生产l-赖氨酸的方法

专利名称：生产l-赖氨酸的方法
背景技术：
本发明涉及微生物工业，并且尤其涉及通过发酵生产L-赖氨酸的方法和在该生产方法中优选使用的杆状菌。
到目前为止，L-赖氨酸是通过用短杆菌属、棒状杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属的L-赖氨酸生产菌发酵而生产，从草酰乙酸经天冬氨酸、天冬氨酸β-醛等在任一这些微生物的生物合成系统中L-赖氨酸得到合成。许多酶如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、天冬氨酸激酶及二氢吡啶二羧酸盐合成酶参与这样的L-赖氨酸生物合成途径，然而，这些酶中的许多作为终产物L-赖氨酸或作为中间产物天冬氨酸的反馈抑制。因此，当通过发酵生产L-赖氨酸时，为了提高产率，大多使用不受这些抑制的突变株。
例如，已知在如短杆菌属、棒状杆菌属的杆状菌中，天冬氨酸激酶(下文称为“AK”)受到L-赖氨酸和在L-赖氨酸合成旁路中合成的L-苏氨酸的协同抑制。一种含有不受这种抑制的突变株被应用于L-赖氨酸生产中(J.Gen.Appl.Microbiol.，16，373-391(1970))。
一种缺乏被认为是对L-赖氨酸产率具有最大影响的高丝氨酸脱氢酶(下文指“HD”)的突变菌株也被用于通过发酵生产L-赖氨酸。这可归因于下面的事实由于缺乏HD去催化天冬氨酸β-半醛产生L-高丝氨酸的反应，该反应作为L-苏氨酸固有合成途径的起始反应是来自经天冬氨酸β-半醛的L-赖氨酸合成途径的分枝，因而L-苏氨酸没被合成，从而导致L-赖氨酸合成反应进程中没有对AK活性的抑制。这样的HD缺陷株如一种HD完全缺失的谷氨酸棒状杆菌株是已知的(Nakayama，K.et al.，J.Gen.Appl.Microbiol.7(3)，145-154(1961))。
除了上述HD完全缺失株之外，一种含有所谓泄漏型(leaky type)HD的突变株也被认为对L-赖氨酸生产是有效的。HD完全缺失株不能合成L-苏氨酸和L-甲硫氨酸，因此，如果这些氨基酸在培养基中不存在时该菌株不能够生长。相反，如果能获得HD泄漏型菌株，该菌株含有泄漏型HD，该HD基本上不显示抑制L-赖氨酸生产的活性但具有一点HD活性时，即使不向培养基添加L-苏氨酸和L-甲硫氨酸，也可能生长，并且制备培养基变得方便。
此外，泄漏型HD对于作为基底物的天冬氨酸β-半醛的亲合力小。因此，HD泄漏型菌株为了合成生长所需的L-苏氨酸、L-甲硫氨酸和L-异亮氨酸，而合成大量的天冬氨酸β-半醛。合成相当数量的天冬氨酸β-半醛被转化成L-赖氨酸。
另一方面，HD完全缺失型菌株在完全抑制L-苏氨酸的生成量上被认为是有用的。然而，由于回复突变，由突变所致的HD缺陷具有恢复活性的可能性。因此，一种具有毁坏HD基因且恢复活性可能性极低的HD缺陷株被认为更加有用。谷氨酸棒状杆菌的HD基因碱基序列已由Peoples等报导过(Peoples，O.P.et al.，Molecular Microbiology，2(1)，63-72(1988))。
因为HD泄漏型菌株及HD缺陷型菌株不产生L-苏氨酸，所以AK不受反馈抑制。因此，人们认为AK基因在HD泄漏型菌株和HD缺陷型菌株细胞中扩增，L-赖氨酸合成反应继续进行，L-赖氨酸产率提高。进而，合并不受L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制的AD突变和HD泄漏或缺失导入杆状菌中L-赖氨酸产率可望进一步提高。

发明内容
本发明是鉴于以上观点而作出的为了提高杆状菌的L-赖氨酸产率，其课题在于获得HD泄漏型菌株和HD毁坏型菌株，以及提供具有扩增AK基因的HD泄漏型菌株和HD缺陷型菌株，进而含有AK的HD泄漏型菌株和HD基因毁坏型菌株，其中AK不受L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制。
为了解决上述的课题，本发明人获得了一种HD泄漏型乳发酵短杆菌突变菌株，分离出野生型HD基因和泄漏型HD基因以阐明它们的结构，将泄漏型HD基因和部分缺失的HD基因导入乳发酵短杆菌的野生菌株中因而产生了一种具有提高的L-赖氨酸产率的L-赖氨酸菌生产株。通过在这样获得的L-赖氨酸菌生产株细胞中扩增AK基因或通过导入编码不受L-赖氨酸和L-苏氨酸反馈抑制的AK基因，进一步提高L-赖氨酸产率上获得了成功从而完成了本发明。
即，本发明提供了编码源于杆状菌从其N-末端数起的第23个亮氨酸残基和第104个缬氨酸残基的至少之一转换为另外一个氨基酸残基突变型高丝氨酸脱氢酶的DNA片段；源于一种杆状菌从其N-末端数起的第23个亮氨酸残基和第104个缬氨酸残基的至少之一转换为另外一个氨基酸残基的突变型高丝氨酸脱氢酶的基因的杆状菌；以及编码上述突变型高丝氨酸脱氢酶的基因通过与杆状细菌的染色体上的高丝氨酸脱氢酶基因的同源重组到染色体DNA上，而转化杆状细菌。
另一方面，本发明提供了一种杆状菌，其特征是编码来自杆状细菌染色体上的高丝氨酸脱氢酶一部分的DNA片段通过与杆状菌染色体上的高丝氨酸脱氢酶基因以同源重组的方式，整合到其染色体DNA上，该菌的高丝氨酸脱氢酶基因被破坏。还有一方面，本发明提供了一种杆状菌，其特征是细胞中含有通过连接源于杆状菌的天冬氨酸激酶基因与能在杆状菌细胞中自主复制的载体而构建的重组DNA，并且不表达野生型高丝氨酸脱氢酶；本发明还提供了一种杆状菌，其特征是编码来自杆状的天冬氨酸激酶，而且是由于L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制被钝化的天冬氨酸激酶基因，整合到杆状染色体上被转化并且不表达野生型高丝氨酸脱氢酶。另外还有一方面，本发明提供了生产L-赖氨酸的方法，包括在适当培养基中培养上述杆状菌的步骤，在其培养物中生产和积累L-赖氨酸以及从培养物中收集L-赖氨酸的方法。
在本专利说明书中，有时，产生野生型HD或野生型AK的菌株被称为“野生菌株”，几乎不显示基本的HD活性，但具有一点HD活性的具有泄漏型突变的HD被称为“突变型HD”，具有突变的不受L-赖氨酸和L-赖苏氨酸反馈抑制的AK被称为“突变型AK”，并且部分缺失的HD基因被称为“缺失型HD基因”。此外，以宿主染色体DNA上的HD基因或AK基因通过同源重组方式整合包括外源HD基因或外源AK基因及载体到染色体DNA被称为“基因整合”，通过允许拷贝HD基因或AK基因与载体一起脱落，将重组DNA从整合到染色体DNA状态，作成染色体上的HD基因或AK基因由外源HD基因或外源AK基因所替代，该状态的完成功被称为“基因替代”。此外，一种含有突变型HD基因的突变株或用突变型HD基因替代的菌株仅被称为“HD突变株”，并且用部分缺失HD基因替代的菌株被称为“HD缺陷型菌株”。
本发明提及的杆状菌是在“伯杰氏细菌鉴定手册”第8版(1974)中599页定义的一组微生物，它们是位于有氧格兰氏阳性非抗酸性(non-acid-fast)，无孢子形成能力杆菌，包括属于棒状杆菌属的细菌，及以往属于短杆菌属的细菌，但现在又被合并到棒状杆菌属，以及与棒状杆菌属细菌具有较近亲缘关系属于短杆菌属的细菌。
根据本发明获得的HD突变型菌株具有极好的L-赖氨酸产率，并且甚至当培养基中没有L-甲硫氨酸和L-苏氨酸或L-高丝氨酸存在时它们仍可生长。由于没有HD基因的表达，本发明的HD缺陷菌株具有极高的L-赖氨酸产率并可稳定地维持该特性。
此外，具有扩增AK基因的HD突变菌株和HD缺陷菌株以及富含突变型AK基因的HD突变菌株和HD缺陷菌株具有更高的L-赖氨酸产率。
发明详述以下详细地说明本发明。<1>泄漏型HD突变菌株和突变型HD基因的制备通过对产野生型HD杆状菌的突变处理获得一种产具有泄漏型突变HD的突变菌株。对于杆状菌的突变处理是用紫外线照射或常用作人工突变的突变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)而完成的。
从突变处理后的细菌细胞进行单个菌落的分离以从每个菌落中筛选出产泄漏型HD的菌株。泄漏型HD突变菌株能够在基本培养基上生长，不能在加有过量L-甲硫氨酸和L-苏氨酸的基本培养基上生长，但能够在加有L-高丝氨酸或L-甲硫氨酸和L-苏氨酸的基本培养基上生长。这样，它们就可以用前述的作为标准而加以筛选(shiio，I.&Sano，K.，J.G.A.M.，15，267-287(1969))。为了证实这样获得的奕变菌株产泄漏型HD的事实，最好从细菌细胞中提取粗酶溶液将HD比活性与野生型HD进行比较。
HD酶活性可根据如Kalinowski等的方法Kalinowski，J.et al.，Mol.Gen.Genet.，224，317-324(1990))，使用以Follettie等的方法(Follettie，M.T.et al.，Molecular Microbiology，2，53-62(1988))从细菌细胞中制备的粗酶溶液而被测定。
为了从获得的泄漏型HD突变菌株分离突变型HD基因，可根据如Saito和Miura的方法(H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963))从泄漏型HD突变菌株制备染色体DNA，并且通过聚合链反应方法(PCR；见White，T.J.et al.，Trends Genet.，5，185(1989)扩增HD基因来进行。对于扩增反应要使用的DNA引物，使用那些互补于DNA双链DNA两个3’端、含有HD基因全部或部分区域的序列。当仅仅是HD基因的部分区域扩增时，用该DNA片段作为引物从染色体DNA文库中筛选出含有整个区域的DNA片段是必需的。当HD基因整个区域要被扩增时，含有包括扩增HD基因的DNA片段的PCR反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳后，提取目的DNA片段。这样，含有HD基因的DNA片段可被回收。
DNA引物，基于例如，谷氨酸棒状杆菌的已知序列(Peoples，O.P.et al，Molecular Micrology，2(1)，63-72(1988))。适当地制备。具体地，可扩增编码HD基因1150碱基构成的区域的引物是优选的，以及例如，表示在序列号1及序列号2上的2种引物是适合的。引物DNA的合成可根据普通方法如磷酰亚胺(phosphoamidite)方法(见Tetrahedron Letters，22，1859(1981))，使用商业上可得到的DNA合成仪(如Applied Biosystems生产的Model 380 B DNA合成仪)而被合成。此外，PCR可根据供应商指定的方法，使用商业上可得到的PCR仪(例如，Takara Shuzo公司生产的DNA Thermal Cycler Model P J2000)。Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo公司提供)而完成。
为了利于以后的操作，将通过PCR方法扩增的突变型HD基因连结到可在大肠埃希氏杆菌(下文被称为“E.coli”)和/或杆状菌细胞中自主复制的载体DNA上，制备重组DNA，将其导入E.coli细胞中。在E.coli细胞中自主复制的载体优选是质粒载体，最好是可在宿主细胞中自主复制的包括，如，pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398以及RSF1010。
这样的载体中被插入能使质粒在杆状菌中自主复制的DNA片段时，可以使用E.coli及杆状两方均可自主复制的所谓穿梭载体。上述片段可以如PAM330(见公开的日本专利58-67699)、PHM1519见公开的日本专利58-77895)、PCG1(见公开的日本专利NO57-134500)、PCG2(见公开的日本专利NO58-35197)、PCG4(见公开的日本专利NO57-183799)和PCG11(见公开的日本专利NO57-183799)中制备。
以下举例说明这种穿梭载体。含有每种载体的微生物和国际保藏单位的保藏编号以圆括弧表示。
PAJ655大肠埃希氏杆菌AJ11882(FERM BP-136)谷氨酸棒状杆菌SR8201(ATCC39135)PAJ1844大肠埃希氏杆菌AJ11883(FERM BP-137)谷氨酸棒状杆菌SR8202(ATCC39136)PAJ611大肠埃希氏杆菌AJ11884(FERM BP-138)PAJ3148谷氨酸棒状杆菌SR8203(ATCC39137)PAJ440枯草杆菌AJ11901(FERM BP-140)这些载体按从保藏的微生物按以下方法得到。将对数生长期收集的细胞使用溶菌酶和SDS溶菌以产生裂解物，用30,000xg离心从中获取上清液。向上清液中加入聚乙二醇以通过氯化铯-溴化乙锭平衡密度梯度离心手段完成分离纯化。
为了向E.coli导入质粒以对其转化，使用例如D.M.Morrisn的方法(Method in Enzymology，68，326(1979))或以氯化钙处理受体细胞以增加DNA通透性的方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))是可能的。
突变HD基因从泄漏型HD突变菌株分离出来时，也可以通过使用质粒载体或类似物制备泄漏型HD突变菌株的染色体DNA文库，从文库中筛选出含有突变型HD基因的菌株，并且从筛选出的菌株中回收具有插入突变型HD基因的重组DNA。下面将描述制备染色体文库和从文库中筛选含有突变型HD基因方法的实施例。
首先，培养泄漏型HD突变菌株以获得培养物。备好杆状菌能在其上生长的任意培养基。当培养基中含有少量L-苏氨酸和L-甲硫氨酸时，优选预先加入L-苏氨酸和L-甲硫氨酸或L-高丝氨酸。其次，细菌细胞通过离心培养物而获得菌体。根据如Saito和Miura方法(Biochem.Biophys.Acta，72619(1963))或K.S.Kirby方法(Biochem.J.，64，405(1956))从细菌细胞中获得染色体DNA。
为了从这样获得的染色体DNA中分离突变型HD基因，制备染色体DNA文库。首先，以一种适当的限制酶部分降解染色体DNA以获取各种片段的混和物。通过用控制切割反应等的时间长短来控制切割程度，许多种限制酶便可被使用。例如，Sau3AI被允许作用于染色体DNA以在不低于30℃的温度将其消化，优选的是在37℃，酶浓度在1～10单位/毫升，作用时间可变化(1分钟到2小时)。
然后，切割的染色体DNA片段被连结能在E.coli细胞中自主复制的载体DNA上，制备重组DNA。具体的是，将一种与用于切割染色体DNA的限制酶Sau3AI产生相同末端碱基序列的限制酶如BamHI在30℃以上温度和1～100单位/亳升酶浓度条件下与载体DNA作用1小时以上，最好1～3小时完成切割和裂解。接着，将上述获得的染色体DNA片段混和物与裂解和切割过的载体DNA混和，使其与DNA连接酶，最好T4DNA连接酶在4-16℃温度及1～100单位/毫升酶浓度条件下作用1小时以上，最好6～24小时以获得重组DNA。
使用获得的重组DNA，转化大肠埃希氏杆菌K-12菌株以制备染色体DNA文库。该转化可用如D.M.Morrison方法(Methods inEnzymology，68，326(1979))或以氯化钙处理受体细胞以增加DNA通透性的方法(Mandel.M.and Higa，A，J.Mol.Biol.，53，159(1970))完成。
例如，为了从获得的染色体DNA文库中筛选出含有突变型HD基因的转化菌株，可根据对于谷氨酸棒状杆菌(Peoples，O.P.et al.，Molecular Microbiology，2(1)，63-72(1988)已知的序列合成寡核苷酸探针以用它完成菌落的杂交。已知存在2种E.coli HD基因(HD-1，HD-2) (Zakin，M.M.et al.J.B.C.258，308-3031(1983))，然而，它们都不具有相应于谷氨酸棒状杆菌HD C-末端一侧的约100个氨基酸残基的区域。这样，当要被用作探针的序列选自该区域时，该探针不与大肠埃希氏杆菌染色体HD基因杂交，这是优选的。含有突变型HD基因的重组DNA可根据如P.Guerry等的方法(J.Bacteriol.，116，1064(1973))或D.B.Clewell的方法(J.Bacteriol，110，667(1972))从这样筛选出的转化菌株得到分离。
可选择地，产泄漏HD的菌株可通过用从杆状菌中克隆的野生型HD基因，按照上述以同样的方式得以产生。首先，含野生型HD基因或具有别的突变的HD基因DNA在体外进行突变处理，并且经突变处理的DNA被连接到适应于一宿主的载体DNA以获取重组DNA。重组DNA被导入宿主微生物以获取转化子，并从转化子中筛选出表达泄漏型HD的菌株。可选择地，含有野生HD基因或具有另一突变的HD基因DNA被连接到适应于一宿主的载体DNA以获得重组DNA也是可行的，然后将重组DNA进行体外突变处理，经突变处理的重组DNA被导入宿主微生物，以获得转化子，并且从转化子中筛选出表达泄漏型HD的菌株。
完成体外DNA突变处理的试剂用羟胺为例加以说明。羟胺是一种用于化学突变的处理剂，它通过将胞嘧啶转变为N4-羟胞嘧啶而导致胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变。
用于本发明的突变型HD基因没有特别的限制，只要它编码泄漏型HD，其中有举例说明的基因，它们编码具有野生型HD氨基酸序列任何突变的HD，包括(1)N-末端第23个亮氨酸基转换为除亮氨酸残基以外的氨基酸残基的突变；(2)N-末端第104个缬氨酸残基转换为除缬氨酸残基以外的氨基酸残基的突变以及(3)N-末端第23个亮氨酸基转换为除亮氨酸残基以外的氨基酸残基和N-末端第104个缬氨酸基转换为除缬氨酸残基以外的氨基酸残基的突变；在这里，作为野生型HD氨基酸序列具体的可举出源于序列表序列号3及4所示的野生型乳发酵短杆菌菌株的HD氨基酸序列。
关于在前面(1)至(3)描述的突变，可举出第23个亮氨酸残基转换为苯丙氨酸残基的突变例子，第104个缬氨酸残基转换为异亮氨酸残基的突变的例子。
任何相应于替代氨基酸残基的密码子只要可编码氨基酸残基，对其类型无任何要求。依据细菌种类和菌株的不同，所含有的野生型HD氨基酸序列可稍有差异。在与酶活性无关的位点具有这种氨基酸残基替代，缺失或插入的HD也可被用于本发明。
例如，正如将在下面实施例中将要描述的，作为源于乳发酵短杆菌2256菌株(ATCC13869)HD的氨基酸序列与报导的谷氨酸棒状杆菌HD氨基酸序列(Peoples，O.P.et al.，Molecular Microbiology 2(1)，63-72(1988))比较的结果，已阐明N-末端第1 48个氨基酸残基在谷氨酸棒状杆菌HD中是甘氨酸残基而在乳发酵短杆菌HD中是丙氨酸残基。可以预测通过导入前面提及的(1)至(3)突变中任何一个，甚至在上述在谷氨酸棒状杆菌的HD情况下也可以得到泄漏型HD。
<2>野生型AK基因和突变型AK基因的制备用于本发明的野生型AK基因可从杆状菌的野生菌株中制备。
由L-赖氨酸和L-苏氨酸积累的反馈抑制被基本钝化的编码AK的基因可从一种突变菌株中制备，该菌株中由L-赖氨酸和L-苏氨酸对AK活性的积累反馈抑制基本上被钝化。这种突变菌株可获自一组进行过突变处理的细胞，如通过用诸如紫外光照射或以诸如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)突变剂的普通突变处理方法对野生型杆状菌的突变处理。对于AK活性的测定，使用Miyjima，R.et al.在TheJournal of Biochemistry(1968)，63(2)，139-148中描述的方法是可能的。
关于AK基因的供体菌，从乳发酵短杆菌的野生菌株ATCC 13869和从ATCC 13869株通过突变处理衍生的L-赖氨酸生产菌AJ3463(FERMP-1987)是最优选的供体菌。
为了从杆状菌中分离AK基因，可根据Saito和Miura的方法(H.Saito and K.Miura，.Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)制备染色体DNA，并且通过聚合酶链式反应方法(PCR；见White，T.J.et al.，Trends Genet.，5，185(1989))扩增AK基因。
对于用于扩增的DNA引物，可以使用那些互补于含有全部或部分AK基因的DNA双链的2个3’端区域的序列。当仅仅是AK基因的部分区域要扩增时，必需用该区域的DNA片段为引物从一个基因文库中扩增含整个区域的DNA片段进行筛选。当整个区域被扩增时，DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，后经目标带的切割。这样，含有AK基因的DNA片段可被回收。
对于DNA引物，由5’-TCGCGAAGTAGCACCTGTCACTT-3’(序列表中SEQ ID NO5)和5’-ACGGAATTCAATCTTACGGCC-3’(序列表中SEQ ID NO.6)代表的23个和21个碱基的单链DNA是最适合的。它是以谷氨酸棒状杆菌(见Molecular Microbiology(1991)，5(5)，1197-1204；Mol.Gen.Genet.(1990)，224，317-324)为基础，扩增编码AD基因的约1643bp的区域。DNA的合成可根据用磷酰亚胺方法(见Tetrahedron Letters(1981)，22，1859)的常规方法，用AppliedBiosystems生产的Model 380B DNA合成仪来合成。PCR可根据供应商指定的方法，通过使用Takara Shuzo公司生产的Model PJ2000型DNA热循环仪和Tag DNA聚合酶来完成。
用PCR方法扩增的突变型AK基因连接到能在大肠埃希氏杆菌和/或杆状菌细胞中自主复制的载体DNA上，以制备重组DNA，为了利于后面的操作，重组DNA被导入大肠埃希氏杆菌细胞。能在E.coli细胞中自主复制的载体，优选的是质粒载体，象这些能在宿主细胞中自主复制的优选质粒包括如pUC19，pUC18，pBR322，pHSG399，pHSG398以及RSF1010。
当这些载体被插入具有使质粒能在杆状菌中自主复制能力的DNA片段时，它们便可用在E.coli和杆状菌中都能自主复制的所谓穿梭载体。为了向E.coli导入质粒以完成转化，使用如D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymoloy，68，326(1979))或从氯化钙处理受体细胞以增加DNA通透性的方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Md.Bid.，53，159(1970)是可能的。
野生型AK基因按上述通过从AK野生菌株中分离AK基因而获得，并且突变型AK基因通过从AK突变菌株分离AK基因而获得。
用于本发明的突变型AK基因，只要它编码由L-赖氨酸和L-苏氨酸积累的反馈抑制被钝化的AK就可以，对此没有特别的限制。然而，可以举出在野生型AK的氨基酸序列中N-末端的第279个丙氨酸残基转换为除丙氨酸以外的氨基酸残基并且为非酸性氨基酸残基的突变，以及在β-亚基中第30个丙氨酸残基转换为除丙氨酸以外的氨基酸残基并且为非酸性氨基酸残基的突变。作为野生型AK氨基酸序列，可具体地指出在在α-亚基中表示在序列表序列号10的氨基酸序列和在β-亚基中表示在序列表序列号12的氨基酸序列。
前面提及的除丙氨酸以外的非酸性氨基酸可以举出苏氨酸、精氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸以及缬氨酸。
任一相应于被替代氨基酸残基的密码子，只要是可以编码氨基酸残基即可，不考虑其类型。另外具有的野生型AK氨基酸序列可依据菌种和菌株的差异而稍有不同。在与酶活性无关的位点具有这种氨基酸残基的替代、缺失或插入的AK也可用于本发明。
<3>HD突变菌株和HD缺陷菌株的制备HD突变菌株按<1>中描述的通过以紫外光照射或突变剂对产野生型HD的杆状菌的处理而获得，并从进行过突变处理的细菌细胞中筛选出产突变型HD的菌株。不表达野生型HD的HD突变菌株也可这样获得通过将从这样获得的HD突变菌株中分离出的突变型HD基因导入到野生型杆状菌细胞中，并且用染色体上HD基因的同源重组完成基因替代。
突变型HD基因可按如下方法(见

图1)被宿主染色体上的HD基因替代。即，将来自乳发酵短杆菌的温度敏感复制起点、突变型HD基因以及对如氯霉素药物显示抗性的标记基因插入到质粒载体以制备重组DNA。重组DNA被用于转化杆状菌，转化的菌株在温度敏感的复制起点不起作用的温度培养转化株，然后将其培养于含有药物的培养基中。这样便获得了一种重组DNA被整合到染色体DNA上的转化菌株。
具有整合到染色体重组DNA的菌株导致以最初存在于染色体上HD基因序列的重组，其中染色体HD基因和突变型HD基因的融合基因2个在插入重组DNA(载体部分、温度敏感的复制起点、和抗药标记)其它部分的状态下被插入到染色体。因此，野生型HD在该状态下显性，这样，与野生菌株相当的生长在基本培养基中得以显示。
其次，为了只允许突变型HD基因保留在染色体DNA上，通过两个HD基因的重组使与载体部分(包括温度敏感的复制起点和抗药标记)一齐脱落。例如，培养染色体上具有整合的菌株，培养的细菌细胞经扩大并培养于不含药物的固体平板培养基上。长出的菌落反复培养于含药物的固体平板培养基，并且获得药物敏感菌株。载体部分从获得的药物敏感菌株染色体脱落的事实由Southern杂交证实，进而表达突变型HD的事实得到证实。
当用编码部分HD的HD基因，即使用部分缺失的HD基因，替代上述变异型HD基因，进行基因替代时可以获得其染色体HD基因以部分缺失HD基因替代的HD缺陷菌株。
正如在下面的实施例1中描述的，预测到位于HD N-末端侧的区域参与了活性的表达。因此，在HD基因中，作为被缺失的位点，可举出N-末端一侧的区域，如位于距N末端350个氨基酸以内的区域(如从N-末端的第100～200个氨基酸区域或250～350氨基酸区域)。既然HD基因与存在于其下游的高丝氨酸激酶基因位于相同的操纵子内，那么HD基因的启动子位点最好不缺失以便不抑制高丝氨酸激酶的表达。
正如报道的用于E.coli，K-12(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol，53，159(1970))，通过使用氯化钙处理受体细胞以增加DNA通透性的方法，或者如报道的用于枯草杆菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Yong，F.E.，G；ene，1，153(1977))，在生长期完成(DNA)的导入以致细胞能整合DNA(所谓的感受态细胞)的方法，向杆状菌细胞中导入重组DNA是可能的。可选择地，在将DNA受体细胞转换为容易整合重组DNA的原生质体或球形体之后完成重组DNA向受体细胞的导入也是可能的，正如已知的枯草杆菌、放线菌和酵母(Chang，S.andChoen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J，Ward，J.M.and hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.andFink，G.R.，Proc Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978))。
在原生质体方法中，甚至可通过上述的有用于枯草芽孢杆菌的方法来获得足够高的频率。如在公开的日本专利NO57-183799中描述的，在聚乙二醇或聚乙烯醇及二价金属离子存在的情况下，使用将DNA整合到棒状杆菌属或短杆菌属原生质体中的方法当然是可能的。甚至可通过添加羧甲基纤维素、葡聚糖、Ficoll，pluronic F68(Serva Co)来代替聚乙二醇或聚乙烯醇以便于DNA整合的方法来获得相同的结果。
此外，可通过使用电脉冲方法(Sugimoto et al.，公开的日本专利NO2-2077991)将重组DNA导入属于短杆菌属或棒状杆菌属的受体中。
导入突变型HD基因或缺失型HD基因的野生型杆状菌通过下面几种细菌举例说明，即棒状杆菌属细菌、和到目前为止被划分为短杆菌属但现在又被合并到棒状杆菌属的短杆菌属细菌以及与棒状杆菌属有较近亲缘关系的短杆菌属细菌。尤其在本必明中最为优选的是属于棒状杆菌(短杆菌)属的产谷氨酸细菌。属于棒状杆菌(短杆菌)属的产谷氨酸野生菌株的实施例包括下面(几个)。这些野生型菌株以及还具有产L-赖氨酸特性的这类菌株也同样地用于本发明。
嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC 13870醋谷棒状杆菌 ATCC 15806颈棒状杆菌ATCC 15991谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032ATCC 13060叉开短杆菌ATCC 14020乳发酵短杆菌 ATCC 13869百合棒状杆菌 ATCC 15990melassecola 棒状菌ATCC 17965解糖短杆菌ATCC 14066immariophilum短杆菌 ATCC 14068玫瑰色短杆菌 ATCC 13825黄色短杆菌ATCC 13826生硫短杆菌ATCC 19240ammoniaphilum 微杆菌 ATCC 15354除了如上述的能够产谷氨酸的野生菌株，可用于本发明的杆状菌包括具有谷氨酸生产能力或那些失去谷氨酸生产能力的突变菌株。目前，各种人工的产谷氨酸杆状菌突变菌株被用作产L-赖氨酸细菌，并且这些菌株也可用于本发明。这样的人工突变菌株包括如下抗AEC(S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸)突变菌株，生长时需要如L-高丝氨酸氨基酸的突变菌株(日本专利48-28078及56-6499)；对AEC显示抗性并需要如L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸及L-缬氨酸的突变菌株(美国专利Nos.3708395及3825472)；对DL-α-氨基-ε-已内酰胺、α-氨基-正十二烷基内酰胺、天冬氨酸类似物、磺酰药物、醌型、N-十二烷酰亮氨酸显示抗性的产L-赖氨酸突变菌株；对草酰乙酸脱羧酶或呼吸系统酶抑制剂显示抗性的产L-赖氨酸突变菌株(公开的日本专利Nos.50-53588，50-31093，52-102498，53-9394，53-86089，55-9783，55-9759，56-32995及56-39778以及特公昭Nos.53-43591和53-1833)；需要肌醇或醋酸的产L-赖氨酸突变菌株(公开的日本专利Nos.55-9784及56-8692)；对氟代丙酮酸或不低于34℃的温度显示敏感的产L-赖氨酸突变菌株(公开的日本专利Nos.55-9783和53-86090)以及对乙二醇显示抗性并产L-赖氨酸的短杆菌或棒状杆菌突变菌株(见美国专利申请NO333455)。
<4>HD突变菌株或HD缺陷菌株中AK基因的扩增。
在L-赖氨酸和L-苏氨酸共同存在的情况下AK受到反馈抑制。然而，不表达野生型高丝氨酸脱氢酶的杆状菌不能产生L-苏氨酸，因此AK不受反馈抑制。因而，预期在不表达野生型高丝氨酸脱氢酶的细胞中，如果AK基因被扩增，可提高L-赖氨酸产率。如果抑制钝化的AK基因被用作扩增的AK基因，由于反馈抑制进一步减少，预期L-赖氨酸产率会进一步提高。
作为不表达导入AK基因的野生型高丝氨酸脱氢酶的杆状菌可举出在按上面<3>中描述而获得的HD突变菌株或HD缺陷菌株。然而，即使使用通过突变处理而获得的HD完全缺失型菌株时，同样地可以得到由于AK基因扩增使L-赖氨酸产率提高的效果。
在不表达野生型高丝氨酸脱氢酶的这种杆状菌细胞中扩增AK基因或突变AK基因时，杆状菌可用包含AK基因或突变型AK基因的重组DNA和能在杆状菌细胞中自主复制的载体加以转化。
这里使用的载体可以是任意的，只要能在杆状菌细胞中自主复制的载体即可，具体地，可以是例如上述的PAJ655、PAJ1844，PAJ611、PAJ3148及PAJ440。
转化杆状菌的方法通过用于E.coliK-12，即以氯化钙处理受体细胞以增加DNA通透性的方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))或通过如报道用于枯草杆菌的，即在生长期完成导入以便细胞可整合DNA(所谓感受态细胞)的方法(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Yorung，F.E.Gene，1，153(1977))加以举例说明。或者，如对于枯草杆菌、放线菌类及酵母所知道的(Chang，S.and Choen，S.N.Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.Ward，J.M.andHopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.Proc.Natl.Acad.Sci USA，75，1929(1978))，在将DNA受体转化为易于整合重组DNA的质体或球形体之后再完成向受体中导入重组DNA也是可能的。
此外，重组DNA在宿主中的稳定性可通过允许载体含有一个如抗药的标记基因或补充宿主营养缺陷的基因而得到提高。
表达AK基因或突变型AK基因时，可直接地使用AK基因固有的启动子。但是也可使用在杆状菌中起作用的别的基因的启动子将其连接到编码AK或突变型AK的DNA序列中。
<5>突变型AK基因向HD突变菌株或HD缺陷菌株染色体DNA的导入L-赖氨酸产率可按上面<4>中描述的通过在HD突变菌株或HD缺陷菌株细胞中完成AK基因的扩增而得到提高。然而，为了增加导入到HD突变菌株或HD缺陷菌株中AK基因的稳定性，优选将AK基因整合进染色体DNA中。在这里，使用突变型AK基因作为待整合进染色体DNA的AK基因是优选的。
为了整合突变型AK基因进入到宿主染色体DNA中，基因的整合可以用突变型HD基因或缺陷型HD基因相同的方式来完成。即，将源于乳发酵短杆菌的温度敏感型复制起点、突变型AK基因以及对药物如氯霉素产生抗性的标记基因插入到质粒载体以制备重组DNA。重组DNA被用于转化杆状菌，转化的菌株在温度敏感复制起点不起作用的温度下培养，然后将它们培养于含有药物的培养基中。这样，便获得重组DNA被整合到其染色体DNA上的转化菌株。
具有整合到染色体DNA上的重组DNA的菌株导致最初存在于染色体上的AK基因序列重组，其中染色体AK基因和突变型AK基因两个的融合基因在插入(interposing)重组DNA(载体部分、温度敏感型复制起点及抗药标记)其它部分的状态下被插入到染色体上。突变型AK在该状态下为显性，因此表型为突变型。因而，整合有基因的菌株也可直接被使用。然而，当相同的序列适当地在染色体DNA上平行排列时，重组可能又会发生，并且AK基因之一易于脱落。因此，最好获得仅是突变型AK基因保留于染色体DNA的基因替代菌株。即，允许一个拷贝的AK基因通过两个AK基因的重组与载体部分(包括温度敏感型复制起点及抗药标记)一齐脱落。例如，培养染色体上带有整合的菌株，并且培养的细菌细胞经扩大并培养于不含药物的固体平板培养基。长出的菌落体经反复培养于含药物的固体平板培养基并获得药物敏感型菌株。通过Southern杂交证实载体部分从获得的药物敏感菌株染色体脱落的事实，且突变型AK表达的事实也被证实。
此外，当野生型AK基因以完整的形式保留于染色体DNA上时也没有问题出现。这与用突变型HD基因或缺失型HD基因的基因替代情况有所不同。因此，突变型AK基因可被整合到染色体DNA的非AK基因位点上。
<6>L-赖氨酸的生产通过在一种适当的培养基中培养HD突变菌株、HD缺陷菌株、AK基因在其中被扩增的这些类型的菌株、或其中整合有突变型AK基因的HD突变菌株或HD缺陷菌株，在培物中可产生和积累L-赖氨酸。
待用的培养基包括常规培养基，其中含有碳源、氮源、无机离子及任选其它有机成分。
作为碳源，可使用糖如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖或淀粉水解产物；或者有机酸如延胡索酸、柠檬酸或琥珀酸。
作为氮源，使用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵或磷酸铵；有机氮如大豆水解产物；氨气或氨水是可能的。
允许必需物质如维生素B1及L-高丝氨酸或酵母提取物以适当的量存在作为有机微量营养物是理想的。除了上面的以外，如果必要，应添加少量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
当使用HD缺陷菌株时，应向培养基中添加适量的L-苏氨酸及L-甲硫氨酸或L-高丝氨酸。
培养优选在有氧条件下用16～72小时得以完成。培养温度优选地控制在25℃～37℃，培养过程的PH优选地控制在5～7。无机或有机、酸性或碱性物质以及氨等可用作为PH调节物。培养液中L-赖氨酸的收集可通过结合常规的离子交换树脂方法、沉淀方法及其它已知方法加以完成。
附图简述图1为基因整合和基因替代的思路图；图2为各种微生物HD基因氨基酸序列的比较图；图3为各种微生物HD基因氨基酸序列的比较图(续)；图4表示p399AK9B和p399AKYB的构建过程；图5表示经HD突变菌株和HD缺陷菌株培养后的L-赖氨酸产率和OD值；图6表示扩增AK基因后的HD突变菌株和HD缺陷菌株的L-赖氨酸产率以及培养后的OD；图7表示后突变型AK基因被整合进其染色体的HD突变菌株和HD缺陷菌株的L-赖氨酸产率和培养后的OD值。
优选实施方案描述下文将根据实施例更为具体地解释本发明。实施例1野生型HD基因、泄漏型HD基因及钝化抑制型HD基因的分析泄漏型HD突变菌株和产生对L-苏氨酸具有钝化的反馈抑制的H原突变菌株从野生型乳发酵短杆菌菌株中获得。野生型HD基因、泄漏型HD基因及抑制纯化型HD基因从野生及突变菌株得到分离并完成对它们结构的分析。乳发酵短杆菌AJ12036菌株(FERM BP-734)用作野生菌株。乳发酵短杆菌AJ12472及AJ12937菌株被用作泄漏型HD突变菌株。乳发酵短杆菌AI6080菌株被用作钝化抑制型HD突变菌株。这些突变菌株按如下方法获得。
AJ12036株是从乳发酵短杆菌2256菌株(ATCC13869)中脱落最初存在的质粒pAM330的菌株，对HD来说是产野生型HD的株。
AJ12472株及AJ12932株是从乳发酵短杆菌2256菌株中(ATCC13869)以赖氨酸产率作为指标通过突变重复培育结果而得到的株，是产生泄漏型HD株。另外AI6080株是从乳发酵短杆菌2256菌株(ATCC 13869)中，以赖氨酸产率作为指标，通过突变重复培育结果而得到的株，是产生抑制-钝化型HD株。
(1)通过PCR方法对HD基因的扩增HD基因碱基序列已有报道(Peoples，O.P.et al，MolecularMicrobiology，2(1)，63-72(1988))。据推测，乳发酵短杆菌和谷氨酸棒状杆菌之间每个HD基因序列的类似性高。因此，合成的引物DNA用PCR方法以谷氨酸棒状杆菌序列为基础而制备。
染色体DNA根据常规方法从乳发酵短杆菌AJ12036，AJ12472、AJ12937及AI6080菌株中制备。为了从这些染色体DNA中用PCR法扩增含HD基因的约1500bp的DNA片段，使用Model1381A(ABI公司)型DNA合成仪合成2种引物5’端引物H1((841)5’-CTGGGAAGGTGAATCGAATTT-3’(860)，序列表中SEQ ID NO1)及3’端引物H2((2410)5’-TCCGAGGTTTGCAGAAGATC-3’(2391)，序列表中SEQ ID NO2)。圆括弧内的数字表示由People等发表的在碱基序列中的位置(Peoples，O.P.et al，Molecular Microbiolo gy，2(1)，63-72(1988))。获得的合成引物用反相HPLC加以纯化。
PCR以下面所示的组合物，用PCR扩增仪(Takara Shuzo公司生产的DNA热循环仪PJ2000)和PCR试剂盒(Takara Shuzo公司生产的Takara Gene A mpTM试剂盒)加以完成。
表1成分 浓度 掺入量引物H10.25μM 25pmol引物H20.25μM 25pmoldATP，dGTP，dTTP，dCTP每种200μM 20nmolTaq DNA聚合酶 2.5U/100μL 0.5μl(5U/μL)染色体DNA 1μg10×反应缓冲液 10μL水 平衡(总量100μL)PCR中DNA变性、DNA退火及聚合酶反应条件分别为94℃ 1分钟、37℃ 2分钟及75℃ 3分钟，并且各个温度间的转换在1秒完成。DNA通过重复25个反应循环得到扩增。通过琼脂糖凝胶电泳对这样获得的扩增反应产物大小加以证实，确认有约1.4Kbp DNA片段的扩增。
这样，将从AJ1236、AJ12472、AJ12937及AI6080菌株中每个染色体DNA扩增的DNA片段分别以限制酶K pnI切割后获得的DNA片段，插入到载体质粒pHSG399(见Takeshita，S.et al.)Gene(1987)，61，63-74)的KpnI位点以获得重组DNA。含有来自AJ12036、AJ12472、AJ12937及AI6080菌株扩增片段的重组DNA质粒分别命名为pHDW、pHDMI、pHDMII及pHDMIII。每种质粒被导入E，coliJM109菌株以获得转化子。
<2>HD基因碱基序列的测定及突变位点的分析(1)野生型及突变型HD基因碱基序列的比较按上述获得的乳发酵短杆菌_AJ12036、AJ12472、AJ12937及AI6080菌株的HD基因片段碱基序列以双脱氧法加以测定。
测得的AJ12936菌株野生型HD基因碱基序列及由此推导的氨基酸序列表示在序列表序列号3中。此外，氨基酸序列表示于序列表序列号4中。此序列与Peoples et al报道的(Peoples，O.P.et al，MolecularMicrobiology，2(1)，63-72(1988))谷氨酸棒状杆菌HD基因序列比较的结果，碱基有4处不同，其中之一导致氨基酸水平的差异。用谷氨酸棒状杆菌HD基因序列作为标准，不同的位点显示如下(1)531G→C(148Gly→148Ala)(2)122G→C(3)1318G→T(4)1324C→G在野生型杆状菌中各野生株HD基因的序列间可以观察到的这种差异不影响HD的活性，并且谷氨酸棒状杆菌HD基因序列可被看作与序列号3所示乳发酵短杆菌HD基因的相等序列。
AT12036株野生型HD基因的碱基序列和从此序列推导的氨基酸序列与AJ12472株、AJ12937株和AI6080菌株的HD基因的碱基序列和氨基酸序列的比较结果，对于AJ12472菌株发现2处突变位点，AJ12937发现1处对AI6080发现1处，所有均伴随有氨基酸替代。此外，还发现在AJ12472和AJ12937菌株的HD基因中在一处同时存在完全相同的突变。每个突变位点显示如下。
表2菌株碱基序列上的不同点 氨基酸在残基突变AJ12472菌株155G→T23Leu→Phe
398G→A104Val→IleAJ12937菌株398G→A104Val→IleAI6080菌株1266G→T393Ser→Phe在下文，155G→T(23Leu→Phe)突变点称作“突变位点1”，398G→A(104Val→Ile)突变位点称作“突变位点2”，并且1266G→T(393Ser→Phe)突变位点称作“突变位点3”。
(2)HD氨基酸序列和乳发酵短杆菌，枯草杆菌及E.coli突变位点的比较。
已知在E.coli中存在2种HD基因(HD-1、HD-2)，它们中的任何一个与AK构成双功能酶(Zakin，M.M.et al.，J.B.C.，258，3028-3031(1983))。此外，枯草杆菌HD基因的碱基序列已被测定(Parsot，C.and Cohen，G.N.，J.B.C.，263(29)14654-14660(1988))。这些氨基酸序列与乳发酵短杆菌野生型HD的氨基酸序列比较示于图2和图3。
根据这些结果，应该明白大多数具有高度同源性的位点位于N-末端区域，特别是在乳发酵短杆菌HD的氨基酸序列中，具高度同源性的位点集中于100～230氨基酸区域。根据前面提及的事实可推定，是HD活性区域存在于N-末端一侧，这些事实包括乳发酵短杆菌HD2个突变位点位于N-末端约100个氨基酸残基以内，尤其突变位点1位于N-末端第23个氨基酸位置，并且这两个突变位点是与、Ecoli的HD-1及HD-2、枯草杆菌的HD及乳发酵短杆菌HD之间具有高度的保守性的氨基酸残基，进而Eoli的HD-1及HD-2没有相应于乳发酵短杆菌HD N-末端一侧的约100个氨基酸残基的序列。
另一方面，对L-苏氨酸具有钝化抑制的谷氨酸棒状杆菌HD基因的碱基序列已经发表。即，Sahm等报导由于点突变，C-末端第68个氨基酸发生了替代(Reinscheid，D.J.et al.，J.Bacteriol.，173(10)，3228-3230(1991))，并且Sinskey等报导由于点突变导致的阅读框移位，C-末端第17个氨基酸及后面部分发生改变以及第7个氨基酸及后面部分的缺失(Archer，J.A.C.等，Gene，107，53-59(1991))。此外，氨基酸残基的突变位于乳发酵短杆菌AI6080菌株钝化-抑制HD中C-末端的第53个氨基酸残基位置。另外，在E.coliHD-1和HD-2中不存在的C-末端一侧区域存在于枯草杆菌的HD中，它与乳发酵短杆菌HD以同样的方式受L-苏氨酸的反馈抑制。因此，推测关于L-关于苏氨酸反馈抑制的HD区域存在于C-末端一侧。实施例2野生型AK基因和突变型AK基因的制备和分析<1>野生型和突变型AK基因及含有它们的质粒的构建根据常规方法从乳发酵短杆菌2256菌株(ATCC 13869)中、及由2256株突变处理而得到的产L-赖氨酸突变菌株AJ3463(FERM P-1987)制备的染色体DNA。AK基因根据PCR方法(聚合酶链式反应；见Wshite，T.J.等，Frends Genet.，5，185(1989)从染色体DNA中得到扩增。用于扩增的DNA引物基于对棒状杆菌glutamicum已知的序列(见Molecular Microbiology(1991)，5(5)，1197-1204，and Mol Gen.Genet.(1990)，224，317-324)为了扩增编码AK基因的约1643 bP的区域具有5’--TCGCGAAGTAGCACCGTGTTCACTT-3’(SEQ ID NO5)序列和5’-ACGGATTCAACTTACGGCC(SEQ ID NO6)的23碱基及21碱基单链DNA被合成。根据常规的磷酰亚胺方法(见TetrahedronLetters(1981)，22，1859))从Applied Biosystem(1981)，公司生产的Model380B型DNA合成仪加以合成DNA。
在PCR反应中，基因扩增根据供应商指定的方法，通过用TakaraShuzo公司生产的Model PJ2000 DNA热循环仪和Taq DNA聚合酶加以完成。经凝胶电泳确证1643Kb的基因片段被扩增以后，从凝胶中切下的片段根据常规方法纯化，并以限制酶NruI(Takara Shuzo公司生产)和EcoRI(Takara Shuzp公司生产)加以切割。
pHSG399(见Takeshita，S.et al.，Gene(1987)，61，63-74)被用作克隆基因片段的载体。PHSG399以限制酶SamI(由Takara Shuzo Co.，Letd.生产)及限制酶EcoRI切割，并被连上扩增的AK基因片段。DNA连接通过用DNA连接试剂盒(由Takara Shuzo公司生产)以指定方法加以完成。这样便制备出pHSG399被连到从短杆菌株菌染色体扩增的AK基因产物上的质粒。具有来自作为野生菌株的2256菌株(ATCC13869)AK基因的质粒被命名为p399AKY，并且具有来自作为产L-赖氨酸细菌的AJ3463AK基因的质粒被命名为p399AK9。
具有能使质粒在棒状杆菌属细菌(下文称“Coryne.-ori”)中自主复制能力的DNA片段分别被导入p399AKY用p399AK9以制备出带有能在棒状杆菌属细菌中自主复制的AK基因的质粒Coryne.-ori从能在大肠埃希氏杆菌细胞和棒状杆菌属细菌细胞中自主复制的质粒载体得到制备。一些这类质粒载体已有报道。然而，在本发明中，使用的是穿梭载体pHK4，它是从能在杆状菌细胞中自主复制的质粒pAJ1844中，(见公开的日本专利NO58-216199)和能在Escherichia coli细胞中自主复制的质粒pHSG298中)见(Takeshita，S.et al.，Gene，61，63-74(1987))制备出。
pHK4的制备方法在公开的日本专利NO5-7491中有详细描述，然而，可将其简述如下。pAJ1844以限制酶Sau 3AI部分切割，并与用限制酶Bam HI完全切割的pHSG298连接。连接后的DNA被导入乳发酵短杆菌AJ12036(FERM-p7559)。一种电脉冲方法(见公开的日本专利NO2-207791)被用于转化。转化子的选择通过用含25μg/mL卡那霉素的M-CM2G平板(在11纯水(pH7.2)中含5g葡萄糖，10g多聚肽(Polypepeone)、10g酵母提取液、5g NaCl，0.2gDL-甲硫氨酸和15g琼脂)来完成。从转化子中制备质粒，并且选择出最小的质粒，命名为pHK4。该质粒可在大肠埃希氏杆菌及杆状菌中自主复制并赋予宿主对卡那霉素的抗性。
按上述获得的pHK4以限制酶Kpm(由Takara Shuzo公司生产)切割，切点为平末端。平末端的形成是根据指定方法，以DNA钝化试剂盒(由Takara Shuzo公司生产)来完成。平末端形成以后，连接上磷酸化Bam HI接头(由Taraka Shuzo公司生产)以产生修饰，从而允许Coryne.-ori部分的DNA片段仅被Bam HI从pHK4切割。该质粒以BamHI切割。产生的Coryne.-ori DNA片段同样地连接到用Bam HI从相同的方式切割的p399AKY或p399AK9上，以制备出能在棒状杆菌属细菌中自主复制且含有AK基因的质粒。
含有来自p399AKY野生型AK基因的质粒被命名为p399AKYB，并且含有来自p399AK9突变型AK基因的质粒被命名为p399AK9B。p399AK9B和p399AKYB的构建过程示于图4。向作为乳发酵短杆菌野生型菌株的AJ12036菌株(FERM-P7559)导入突变型AK质粒p399AK9B而获得的AJ12691菌株于1992年4月10日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute ofBioscieno and Human Technology of Agency of Industrial Science andTech；nology)，保藏号为FERM P-12918，于1995年2月10日，根据布达佩斯条约转移到国际保藏，保藏号为FERM BP-4999。
<2>乳发酵短杆菌野生型及突变型AK基因的碱基序列的测定从每个转化子中制备含有野生型AK基因的质粒p399AKY及含有突变型AK基因的质粒p399AK9，并且野生型及突变型AK基因的碱基序列被测定。碱基序列的测定根据Sanger方法(F.Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci..74，5463(1977))等)完成。
由p333AK编码的野生型AK基因的碱基序列示于序列表的序列号7中。另一方面，由p399AK编码的突变型AK基因的碱基序列仅具有一个碱基的突变，即与野生型AK相比，在序列号7中第1051个G变为A。对于AK基因，已知2个亚基α，β由相同DNA链上相同的阅读框编码(见Kalinowski，J.et al.Molecular Microbiology(1991)，5(5)，1197-1204)。从同源性判断，推测该例中的基因，其α、β2个亚基在相同的DNA链上以相同的阅读框编码。
从DNA碱基序列推导的野生型AK蛋白质α-亚基的氨基酸序列与DNA序列一起表示于序列表序列号8中。此氨基酸序列表示于序列号9中。另外，从DNA碱基序列推导的野生型AK蛋白质β-亚基的氨基酸序列与DNA序列一起显示于序列表的序列号10中。单一的氨基酸序列显示于序列号11中。每个亚单位用GTG作为起始密码子，其相应的氨基酸为甲硫氨酸。然而，这代表着甲硫氨酸，缬氨酸或甲酰甲硫氨酸。
另一方面，在突变型AK基因序列上的突变表明发生了氨基酸残基的替代以致相对于野生型AK蛋白质的氨基酸序列(序列号8、10)，α亚基的第279个丙氨酸残基以苏氨酸残基替代，并且β亚基中第30个丙氨酸残基以苏氨酸残基替代。
<3>突变型AK基因表达产物的AK活性及抑制钝化的评估制备出野生野生型AK质粒p399AKYB和突变型AK质粒p399AK9B被分别导入作为(乳发酵短杆菌谷氨酸棒状杆菌)野生型菌株的AJ12036菌株(FERM-p7559)而形成的菌株。基因向棒状杆菌的导入根据电脉冲方法完成。测定作为宿主的乳发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)AJ12036菌株、具有野生型AK质粒的AJ12690菌株及具有突变型AK质粒的AJ12691(FERM-P12918)菌株的AK活性。活性测定根据常规方法(见Miyajima，R.et al.The Journal ofBiochemistry(1968)，63(2)，139-148)完成。
如表3中所示，已证实，由于AK质粒的导入，AK的特异活性增加到约10～15倍，由L-赖氨酸和L-苏氨酸的积累抑制仅在具有导入突变型AK质粒的菌株被钝化。表3表示了乳发酵短杆菌野生型AJ12036菌株细菌细胞、及其具有野生型AK质粒的AJ12690菌株具有突变型AK质粒AJ12691菌株的破碎液的AK比活性由于L-赖氨酸及L-苏氨酸对其的积累抑制程度。添加作为抑制剂的L-赖氨酸和L-苏氨酸，其终浓度各自均为1Mm。
表3菌株 AK比活性(mU/mg蛋白)没有添加+1mM L-赖氨酸+1mM L-苏氨酸AJ12036 19.0 2.6AJ12690 235.3 34.6AJ12691 210.5 145.3<4>通过位点特异的突变对突变型AK基因AK基因的改进为了进一步改进按上述获得的突变型AK，试图通过位点特异的突变手段，以另外的氨基酸残基替代突变型AK的突变位点(279Ala→Thr)在所需位点导致所需突变的位点特异的突变包括如用PCR方法(Higuchi，R.，61，in PCR Technology(Erlich，H.A.Eds.，Stockton Press(1989))，使用噬菌体的方法(Kramer，W.and Frits，H.J.，Meth.in Enzymol，154，350(1987)；Kunkel，T.A et al.，Meth.in Enzymol.，154，367(1987))。
关于通过突变要被导入的氨基酸残基种类，20种氨基酸根据各自的特性如极性和分子结构加以分类，并且选择了代表性的8种(Arg，Asp，Cys，Phe，Pro，Ser，Tyr，Val)。在各自突变位点的氨基酸突变和碱基替代列于表4。
表4突变的识别突变位点和氨基酸改变Thr279Ala GCT→Thr A*CTArg279Ala GCT→Arg C*G*TAsp279Ala GCT→Asp GA*TCys279Ala GCT→Cys T*G*TPhe279Ala GCT-→Phe T*T*TPro279Ala GCT→Pro C*CTSer279Ala GCT→Ser T*CTTyr279Ala GCT→Tyr T*A*TVal279Ala GCT→Val GT*T这里使用的导入突变的方法如下。8种合成的23个碱基的DNA(其中将导入突变的第279个丙氨酸残基的密码子替代成所需氨基酸残基密码子)被命名(作为导入精氨酸的合成DNA5’-GCCAGGCGAG CGT GCCAAGGTTT-3’SEQ ID NO12；作为导入天冬氨酸的合成DNA5’-GCCAGGCGAG GAT GCCAAGGTTT-3’SEQID NO13；作为导入半胱氨酸的合成DNA5’-GCCAGGCG AG TGTGCCAAGGTTT-3’SEQ ID NO14；作为导入苯丙氨酸的合成DNA5’-GCCAGGCGAG TTT GCCAAGGTTT-3’SEQ ID NO15；作为导入脯氨酸的合成DNA5’-GCCAGGCGAG CCT GCCAAGGTTT-3’SEQ ID NO16；作为导入丝氨酸的合成DNA5’-GCCAGGCGAGTCT GCCAAGGTTT-3’SEQ ID NO17； 作为导入酪氨酸的合成DNA5’GCCAGGCGAG TAT GCCAAGGTTT-3’SEQ ID NO18以及作为导入缬氨酸的合成DNA5’GCCAGGCGAG GTTGCCAAGGTTT-3’SEQ ID NO19)。16种23个碱基的单链DNA。与它们的互补序列一起合成。
例如，当要导入精氨酸残基时，具有序列5’-GCCAGGCGAG CGTGCCAAGGTTT-3’(SEQ ID NO12)的单链DNA，作为其互补链的单链DNA，具有SEQ ID NO5序列的单链DNA以及具有SEQ ID NO6的单链DNA被用作引物。PCR方法以p399AKY作为模板加以完成。主了避免非特异性突变的导入，含突变点的约280碱基对以限制酶(NaeI-AvalI)从制备的DNA中切割出来，并与p399AKY的相应位点点替代后，制备重组质粒。对替代区域进行碱基序列的确认。
在对8种获得的重组质粒中每个所具有的突变型AK酶活性的测定和评估时，一种完全缺失型E.oli菌株Gif106M1被用作宿主(Boy，E.and Patte，J.C.，J.Bacterid.，112，84-92(1972)；Theze，J.et al.，J.Bacteriol.，117，133-143(1974))，因为对于杆状菌，没有已知的AK缺失型菌株。另外，认为宿主AK和来自质粒AK以混合的方式存在，可能导致不准确的测定。已知许多杆状菌基因在E.coli-中表达。因此推测，由于AK基因被连接在pHSG399 lac启动子下游，故可在大肠埃希氏杆菌中表达。
用野生型及8种重组质粒转化E.coli Gif160M1，从每个转化菌株中制备无细胞提取液，且完成酶分析。AK活性以Miyajima，R.et al描述的方法(The Journal of Biochemistry(1968)，63(2)，139-148)加以测定。在添加5mML-赖氨酸、5；mML-苏氨酸或每个2mM L-赖氨酸及L-苏氨酸情况下，抑制钝化程度和特异活性列于表5。
表5特异活性 5mM赖氨 5mM苏氨 2mM赖氨酸(mU/mg 蛋酸 酸＋苏氨酸白)(％) (％) (％)AJ12036 5.652.0 87.0 7.0野生型316.4 52.7 86.8 6.2苏氨酸374.4 58.7 109.1 78.3精氨酸197.4 41.4 106.8 58.6半胱氨酸 267.0 66.5 135.7 60.6苯丙氨酸 447.7 14.6 105.0 32.4脯氨酸125.0 77.5 123.2 85.2丝氨酸406.8 55.0 114.4 37.0酪氨酸425.6 16.1 104.8 32.2缬氨酸448.9 60.5 103.5 75.5结果，在转变为酸性氨基酸如天冬氨酸的情况下，AK被失活，而在转变为任一其它氨基酸的情况下，L-赖氨酸和L-苏氨酸的抑制被纯化。
实施例3HD突变型菌株和HD缺陷菌株L-赖氨酸产率的评估为了比较突变型HD基因和缺陷型HD对L-赖氨酸产率的影响，制作将突变型HD基因或具有部分序列缺失的HD基因整合到同样宿主的染色体的基因-替代菌株，分别用作HD突变菌株和HD缺陷菌株，并用于L-赖氨酸产率的评估。
<1>替代突变型HD基因质粒和替代缺陷型HD基因质粒的制备制备基因替代质粒，通过突变型HD基因或具有部分序列缺失的HD基因的同源重组，导入到乳发酵短杆菌AJ12036菌株(FERM BP-734)(通过缺失乳发酵短杆菌2256菌株)(ATCC13869)而获得)的染色体DNA中。
(1)具有突变位点I的HD基因的制备在实施例1中获得的突变型HD基因有2种，包括具有突变位点1(155C→T(23Leu→Phe)和突变位点2(398G→A(104Val→Ile))的突变型HD基因(来自AJ12472菌株)以及仅具突变位点2的突变型基因(来自AJ12937)。为了研究突变位点1对HD活性和L-赖氨酸产率的影响，制备仅具突变位点1的突变型HD基因。下文中，具有突变位点1的突变型HD称作HD-M1，具有突变位点2的突变型HD称作HD-M2，既具有突变点位1又具有突变点2的突变型HD称作HDM-12。
含有HDM-12基因的质粒pHDMI用切断突变位点1和2之间的限制酶TthIII1，及切割载体和HD基因的连接点的Kpnl切割，从而获得具有突变位点1的5’一侧HD片段。用相同的方式，具有野生型HD基因的pHDW用TthIII1和Kpnl切割获得3’一侧HD片段。这样通过连接5’一侧HD片段和3’一侧HD片段而获得仅具有突变点1的HD-M1基因。
(2)基因替代用质粒的构建按上述获得的仅具有突变点1的HD-M1基因插入到具有氯霉素抗性基因(Cm1)的载体质粒pHSG398KpnI位点上。进而将来自乳发酵短杆菌野生菌株的温度敏感复制起点(TSori)插入pHSG398的BamHI位点。这样便构建出替代HD-M1基因的质粒pTSHDM1。TSori从质粒pHSC4中制备(见公开的日本专利5-7491)，pHSC4质粒通过在体外以羟胺处理具有Coryne.-ori的质粒pHK4，用处理后的质粒DNA转化乳发酵短杆菌AJ12036，并从不能在高温(34℃)生长的转化菌株回收质粒而获得。Coryne.-ori可以用BamHI和KpnI从pHSC4中切割出来，但是仅以Bam HI切割改变了可以切割Coryne.-ori的质粒。pHSC4以限制酶KpnI(由Takara Shuzo公司生产)切割且切割面是平末端。平末端的形成是用DNA平切割试剂盒(由Takara Shuzo公司生产)根据指定的方法加以完成。平末端形成以后，连结上磷酸化的BamHI接头(由Takara Shuzo公司生产)以产生修饰，从而允许TSori部分的DNA片段仅以Bam HI从pHSC4切割。具有pHSC4的Escherichia coli AJ12571于1990年10月11日保藏于通商产业省工业科技术院生命工学工业技术研究所，保藏号为FERMP-11763，根据布达佩斯条约于1991年8月26目转移到国际保藏，保藏号为FERM BP-3524。
其次，以同样的方式，含有仅具突变点2的HD-M2基因的质粒pHDII用KpnI切割以获得HD-M2基因片段，并将其插入到pHSG398的KpnI位点。进而通过将TSori被插入到Bam HI位点，构建出替代HD-M2基因用的质粒pTSHDM2。
此外，含有既具突变点1又具突变点2的HD-M12基因的质粒pHDMI以KpnI切割，从而获得HD-M12基因片段，并导入PHSG398KpnI位点。进而，通过将TSori插入BamHI位点。构建出替代HD-M12基因用的质粒pTSHDM12。
此外，具有野生型HD基因的质粒pHDW以AatII切割，并且缺失存在于HD基因中两个AatII位点。(在序列号3，碱基号为716-722和1082-1087)。之间的部分。这样便制备出含有部分缺失的HD基因(HD-Δ基因)的质粒。该质粒用KpnI切割以获得HD-Δ基因片段并被插入pHSG398的KpnI位点。接着将TSori插入BamHI位点。这样便构建出替代HD-Δ基因的质粒pTSHΔ。
(3).HD突变菌株和HD缺陷菌株的制备乳发酵短杆菌AJ12036菌株的转化根据电脉冲方法(Sugimoto等，公开的日本专利No.2-207791)，使用上述得到的替代突变型HD基因质粒pTSHDMI、pTSHDM2和pTSHDM12以及替代缺失型HD基因质粒pTSHDΔ加以完成。
获得的转化菌株以M-CM2G培养基在25℃培养，直到获得完全生长(约1-2×109/mL)。培养的细菌细胞被稀释到每板105个细胞，涂布于含氯霉素(5μg/mL)的M-CM2G固体平板培养基，并在34℃培养2～7天以获得菌落。确认获得的菌落细胞中不含质粒。进而，以线形pHSG398作为探针，通过Southern杂交分析手段确认基因替代用质粒被整合进染色体。
在按上述获得的染色体整合菌株中，最初存在于染色体上的HD基因和突变型或与缺失型HD基因融合的基因二个在插入载体(包括TSori)的状态下被插入染色体上。
其次，为了只让突变型HD基因或缺失型HD基因留在染色体上，允许野生型HD基因和载体从染色体DNA上脱落以获得以突变型HD基因替代的菌株和以缺失型HD基因替代的菌株。野生型HD基因和载体允许按如下方式脱落。
每个整合的菌株在34℃培养于含氯霉素(10μg/ml)的M-CM2G培养基直到获得完全生长(1-2×109)。培养过的细菌细胞涂布于不含氯霉素的M-CM2G固体平板培养基以产生每板50～200个菌落并在34℃下培养。长出的菌落按同样的方式在含氯霉(5μg/mL)的M-CM2G固体平板培养基上34℃培养，从而获得氯霉素敏感型菌株。通过Southern杂交来确证载体从获得的氯霉素敏感型菌株上脱落下来。进一步确证突变型HD或缺失型HD被表达。通过染色体DNA的碱基序列测定来确认突变位点被导入这样获得的基因替代菌株。
这样获得的HD-M1基因替代菌株被命名为HDM1菌株，HD-M2基因替代菌株被命名为HDM2菌株，并且HD-Δ基因替代菌株被命名为HDΔ菌株。
<2>HD突变菌株和HD缺陷菌株的L-赖氨酸产率研究作为HD突变菌株的HDM1、HDM2和HDM12菌株以及作为HD缺陷菌株的HDΔ菌株的L-赖氨酸产率。进行了用单个菌落分离的这些HD突变菌株和HD缺陷菌株以及作为HD野生菌株的AJ12036菌株分别在31.5℃于500mL的加有20mL下述的产L-赖氨酸的培养基烧瓶中，振荡培养72小时，L-赖氨酸的最终OD(OD562)和积累量被测定。(产L-赖氨酸的培养基)该培养基通过溶解下述的成分(在1L)，用KOH调节pH至8.0，在115℃灭菌15分钟，然后加入50g/L的通过干燥状态下加热灭菌的CaCO3葡萄糖100g(NH4)SO455gKH2PO41gMgSO4.7H20 1gd-生物素 500μg硫氨素-HCL2000μgFeSO4.7H2O 0.01gMnSO4.7H2O 0.01g尼克酰胺 5mgMamenou(T-N) 1.05gGD113 0.05ml结果显示于图5。任何菌株中未发现剩余糖。正如从结果中所阐明的，在AJ12036菌株中很少观察到L-赖氨酸的积累，而HDM1菌株中约有4g/L，HDM2菌株中约有17g/L，在HDM12菌株中约有7.5g/L且HDΔ菌株中约有30g/L。在后面的任一菌株中观察到L-赖氨酸的积累。尤其在HDΔ菌株中，L-赖氨酸产率显著提高。此外，发现即使仅突变点1向HD的导入，L-赖氨酸也被积累。
HDΔ菌株在或基本培养基只添加L-苏氨酸或L-甲硫氨酸的基本培养基上不生长，然而，通过加入L-高丝氨酸或L-苏氨酸和L-甲硫氨酸，其生长又恢复。HDM1、HDM2和HDM12菌株的任何一种能够在既不含L-苏氨酸也不含L-甲硫氨酸的基本培养基中生长。
乳发酵短杆菌HDΔ菌株被命名为乳发酵短杆菌AJ12846。它于1995年2月2日被保藏于通商产业省工业技术院生命工学技术研究所，保藏编号为P-14197，并与1994年2月2日根据布达佩斯条约转移到国际保藏，其保藏号为FERM BP-4995。
实施例4AK基因在HD突变菌株和HD缺陷菌中的扩增效果如在实施例3中所描述的，已阐明L-赖氨酸产率通过向野生菌株中导入突变型HD基因和缺失型HD基因而被提高。进而对通过结合AK基因因扩增与突变型HD基因和缺失型HD基的预期效应进行了进一步研究。
已知AK受L-赖氨酸和L-苏氨酸的协同抑制，然而，在它们分别单独存在的情况下抑制程度低。因此，既然HD突变菌株和HD缺陷菌株不产生L-苏氨酸，预期L-赖氨酸产率也可通过野生型AK基因的扩增而提高。而且还预期L-赖氨酸产率可通过导入在实施例2中获得的不受L-赖氨酸和L-苏氨酸抑制的编码突变型AK的基因而进一步提高。
为了研究突变型HD基因或缺失型HD基因与AK基因扩增导入的这种结合效应，含有AK基因的质粒被导入在实施例3中获得的HD突变菌株和HD缺陷菌株中，并且评估L-赖氨酸的产率。
作为野生菌株的AJ12036菌株，作为HD突变菌株的HDM1、HDM2和HDM12以及作为HD缺陷菌株的HDΔ分别被用作各个宿主，并且以具有野生型AK基因和Coryne.-ori的质粒(p399AKYB)及具有突变型AK的质粒(p399AK9B)转化。即，5种宿主被2种质粒转化并一共获得10种转化菌株。
AJ12036、HDM1、HDM2、HDM12和HDΔ的每个转化菌株的2个菌株用前面提及的产L-赖氨酸培养基加以培养并且测量L-赖氨酸产率。然而，具有p399AKYB质粒和p399AK9B质粒的转化菌株在添加有10μg/mL氯霉素的前培养培养基和产L-赖氨酸培养基中培养。培养以在添加有20mL培养基的500mL烧瓶中完成。
根据图6中显示的结果，对于AJ12036菌株即使导入野生型AK质粒也没观察到L-赖氨酸产率的提高，而在HD突变菌株和HD缺陷菌株，观察到由于野生型AK质粒的导入所致的L-赖氨酸积累量的增加。此外，当导入突变型AK质粒时，HD突变菌株和HD缺陷菌株的L-赖氨酸产率与导入野生型AK质粒的情况相比有进一步的提高。此外，由于突变型AK质粒的导入，甚至在含有野生型HD基因的AJ12036菌株情况下仍观察到约22g/l的L-赖氨酸积累量。
实施例5在HD突变菌株和HD缺陷菌株中突变型AK基因基因替代的效果<1>.以实变型AK基因和突变型HD基因替代菌株及以突变型AK和缺失型HD基因替代菌株的产生HD突变和HD缺陷与AK基因扩增的结合效应已在实施例4中研究过。本实施例涉及突变型HD基因或缺失型HD基因整合到染色体上的同时，建立突变型AK基因整合到染色体上的株，从而估计L-赖氨酸产率。
用于整合突变型AK基因进入染色体DNA的基因替代质粒按如下获得。
替代突变型AK基因的质粒pAK9T通过将乳发酵短杆菌的温度敏感复制起点(TSori)插入存在于在实施例2中获得的质粒p399AK9(以乳发酵短杆菌AJ3463菌株染色体中扩增的突变型AK基因片段连接到pHSG399而形成的质粒)载体部分的BamHI位点而构建。
导入有突变型AK基因和HD-M1基因的菌株[(AKFBR＋HDm1菌株]通过用替代突变型AK基因质粒pAK97整合实变型AK基因，用在实施例4中获得的HDM1菌株作母本菌株而获得。pAK9T通过电脉冲方法(Sugimoto等，公开的日本专利NO2-207791)导入HDM1菌株。并且获得的转化菌株在25℃，用M-CM2G培养基培养到获得完全生长(约1-2×109/ml)为止。稀释培养过的细菌细胞以获得每个平板105个细胞，涂布于含氯霉素(5μg/mL)的M-CM2G固体平板培养基，并在34℃培养2-7天以获得菌落。确证获得菌落的细胞不含质粒。进而，用线性的pHSG399作为探针，通过Souther杂交分析确证pAK9T整合进染色体。
在上述获得的整合染色体菌株中，最初存在于染色体上的AK基因和突变型AK基因的融合基因在插入载体(包括TSori)的状态下被插入染色体中。其次，为了只让突变型AK基因留在染色体DNA上，使野生型AK基因和载体脱落以获得突变型AK基因替代的菌株。载体按如下脱落。
整合有突变型AK基因的菌株在34℃于含有氯霉素(10μg/mL)的M-CM2G培养基中培养到获得完全生长(1-2×109)。培养过的细菌细胞涂布于不含氯霉素的M-CM2G固体平板培养基，从而使每板具50-200个菌落并在34℃培养。形成菌落的克隆中，筛选出较母本HDM1菌株的L-赖氨酸产率有提高的菌株。
具有突变型AK基因和HD-M12基因株[AKTBR+HDM12株]用HDM菌株作为母本菌株。
用同样的方式进行，通过用pAK97基因替代，筛选出与HDM12菌株相比L-赖氨酸产率有提高的菌株。
另一方面，导入有突变型AK基因和HD-M2基因的菌株[(AKFBR＋HDM2菌株]通过在乳发酵短杆菌AJ12036菌株上导入pAK9T后创建具有导入突变型AK基因的AKFBR菌株作为母本菌株，接着导入HD-M2基因而获得。即，pAK9T通过电脉冲方法(Sugimoto等，公开的日本专利NO2-207791)导入AJ12036菌株中，并且将获得的转化菌株在25℃，用M-CM2G培养基培养到获得完全生长(约1-2×109mL)。培养过的细菌细胞稀释到每板105个细胞，涂布于含氯霉素(5μg/mL)的M-CM2G固体平板培养基，并于34℃培养2-7天以获得菌落。确证获得的菌落细胞中不含质粒。此外，用线性pHSG399作为探针，通过Southern杂交分析来确证pAK9T整合进染色体中。
其次，整合有突变型AK基因的菌株在34℃，培养于含氯霉素(10μg/mL)的M-CM2G培养基中，直到获得完全生长(1-2×109)。培养过的细菌细胞涂布于不含氯霉素的M-CM2G固体平板培养基以获得每板50～200个菌落并于34℃培养。长出的菌落再按相同的方式，在34℃培养于含氯霉素(5μg/mL)的M-CM2G固体平板培养基以获得氯霉素敏感型菌株。通过Southern杂交确证载体从获得的氯霉素敏感菌株染色体上脱落。突变型AD基因的表达也被进一步确证。通过染色体DNA的碱基序列测定来确证这样获得的基因替代菌株具有导入的突变位点。
按上述通过电脉冲方法以相同的方式，将替代HD-M2基因的质粒pTSHDM2导入这样获得的突变型AK基因替代菌株(AKFBR菌株)染色体，并获得质粒脱落的基因替代菌株。基因替代菌株的筛选根据对L-赖氨酸产率的提高和L-苏氨酸或L-甲硫氨酸的敏感性进行的。
以同样的方式，导入有突变型AK基因和HDΔ基因的菌株(AKFBR+HDΔ)通过用突变型AK基因替代菌株(AKFBR菌株)作为母本菌株，按上述以同样的方式用pTSHDΔ完成基因替代，并筛选出由于HD缺陷而对L-甲硫氨酸和L-苏氨酸营养缺陷的克隆而获得。
对于按上述获得的每个基因替代菌株，突变点的导入最终是通过DNA碱基序列来加以确证。此外，质粒脱落是通过Southern杂交证实的。
<2>以突变型AK基因和突变型HD基因替代的菌株和以突变型AK基因和缺失型HD基因替代的菌株的L-赖氨酸产率的估计进行按上述获得的4种菌株，即(AKFBR＋HDM1)、(AKFBR＋HDM2)、(AKFBR＋HDM12)和(AKFBR＋HDΔ)菌株的L-赖氨酸产率评估。
这些菌株中每个在31-35℃培养于500mL烧瓶中72小时，其中加有20mL前面提及的L-赖氨酸生产培养基，测定培养液的LD和积累的L-赖氨酸量。
结果如图7如示。AKFBR菌株的L-赖氨酸产量约19g/L，而(AKFBR＋HDM1)菌株约21g/L，(AKFBR＋HDM2)菌株约22g/L，(AKFBR＋HDM12)菌株约20g/L，(AKFBR＋HDΔ)菌株约35g/L。与单独导入突变型HD基因或缺失型HD基因时相比，这些基因与突变型AK基因组合导入时，L-赖氨酸产率有进一步提高。
培养完成后，AKFBR菌株与(AKFBR＋HDM1)、(AKFBR＋HDM2)与(AKFBR＋HDM12)菌株的任一种之间的OD只有微小差异。然而，与单独以缺失型HD基因替代的菌株相比，在(AKFBR＋HDΔ)菌株情况下，OD减少得更多。培养完成以后任何菌株中均未发现有残糖。
(AKFBR＋HDM2)、(AKFBR＋HDM12)和(AKFBR＋HDΔ)菌株分别被命名为AJ12848(FERMP-14198)、AJ12849(FERM P-14199)和AJ12850(FERMP-14200)。它们于1994年3月1日分别被保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏编号按上述的圆括号中数字，于1995年2月9日、根据布达佩斯条约转移到国际保藏，并且名藏号分别是FERM BP-4996，FERM BP-4997和FERM BP-4998。实施例6HD完全缺陷菌株回复突变频率的测定对于通过在染色体上基因替化而获得的HD完全缺陷型菌株(HD和AKFBR＋HDΔ菌株〕和通过用作为常规突变处理剂的N-甲基N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理活细菌细胞而获得的HDΔ缺陷菌株ATCC13287比较高丝氨酸营养缺陷的回复突变频率。
比较方法如下。贮存的菌株在富含营养的培养基中预培养，再接种到L-赖氨酸生产培养基上。经72小时振荡培养后，将培养液适当稀释。菌落在M-CM2G固体平板培养基上长出后，再按相同方式培养于既不含L-甲硫氨酸也不含L-苏氨酸的短杆菌属菌基本培养基中培养。在基本培养基上长出菌落和在营养丰富培养基上长出的菌落比例被看作为回复突变比例。当用该方法没能观察到回复突变菌株的菌落时，增加涂敷在基本培养基的细菌细胞数目，另一方培养基涂敷稀释物，从菌落形成数推测出涂敷在基本培养基上的菌数，算出回复突变率。
通过该方法对前面提及的三种菌株回复突变的测定结果列于表6。培养完成时，在ATCC13287菌株中出现较多的回复突变菌株。相反，在用染色体重组制备的HDΔ和AKFBR＋HDΔ菌株中根本没有观察到回复突变菌株。此外，没有发生回复突变的HDΔ菌株较ATCC13287菌株具有更高的L-赖氨酸产量。
表6菌株回复突变频率(％) 积累的L-赖氨酸量(g/L)ATCC13287 40 20.0HDΔ 030.0AKFBR＋HDΔ 035.0
序列表SEQ ID NO.1 信息序列特征长度20类型核酸链型单链拓扑学线性分子类型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO.1CTGGGAAGGT GAATCGAATTSEQ ID NO.2信息序列特征长度20类型核酸链型单链拓扑学线性分子类型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID No.2TCCGAGGTTT GCAGAAGATC 20SEQ ID No.3信息序列特征长度1478类型核酸链型双链拓扑学线性分子类型基因组DNA最初来源有机体乳发酵短杆菌菌株AJ12036特征名字/关键字CDS位置89…1423鉴定方法S序列描述SEQ ID NO.3GGTACCCTTT TTGTTTTGGA CACATGTAGG GTGGCCGAAA CAAAGTAATA GGACAACAAC 60GCTCGACCGC GATTATTTTT GGAGAATC ATG ACC TCA GCA TCT GCC CCA AGC112Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser1 5TTT AAC CCC GGC AAG GGT CCC GGC TCA GCA GTC GGA ATT GCC CTT TTA 160Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu10 15 20GGA TTC GGA ACA GTC GGC ACT GAG GTG ATG CGT CTG ATG ACC GAG TAC 208Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr25 30 35 40GGT GAT GAA CTT GCG CAC CGC ATT GGT GGC CCA CTG GAG GTT CGT GGC 256Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly45 50 55ATT GCT GTT TCT GAT ATC TCA AAG CCA CGT GAA GGC GTT GCA CCT GAG 304Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu60 65 70CTG CTC ACT GAG GAC GCT TTT GCA CTC ATC GAG CGC GAG GAT GTT GAC 352Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp75 80 85ATC GTC GTT GAG GTT ATC GGC GGC ATT GAG TAC CCA CGT GAG GTA GTT 400Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val90 95 100CTC GCA GCT CTG AAG GCC GGC AAG TCT GTT GTT ACC GCC AAT AAG GCT 448Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala105 110 115 120CTT GTT GCA GCT CAC TCT GCT GAG CTT GCT GAT GCA GCG GAA GCC GCA 496Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala125 130 135AAC GTT GAC CTG TAC TTC GAG GCT GCT GTT GCA GCC GCA ATT CCA GTG 544Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala Ala Val Ala Ala Ala Ile Pro Val140 145 150GTT GGC CCA CTG CGT CGC TCC CTG GCT GGC GAT CAG ATC CAG TCT GTG 592Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val155 160 165ATG GGC ATC GTT AAC GGC ACC ACC AAC TTC ATC TTG GAC GCC ATG GAT 640Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp170 175 180TCC ACC GGC GCT GAC TAT GCA GAT TCT TTG GCT GAG GCA ACT CGT TTG 688Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu185 190 195 200GGT TAC GCC GAA GCT GAT CCA ACT GCA GAC GTC GAA GGC CAT GAC GCC 736Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala205 210 215GCA TCC AAG GCT GCA ATT TTG GCA TCC ATC GCT TTC CAC ACC CGT GTT 784Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val220 225 230ACC GCG GAT GAT GTG TAC TGC GAA GGT ATC AGC AAC ATC AGC GCT GCC 832Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala235 240 245GAC ATT GAG GCA GCA CAG CAG GCA GGC CAC ACC ATC AAG TTG TTG GCC 880Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala250 255 260ATC TGT GAG AAG TTC ACC AAC AAG GAA GGA AAG TCG GCT ATT TCT GCT 928Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala265 270 275 280CGC GTG CAC CCG ACT CTA TTA CCT GTG TCC CAC CCA CTG GCG TCG GTA 976Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val285 290 295AAC AAG TCC TTT AAT GCA ATC TTT GTT GAA GCA GAA GCA GCT GGT CGC 1024Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg300 305 310CTG ATG TTC TAC GGA AAC GGT GCA GGT GGC GCG CCA ACC GCG TCT GCT 1072Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala315 320 325GTG CTT GGC GAC GTC GTT GGT GCC GCA CGA AAC AAG GTG CAC GGT GGC 1120Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly330 335 340CGT GCT CCA GGT GAG TCC ACC TAC GCT AAC CTG CCG ATC GCT GAT TTC 1168Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe345 350 355360GGT GAG ACC ACC ACT CGT TAC CAC CTC GAC ATG GAT GTG GAA GAT CGC 1216Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg365 370 375GTG GGC GTT TTG GCT GAA TTG GCT AGC CTG TTC TCT GAG CAA GGA ATC 1264Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile380 385 390TCC CTG CGT ACA ATC CGA CAG GAA GAG CGC GAT GAT GAT GCA CGT CTG 1312Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu395 400 405ATC GTT GTC ACG CAC TCT GCG CTG GAA TCT GAT CTT TCC CGC ACC GTT 1360Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val410 415 420GAA CTG CTG AAG GCT AAG CCT GTT GTT AAG GCA ATC AAC AGT GTG ATC 1408Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile425 430 435 440CGC CTC GAA AGG GAC T AATTTTACTG ACATGGCAAT TGAACTGAAC GTCGGTCGTA 1464Arg Leu Glu Arg Asp445AGGTTACCGT CACG 1478SEQ ID NO.4信息序列特征长度445类型氨基酸拓扑学线性分子类型蛋白质序列描述SEQ ID NO4Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly1 5 10 15Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu20 25 30Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile35 40 45Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys50 55 60Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala65 70 75 80Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly85 90 95Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys100 105 110Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu115 120 125Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala130 135 140Ala Val Ala Ala Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu145 150 155 160Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr165 170 175Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp180 185 190Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr195 200 205Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala210 215 220Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu225 230 235 240Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala245 250 255Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys260 265 270Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro275 280 285Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe290 295 300Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala305 310 315 320Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala325 330 335Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr340 345 350Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His355 360 365Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala370 375 380Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu385 390 395 400Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu405 410 415Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val420 425 430Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp435 440 445SEQ ID NO5信息序列特征长度23类型核酸链型单链拓扑学线性分子类型其它…合成的寡核苷酸序列描述 SEQ ID NO5TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23SEQ ID NO6信息序列特征长度21
类型核酸链型单链拓扑学线性分子类型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO6ACG GAATTCA ATCTTACGGC C 21SEQ ID NO7信息序列特征长度1643类型核酸链型双链拓扑学线性分子类型基因组DNA最初来源有机体谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 138698序列描述SEQ ID NO7TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC 1020GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT 1080GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC 1140GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG 1200CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC 1260CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG 1320CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG 1380ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC 1440GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT 1500TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA 1560CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT 1620CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643SEQ ID NO8信息序列特征长度1643类型核酸链型双链拓扑学线性分子类型基因组DNA最初来源有机体谷氨酸棒状杆菌菌株AJ12036特征名字/关键字mat肽位置217…1479鉴定方法S序列描述SEQ ID NO8TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234Met Ala Leu Val Val Gln1 5AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val10 15 20GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val25 30 35GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala40 45 50GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu55 60 65 70ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu75 80 85TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val90 95 100CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro105 110 115GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala120 125130GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly135 140 145 150CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn155 160 165GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala170 175 180GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe185 190 195GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu200 205 210CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg215 220 225230TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu235 240 245GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys250 255 260TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu265 270 275GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp280 285 290ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile295 300305 310ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu315 320 325AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp330 335 340CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro345 350 355GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn360 365 370ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg375 380 385 390GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG 1434Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln395 400 405CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA 1482Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg410 415 420 421AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG 1542TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT 1602TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C 1643SEQ ID NO9信息序列特征长度421类型氨基酸链型双链拓扑学线性分子类型蛋白质序列描述SEQ ID NO9Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala1 5 10 15Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala20 25 30Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp35 40 45Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg50 55 60Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu65 70 75 80Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr85 90 95Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg100 105 110Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly115 120 125Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg130 135 140Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala145 150 155 160Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val165 170 175Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys180 185 190Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly195 200 205Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn210 215 220Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu225 230 235 240Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr245 250 255Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile260 265 270Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp275 280 285Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu290 295 300Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg305 310 315 320Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr325 330335Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala340 345 350Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu355 360 365Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg370 375 380Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala385 390 395 400Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr405 410 415Ala Gly Thr Gly Arg420SEQ ID NO10信息序列特征长度1643类型核酸链型双链拓扑学线性分子类型基因组DNA最初来源有机体谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC13869特征名字/关键字mat肽位置964…1479鉴定方法S序列描述SEQ ID NO10TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu1 5 10 15GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala20 25 30AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val35 40 45CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe50 55 60ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys65 70 75CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val80 85 90 95GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val100 105 110ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Ash Val Asn Ile Glu115 120 125TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp130135 140GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly145 150 155GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg160 165 170 172AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643SEQ ID NO11信息序列特征长度172类型氨基酸拓扑学线性分子类型蛋白质序列描述SEQ ID NO11Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala1 5 10 15Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys20 25 30Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu35 40 45Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr50 55 60Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu65 70 75 80Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly85 90 95Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr100 105 110Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu115 120 125Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp130 135 140Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly145 150 155 160Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg165 170SEQ ID NO12信息序列特征
长度23类型核酸链型双链拓扑学线性分子类型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO12GCCAGGCGAG CGTGCCAAGG TTT 23SEQ ID NO13信息序列特征长度23类型核酸链型单链拓扑学线性分子类型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO13GCCAGGCGAG GATGCCAAGG TTT 23SEQ ID NO14信息序列特征长度23类型核酸链型单链拓扑学线性分子类型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO14GCCAGGCGAG TGTGCCAAGG TTT 23SEQ ID NO15信息序列特征长度23类型核酸链型单链拓扑学线性分子类型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO15GCCAGGCGAG TTTGCCAAGG TTT 23SEQ ID NO16信息序列特征长度23类型核酸链型单链拓扑学线性分子类型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO16GCCAGGCGAG CCTGCCAAGG TTT 23SEQ ID NO17信息序列特征长度23类型核酸链型单链拓扑学线性分子类型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO17GCCAGGCGAG TCTGCCAAGG TTT 23SEQ ID NO18信息序列特征长度23类型核酸链型单链拓扑学线性分子类型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO18GCCAGGCGAG TATGCCAAGG TTT 23SEQ ID NO19信息序列特征长度23
类型核酸链型单链拓扑学线性分子类型其它…合成的寡核苷酸序列描述SEQ ID NO19GCCAGGCGAG GTTGCCAAGG TTT 2权利要求
1.一种编码源于杆状菌的高丝氨酸脱氢酶的DNA片段，其中距N-末端第23位亮氨酸残基和第104位缬氨酸残基的至少之一被变换为另一种氨基酸残基。
2.一种具有编码源于杆状菌突变型高丝氨酸脱氢酶基因杆状菌，其中高丝氨酸脱氢酶N-末端的第23位亮氨酸残基和第104位缬氨酸残基的至少之一被变换为另一种氨基酸残基。
3.根据权利要求2的杆状菌，其特征是通过与杆状细菌染色体上的高丝氨酸脱氢酶基因同源重组，将编码上述突变型高丝氨酸脱氢酶的基因整合进入染色体DNA而将其转化。
4.根据权利要求2或3的杆状菌，其中所述的另一种氨基酸残基对于第23位亮氨酸残基来说为苯丙氨酸残基，并且对第104位缬氨酸残基来说为异亮氨酸残基。
5.一种杆状菌，其中通过与杆状菌染色体上高丝氨酸脱氢酶基因的同源重组，将源于杆状菌的编码部分高丝氨酸脱氢酶的DNA片段整合进染色体DNA，从而破坏该菌的高丝氨酸脱氢酶基因。
6.一种杆状菌，其细胞中具有重组DNA，该重组DNA是通过连接源于杆状菌的天冬氨酸激酶基因与能在杆状菌细胞中自主复制的载体而构建的，并且该菌不表达野生型高丝氨酸脱氢酶。
7.根据权利要求6的杆状菌，其中所述的天冬氨酸激酶基因是用于编码L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制基本被钝化的天冬氨酸激酶基因的。
8.一种杆状菌，通过整合编码源于L-赖氨酸和L-苏氨酸反馈抑制钝化的杆状菌的天冬氨酸激酶基因于杆状菌染色体DNA中而被转化，并且不表达野生型高丝氨酸脱氢酶。
9.根据权利要求7或8的杆状菌，其中的L-赖氨酸和L-苏氨酸反馈抑制钝化的天冬氨酸激酶为突变型天冬氨酸激酶，其N-末端第279位丙氨酸残基被转变为一个非丙氨酸的氨基酸残基，并且在其α-亚基中为非酸性氨基酸，并且第30位丙氨酸残基转变为一个非丙氨酸的氨基酸残基且在β-亚基中为非酸性氨基酸。
10.根据权利要求6～9的任一项的杆状菌，其中通过与杆状菌染色体上高丝氨酸脱氢酶基因的同源重组，将突变型高丝氨酸脱氢酶基因整合进入其染色体而被转化，该高丝氨酸脱氢酶源于杆状菌，其N-末端第23位亮氨酸残基和第104位缬氨酸残基至少之一被转换为另一种氨基酸残基，并且因此不表达野生型高丝氨酸脱氢酶。
11.根据权利要求6～9的任一项的杆状菌，其中通过与杆状菌染色体上高丝氨酸脱氢酶基因同源重组的方法，将编码源于杆状菌酶基因同源重组的方法，将编码源于杆状菌的部分高丝氨酸脱氢酶DNA片段整合进其染色体中，从而破坏其高丝氨酸脱氢酶基因，并且不表达野生型高丝氨酸脱氢酶。
12.一种生产L-赖氨酸的方法，包括在适当的培养基中培养根据权利要求2～11中任一项的杆状菌，在其培养物中积累和生产L-赖氨酸以及从培养物中收集L-赖氨酸的方法。
全文摘要
通过整合编码天冬氨酸激酶的基因进入具有泄漏型高丝氨酸脱氢酶的杆状菌染色体DNA或高丝氨酸脱氢酶基因缺陷的杆状菌染色体DNA而提供一种具高L-赖氨酸产率的杆状菌，该天冬氨酸激酶源于杆状菌，其L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制被钝化。
文档编号C12N9/02GK1147273SQ9519286
公开日1997年4月9日 申请日期1995年2月23日 优先权日1994年3月4日
发明者杉本雅一, 臼田佳弘, 铃木智子, 田中朗子, 松井裕 申请人:味之素株式会社