隆，证实FIXD mRNA的异常剪接。FIXD披露于WO-A-9005188的例3和WO-A-9211385的比较例6中，它包括与β-乳球蛋白(BLG)5’和3’序列(包括外显子6和7)融合的人体因子IX(fIX)cDNA；FIXD不含天然的内含子。设计并构建了对fIXcDNA的5’末端和BLG的3’末端具有专一性的引物(模式1图1)。该引物具有以下序列模式1-5’fIX(编码号292343)5’CAC CAA GCT TCA TCACCA TCT GCC3’★模式1-3’BLG(编码号290646)5’GGG TGA CTG CAG TCCTGG TCC C3’★含有引入的HindIII位点，以便能够克隆。
上述引物扩增来自BLG+FIXD鼠的较短的FIXD转录物(称作BIX)，并将其克隆在质粒载体pBLUESCRIPT中，称作pRT-FIX，然后对其测序。pRT-FIX的序列表明，在fIX序列中有一个462nt的内缺失。因此，与预计的FIXD mRNA的大小为1813nt不同，BIX转录物为1351个核苷酸(图1)。
用Sanger的双脱氧法测定的pRT-FIX序列，确认了在BIXmRNA上所观察到的缺失的精确位置。通过检查fIXcDNA序列(Anson等，The EMBO Journal 3(5)1053-1060(1984))并与由pRT-FIX所推断的5’和3’断裂点进行比较，证实该缺失几乎可以肯定是由于异常剪接造成的。因此，该缺失包括碱基对1085～1547(含端点)(采用的是Anson论文和本说明书图2中的编号)。5’末端的序列为5’GUAAGUGG，而3’末端的序列为UUUCUCUUUACAG3’(图3)。它们是内含子的供体(5’)和受体(3’)位点的‘极好’的共有序列。(一个内含子的5’和3’末端必须分别有GU和AG这对剪接来说是绝对必要的；这里的其它碱基也接近供体和受体位点的共有区。)应当指出的是，供体位点和受体位点的存在并不意味着基因必须以这种方式剪接人们不能由该序列预测是否会发生剪接。实际上，在天然因子IX基因中，这些位点存在于被与FIXD上相同的序列分开的最后一个外显子(外显子8)中(图4)。然而，这些位点并不用于人体肝脏里的正常表达因子IX前体mRNA。因此，由于某种原因，产生于乳腺里的FIX转录物利用这些剪接位点，导致内缺失BIX mRNA的产生。这种内缺失的mRNA不能编码有功能的fIX蛋白质，因为它导致了编码fIX的最后109个氨基酸的片段的去除。例2其它fIX构建物上发生的异常剪接fIXcDNA序列异常剪接的验证是用表达FIXD构建物(与BLG共整合)的小鼠来做的。以前已用由fIXcDNA序列转基因的羊做过实验，但在这些羊中，该fIXcDNA序列被整合到完整BLG基因的第一个外显子上，形成一种被称为FIXA的构建物(如在WO-A-8800239中的例3中所述)。该构建物看上去表现相当差，并在乳中产生相当低水平的fIX。因此，看一看这种异常剪接是否发生在带有该fIX构建物的乳腺中也是很有意义的。羊的乳腺RNA样品带有另一种较差的表达构建物JFIXA1(在WO-A-9005188的例4中的E部分被鉴定为JFIX A1)，该样品也是由按照在WO-A-9005188中建立者所披露的转基因方法制备的转基因羊所产生的。设计一套PCR引物(模式2图5)，当RT-PCR扩增RNA时它可以分辨未剪接的fIX序列和在BIX mRNA上观察到的异常剪接的mRNA。在野生型(非异常剪接的mRNA)中，这种引物可产生一个689p的片段，而在异常剪接的mRNA中它会产生一个227bp的片段。这些引物具有以下序列模式2-5’fIX(编码号795X)5’GAG GAG ACA GAA CATACA GAG C3’模式2-3’fIX(编码号794X)5’CAG GTA AAA TAT GAAATT CTC CC3’它被用于由表达fIX的组织制备的多种RNA。其结果如表1所示。
表1
羊乳腺中的FIXA和JFIXA1确实表现出与BIX相同的异常剪接，因此，它并不是严格取决于构建物。不过，鼠体内的FIXA显示出一种相当混乱的情况。仅有1/12的鼠表达该构建物，但表达水平较高(30μg/ml)。很明显，这只鼠不会在乳腺中发生这种异常剪接，因此，在乳中可观察到很高水平的fIX。但还不清楚这种现象为什么会发生在这只鼠中。不过，它表明，缺乏异常剪接可提高fIX在乳中的含量。例3 FIX-Δ3’剪接体的构建构建过程如图6所示。一套PCR引物(模式4)模式45’BLG(976G)5’GCT TCT GGG GTC TAC CAGGAA C3’模式4 3’fIX(2212)5’TAT AAC CCG GGA AAT CCA TCT TTCATT AAG T3’★★带有附加的5’序列，该序列包括用于克隆的新的SmaI位点被用于扩增从5’BLG序列到fIX的终止密码的3’端即隐性受体剪接位点5’端的一段FIXD。因此，这一段DNA带有fIX编码序列，但在3’非翻译区缺少隐性受体位点。将该片段与BLG序列融合，以制成一种非常类似于FIXD的构建物，但它缺少存在于FIXD上的fIX的141bp的3’侧翼序列，包括隐性受体位点。例4 FIX-Δ3’剪接体的表达为了试验FIX-Δ3’剪接体是否会在转基因动物中导致fIX表达的改善，将其同BLG一起共同注射到鼠卵子中(见WO-A-9211385)，并建立起若干转基因系。在RNA水平和蛋白质水平上分析乳腺中FIX-Δ3’剪接体转基因的表达。蛋白质分析迄今已对9个系的转基因鼠进行了分析，9个系在乳中均表现出可检测量的fIX。其中之一(系31)表现出极高的含量(平均60.9μg/ml)，某些个体表现出＞100μg/ml(表2)这是迄今在乳中所能达到的最高fIX水平。
因子IX乳样的ELISA分析这些乳来自带有修饰过的因子IXcDNA(去掉了受体剪接位点)的转基因鼠。该ELISA基于兔多克隆的捕捉，而检测是由被生物素化过的同一多克隆进行的。表达结果如下表2在FIXΔ3’系中RNA和蛋白质的表达
★通过对拖尾DNA的Southern印迹的PhosphorImager分析而测定的；这些值是近似值(“nd”表示未做)。
@在某些样品中，FIXDΔ3’mRNA的含量是相对于体外转录的fIX转录物测定的
+由ELISA测定；由括号中所示的G1(第一代)或G2(第2代)样品数平均得到$该系的某些个体的fIX含量超过100μg/ml此外，所产生的蛋白质在还原性和非还原性凝胶上具有极类似于由正常血浆产生的人体fIX的迁移率(图7)，并具有生物活性(表3)。这种fIX产生水平可在羊上实现商业化。
来自转基因鼠乳的人体fIX的提纯及生物活性通过免疫亲和层析从所收集的来自系31的鼠乳中提纯fIX。与Ca+结合fIX Gla结构域结合的MabA7由Charles Lutsch赠送。该抗体与溴化氰活化的Sepharose联结。将稀释的乳液与被抗体结合的Sepharose一起在50mM Tris，150mM NaCl pH7.5(TBS)+50mM CaCl2中在4℃温度下培养过夜。用TBS，25mM EDTA，pH7.5将结合的蛋白质等度洗脱下来。通过添加fIX缺乏型血浆(诊断试剂，Oxon，UK)和APTT试剂(Sigma)测定fIX凝固活性，在加入Ca+5分钟后使反应开始。凝固作用是用一台ST4分析仪(Diagnostica Stago)进行滚珠振荡而测定的。将正常人体血浆(ELISA测得fIX为4μg/ml)用作标准。
结果如下面的表3所示表3
★收集来自FIXΔ3’31系的若干乳样@通过ELISA测定+通过凝固试验测定RNA分析用fIX专一性探针对来自FIX-Δ3’剪接体鼠的典型RNA样品的Northern印迹进行检测。观察到预计大小的转录物(～1680nt)(图8)，而且，稳态mRNA含量与在乳中测出的fIX的含量相关(例如系31具有最高的mRNA含量(见表2))。将这些FIX-Δ3’剪接体RNAs与某些BIX RNAs一起跑带。应当指出，它们的分子量比BIXmRNA(1351nt)的高，尽管构建物较小。导致BIX mRNA变短的异常剪接现在已被消除。这是由对FIX-Δ3’剪接体RNA的RT-PCR分析而得到证实的，它表明转录物的3’片段是完整的(未示出)。
权利要求
1.具有编码一种有人体因子IX活性的蛋白质的序列的DNA，其中，对该DNA进行修饰，以便影响至少下列隐敝剪接位点之一的功能(a)包括mRNA核苷酸1086的供体位点；和(b)包括mRNA核苷酸1547的受体位点；采用的是附图的图2中的mRNA核苷酸编号。
2.如权利要求1所述的DNA，它编码野生型人体因子IX。
3.如权利要求1或2所述的DNA，它含有至少一个存在于编码因子IX的基因组DNA中的内含子。
4.如权利要求1、2或3所述的DNA，其中的隐敝供体位点是用工程方法除去的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的DNA，其中的隐敝受体位点是用工程方法除去的。
6.如权利要求5所述的DNA，它是编码因子IX的DNA片段，该DNA片段的3’末端被截短以排除所述受体位点。
7.如权利要求6所述的DNA，它是cDNA。
8.一种表达宿主，它包括与一个表达控制序列可操作地连接的如权利要求1～7中任一项所述的DNA。
9.如权利要求8所述的表达宿主，它是一种转基因的非人动物。
10.如权利要求9所述的表达宿主，其中，所述动物是一种胎盘哺乳动物，而所述表达控制序列控制在乳腺里的表达，以使因子IX存在于哺乳动物的乳中。
11.如权利要求9所述的表达宿主，其中，所述的表达控制序列包括β-乳球蛋白启动子。
全文摘要
重组人体因子IX的较差的表达产率归因于在异源表达系统如转基因宿主中的异常剪接。异常剪接位点已被确认为(a)包括mRNA核苷酸1085的供体位点；和(b)包括mRNA核苷酸1547的受体位点；采用的是附图的图2中的mRNA核苷酸编号。改进的因子IX表达序列至少用工程方法除去上述位点之一，以便避免或减少异常剪接的影响并由此提高产率。这种改进的DNA序列还可用于基因治疗。
文档编号C12P21/04GK1149317SQ9519289
公开日1997年5月7日 申请日期1995年5月2日 优先权日1994年5月3日
发明者A·J·克拉克 申请人:Ppl治疗(苏格兰)有限公司