核苷酸同质实时试验的制作方法

专利名称：核苷酸同质实时试验的制作方法
背景技术：
分子生物学全领域的最新进展使得检测具有临床和商业重要性的特定基因成为可能。利用核酸杂交试验作为研究工具，检测和鉴定完整的DNA、DNA混合物或DNA片段混合物中的一段独特的脱氧核糖核酸(DNA)序列，使得在基因水平上诊断人类疾病成为可能。
检测特定基因序列最常用技术依据的是杂交试验。用可检测标记(典型的是放射性标记(同位素)或化学修饰(非同位素))标记特定的核苷酸序列或探针。将可检测标记与所研究的核酸样品结合，所述样品可以是原位完整细胞的一部分，也可以是已分离的DNA或RNA片段。杂交条件应该是这样的允许探针与其互补的靶DNA或RNA形成特定的杂交体，但不结合非互补DNA或RNA分子。目标样品序列可以游离在溶液中，也可以固定在固相基质上。探针的可测标记为确定杂交是否发生提供了手段，也即可以检测到靶DNA或RNM。
核酸杂交试验系统中所用的检测方法能够区别和靶核酸序列杂交的探针与非杂交探针。应用最早且最广泛的方法叫做Southern印迹滤膜杂交试验。该试验通过分离靶核酸并将其固定到固相膜载体(尼龙、硝酸纤维素等)而进行。将与膜结合的靶核酸置于变性条件下(加热或碱处理)，然后用含有标记探针的溶液处理，在一定条件下使标记探针与其互补靶序列杂交，所述条件加强了标记探针与其互补靶序列结合的特异性。然后洗去未杂交的标记探针，用对标记类型具有特异性的方法检测杂交的标记探针，即用同位素标记的探针检测要使用X光膜片和放射性自显影方法。
用非同位素或化学物质(例如高能转移荧光团)标记的探针及其用途和在免疫荧光试验中的检测方法可参见美国专利Nos.3,996,345；3,996,943；4,160,016；4,174,384和4,199,559，本文全面引用和参考了其中内容。上述专利适合于样品经激发而发出荧光和使用化学物质(猝灭剂)吸收部分光能的试验。
欧洲专利出版物No.70,685说明了非辐射能转移探针在同质(homogeneous)核酸诊断试验中的设计、检测和应用。该技术使用了两条与靶DNA毗邻序列杂交的探针。在探针的3’端和5’端连接化学发光部分和吸收剂/发射体部分，因而，当探针杂交时，这些部分靠得足够近而能够发生非辐射能转移。靶DNA的存在令探针杂交并发射出专门针对吸收剂/发射体部分波长的辐射。
自动化核酸寡核苷酸(核糖核酸或脱氧核糖核酸)合成，和DNA扩增的聚合酶链反应(PCR)法的最新进展提高了核酸杂交试验的强度和灵敏度。Alvarado-Urbina等在《科学》(Science,214:270,1981)中充分说明了自动化化学核酸合成仪合成短基因片段(DNA和RNA)的应用。自动化合成仪提高了将特殊部分掺入短基因片段的效率，所述的特殊部分在探针上起着可检测标记和猝灭剂的作用，用于从活生物体或病毒颗粒中检测和分离所需的天然基因。短基因片段还可以在PCR和逆转录(RT)试验中用作引物，从而能扩增或拷贝天然基因携带的遗传信息。
DNA片段的PCR扩增方法可参见Mullis和Faloona,Methods in Enzymol.Vol.155,pg.335(1987)。PCR技术上的改进可参见美国专利Nos:4,683,202；4,683,195和4,800,159，本文全面引用和参考了其中内容。PCR是一种酶法合成特定DNA序列的体外方法，它利用两条脱氧核苷酸引物，所述引物与相对链杂交并向两侧延伸需要扩增的特定靶DNA区。使用自动热循环仪可以进行一系列重复的反应步骤，其中包括模板变性、引物退火和依赖于DNA聚合酶的退火引物的延伸，最终造成特定DNA靶区的指数性累积，所述靶区域的末端由引物的5’端界定。Saiki等在《科学》(Science,230:1350,1985)中对选择性富集某特定DNA序列的靶区段达109倍作了说明。
逆转录是分子生物技术中的常用技术，为了制备cDNA文库用于以特定的RNA序列体外合成单链互补DNA(cDNA)，或者用于合成以后扩增反应(即PCR)中所用的第一条cDNA链。用逆转录合成cDNA可参见Maniatis等，《分子克隆实验室手册》Molecular Cloning,A Laboratory Mannal,pg.811(1989)。逆转录酶是一种蛋白质，它延伸与单链RNA的特定互补序列退火结合的脱氧寡核苷酸引物的3’末端。对逆转录酶的修饰可合成更长的cDNA并提高产量，可参见美国专利5,244,797，本文全面引用并参考了其中的内容。
单用PCR技术和将其与RT反应联用就扩增核酸序列而言是极其有效的方法，但是对扩增物质的检测可能需要对PCR产物进行附加操作和后续处理，以确定靶DNA区段是否存在。例如，去除没与靶序列接触的标记探针使得典型的杂交试验大大复杂化。更有用的探针技术应当尽可能减少目前为检测扩增物质所需的附加处理步骤。理想的是，这样的技术将扩增反应与检测步骤合并在同一同质系统中，因此在信号检测前不再需要扩增后分离与靶接触探针和未与靶接触探针。这样的同质系统允许对信号重复检测，由此允许进行扩增过程的动力学分析。
动力学分析提供的优点明显超出单次终点分析。例如，通过揭露假阳性或其它定量错误对信号发展过程的定性评价可以大大提高扩增系统的精确性。但是，因为探针可能干扰扩增作用，同质探针系统的设计因此而受到制约。例如在PCR中，聚合酶的持续合成能力绝不应被存在的下游探针所阻断。
本文全面引用并参考的美国专利5,210,015和5,487,972说明了这样的核酸检测方法，它依赖于核酸聚合酶的5’至3’核酸酶活性来切割退火的标记DNA探针，由此释放出可供检测的标记寡核苷酸片段。Livak等在PCR Methods andApplications,4:357(1995)中说明了对该技术的改进，即在寡核苷酸探针的5’和3’端连接一报道荧光染料和一猝灭荧光染料。当聚合酶沿靶DNA序列向3’端方向移动时，其5’端核酸酶活性先置换然后切下寡核苷酸探针，将报道剂与猝灭剂分离。这样，通过检测报道染料的荧光就可以测定靶DNA序列的存在。
上述试验都依赖于聚合酶的5’核酸酶活性，这对可用探针的设计造成了极大的制约。例如，标记必须与DNA连接，而且探针必须设计成能够从5’端被切下。然而，因为要求同一酶同时行使其聚合酶和核酸酶活性，所以不可能对两种过程独立地进行选择和优化。
现有的可替代以PCR为基础的试验方法依靠靶序列产生信号的放大，而不是直接扩增靶序列。这些方法需要一些重要的处理步骤，而且针对终点分析，与对靶序列存在的动力学实时(real time)检测正相反。
例如，本文全面引用并参考的美国专利4,876,187和5,011,769,Duck等，BioTechniques,9:142(1990)和Bekkaoui等，BioTechniques,20:240(1996)公开了一种循环探针法，它使用含RNA，最好是含DNA:RNA:DNA嵌合体的探针。该反应在能令嵌合探针与靶DNA退火结合的温度下等温进行。使用诸如RNase H等酶来消化探针的RNA部分，产生在反应温度下解离的较短的标记寡核苷酸。然后，将得到的靶DNA序列与另一探针杂交，在多轮循环后，就可生成足够多的标记以供收集和检测。总之，这些方法依赖于标记物某部分的固定化，以便进行相分离和信号的回收与检测。Bekkaoui等报道了该技术的改进，涉及形成RNase-链霉亲和素融合酶及其与生物素酰化探针的联用。链霉亲和素与生物素的结合将融合酶带至探针附近，由此提高其RNase活性。但是，一旦所连的探针被切除，酶即失去功能，防碍其参与其后的循环。
上述信号放大法并不产生实时信号，因为在释放出检测所需的足量标记之前需要多轮循环。而且，该技术是设计用来替代常规靶扩增法的，而且要求等温条件。但是，这些方法依赖于相分离来检测标记，所以并不针对同质系统。而且，探针设计的选择受到局限，因为聚合酶的核酸酶活性会攻击嵌合探针的DNA部分，而产生假信号。
所以，目前仍然需要能够采用更多样化的探针设计，对核酸扩增进行实时同质检测的方法。发明概述本发明包括检测样品中靶DNA序列的方法，它包括a)令标记探针与具有与探针互补区域的靶单链DNA序列接触并退火；b)用能够水解双链RNA:DNA双螺旋体中的核糖核苷酸的核糖核酸酶进行切割，释放标记的探针片段；c)对释放出的标记片段测序，以对靶DNA序列进行动力学特性分析。该试验同质地在单一反应混合系中进行。
较好的是，将该试验与靶DNA序列的扩增(例如用PCR)联用。在这类实施方案中，所述方法包括a)提供所含序列与靶DNA序列中某些区段互补的引物，引物各自能够引发一条互补寡核苷酸的合成，使得引发所得的互补寡核苷酸能够作为模板，以合成由另一引物引发的互补寡核苷酸；b)提供所含序列与靶DNA序列某部分互补的标记探针；c)通过如下循环步骤用聚合酶链反应扩增靶DNA序列，所述步骤为ⅰ)令标记探针与靶DNA序列接触并退火，ⅱ)退火第一和/或第二引物，ⅲ)用核糖核酸酶切割退火探针中的RNA，释放出标记的核糖寡核苷酸片段，ⅳ)用聚合反应试剂延伸引物，和ⅴ)令已延伸的引物和靶DNA序列变性；和d)对释放出的标记片段测序，以便对靶DNA序列的扩增进行动力学特性分析。
在另一较好的实施方案中，所述方法包括使用一端具有报道荧光染料而另一端具有猝灭荧光染料的标记探针，而检测标记核糖寡核苷酸片段释放的步骤包括测定报道剂荧光度。在退火探针被切除之前猝灭剂抑制报道剂的荧光，使得能够区分开与靶接触的探针和不与靶接触的探针。
本发明方法能够在一同质的实时系统中检测靶DNA序列。当与靶DNA扩增反应联用时，该方法提供了不依赖于聚合酶活性的探针释放，并为探针的设计提供了极大的灵活性。而且，与现有的终点试验不同，本发明的动力学检测方法允许进行实时分析。附图简要说明

图1代表了本发明实施方案之一中随靶DNA扩增观察到的报道剂荧光的增加。本发明的详细说明定义术语“样品”或“标本”指自个体或任何含核酸物体分离的核酸，其来源包括但不限于皮肤、血浆、血清、髓液、淋巴液、滑囊液、尿液、眼泪、血细胞、器官、肿瘤、体外细胞培养物、细菌和病毒。
本文用的名词，“核酸”、“聚核苷酸”和“寡核苷酸”指引物、探针、待测寡聚片段、寡聚对照和非标记的阻断性寡聚物，而且广义的应包括聚脱氧核糖核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)，聚核糖核苷酸(含D-核糖)，以及嵌合的聚核苷酸(含2-脱氧-D核糖和D-核糖核苷酸)，和任何其它类型的聚核苷酸，即那些嘌呤或嘧啶碱基、或修饰过的嘌呤或嘧啶碱基的N糖苷。“核酸”、“聚核苷酸”和“寡核苷酸”之间不存在对长度差异的考虑，这些词是混用的。所以，这些术语包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA。寡核苷酸由至少8个核苷酸的序列构成，以至少10至12个为宜，至少15至20个则更好，这些核苷酸与指定核苷酸序某列区域相邻接。“邻接”(coterminous)指与确定的序列相同或互补。
寡核苷酸不限于现有或天然序列通过物理方法衍生分离得到，也可以用各种方法产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或以上方法的联用。“寡核苷酸”或“核酸”指来源为基因组DNA或RNA、cDNA、半合成或合成的聚核苷酸，由于衍生或处理，它们(1)全部或部分地不属于天然情况下与之相关的聚核苷酸；和/或(2)与天然与之连接的聚核苷酸以外的聚核苷酸连接；和(3)非天然的(即自然中不存在的)。
寡核苷酸是由核苷酸单体反应构成的，使得寡核苷酸呈以下方式即一个单核苷酸戊糖环的5’磷酸通过一磷酸二酯键以同一方向与相邻单核苷酸戊糖环的3’氧连接，如果5’磷酸没有连接另一单核苷酸戊糖环的3’氧，则称寡核苷酸的这一端为“5 ’末端”，相应的，如果3’氧没有连接后一单核苷酸戊糖环的5’磷酸，则称寡核苷酸的这一端为“3’末端”。一段核酸序列，即使它包含在一段更长的寡核苷酸之内，仍可以说具有5’端和3’端。两条不同且不交迭的寡核苷酸退火结合于同一线性互补核酸序列的两个不同区段，使得一条寡核苷酸的3’末端正对另一条的5’末端，则称前者为“上游”寡核苷酸，而后者为“下游”寡核苷酸。总之，“下游”指单链寡核苷酸上位于3’方向的位置，或者在双链寡核苷酸中，则指参照核苷酸链3’方向上的位置。
术语“引物”指一个以上自然分离的(例如经纯化的限制性消化)或合成产生的寡核苷酸。引物必须能够起到合成引发点的作用，即置予反应条件下引发沿一条互补链(DNA或RNA)的合成反应，在所述条件下合成的引物衍生产物与该核酸链互补。这样的反应条件包括存在4种不同的三磷酸脱氧核苷酸和诸如DNA聚合酶或逆转录酶之类的聚合反应诱导剂。反应条件包括在最适温度下使用相容性缓冲液(包括辅因子、或影响pH及离子强度等的成份)。为了在扩增反应中达到最大效率，引物最好是单链的。
互补核酸序列指这样的寡核苷酸，即在将核酸序列排齐时，一个序列的5’端与另一序列的3’段互配。这样的联合称为“反平行”。天然核酸中一般不存在的修饰碱基类似物，可以(经酶反应或合成)加入到以下核酸中，包括但不限于本发明的引物、探针或延伸产物中，而且可以包括(例如)肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。两条核酸链的互补性也许不是完美的；有些稳定双螺旋可以包含错配的碱基对或非配对的碱基，核酸技术领域的熟练技术人员可以通过考虑一些变化来推定其稳定性，所述变化包括寡核苷酸的长度、离子强度、pH和错配碱基对的数量、频度和位置。核酸双螺旋体的稳定性通过熔解或解离温度或“Tm”来测定。特定核酸在特定反应条件下的Tm是半数碱基对解离的温度。
本文所用的术语，“靶序列”或“靶核酸序列”指寡核苷酸中有待扩增、检测或即扩增又检测的一段区域。靶序列位于扩增所用的两引物序列之间，或者是逆转录的单链cDNA产物。靶序列可以无然地衍生于样品或标本，或者是合成生产的。
本文，“探针”包括这样一段核糖寡核苷酸，由于该核糖寡核苷酸的至少一段序列与靶区域内的一段序列互补，其与靶核酸序中的一段序列形成双螺旋结构。探针不宜含有与引发聚合酶链反应(PCR)或逆转录(RT)反应所用序列互补的序列。探针可以是嵌合的，即，部分地由DNA构成。当使用嵌合探针时，由DNA部分构成的探针3’端一般是被封闭的，以防探针掺入引物衍生产物中。在最后一个脱氧核糖核苷酸碱基的3’羟基上添加生物素、荧光素、罗丹明甚至一个磷酸基团之类的化学部分即可以起到3’末端封闭基团的作用，在特定情况下还可以起到可测标记或猝灭剂的作用。而且，探针可以掺有修饰过的碱基或修饰过的键，从而更大程度地控制杂交、聚合或水解。
术语“标记”指可用来提供可检测(以可定量为佳)实时信号的任何原子或分子。可检测标记可以与核酸探针或蛋白质连接。标记通过以下途径提供可被测到的信号荧光、磷光、化学发光、放射性、比色(ELISA)、X光衍射或吸光度、磁性、酶活性，或者以上的组合。
术语“吸收剂/发射剂部分”指这样的化合物，它能够吸收一定波长的光能同时发射另一波长的光能。这包括磷光性和荧光性部分。选择吸收剂/发射剂对的要求是(1)它们应当易于使得探针具有功能并与之偶联；(2)吸收剂/发射剂对绝不能阻碍功能化探针与其互补核酸靶序列的杂交；(3)最后的发射(荧光)应尽可能充分，而且延续足够长的时间以便所述领域技术人员能够测知和衡量；(4)使用相容性猝灭剂应足以消除任何后继发射。
在此应用中，“实时”指对信号产生的动态检测，包括在一段时间内读取大量数据来对信号进行特性分析。例如，实时测定可能包括对可检测产物增加速度的测定。或者，实时检测可能包括对靶序列扩增达可测水平之前所需时间的测定。
术语“化学发光剂和生物发光剂”包括参与发光反应的部分。化学发光部分(催化剂)包括过氧化物酶、细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶、功能化离子-卟啉衍生物，及其它。
本文，“核酸酶活性”指模板特异性核糖核酸酶，即RNase H的活性。本文术语“RNase H”指这样一种酶，它特异性地降解DNA/RNA杂交体的RNA部分。该酶不切割单链或双链的DNA或RNA，而且，在典型的PCR所用温度下可以获得保留活性的热稳定性杂交体。总之，当探针与靶DNA序列退火后，该酶即发挥其核酸酶活性，凭此去除所形成的RNA-DNA双体中的核糖核苷酸或切除核糖寡核苷酸。
本文术语，“热稳定的核酸聚合酶”指这样一种酶，它与大肠杆菌的核苷酸聚合酶相比，对热相对稳定，并催化核苷的聚合反应。总之，该酶将在与靶序列退火的引物的3’端开始合成，并向5’端的方向沿模板进行延伸。
“杂交或反应条件”指允许标记探针与其互补的靶核酸序列选择性杂交的试验缓冲液条件。这些条件是这样的，探针与靶核酸序列的特异性杂交反应得到优化，同时不限制PCR试验中靶核酸的扩增。反应条件的优化是对辅因子、离子强度、pH和温度而言。
通用方法除非另有指明，本发明的实施采用了分子生物学、微生物学的标准技术和重组DNA技术，这些都属于本领域的技术范畴。
本发明的各种条件利用了RNase H的特性。RNase H是一种已知的降解RNA-DNA杂交分子中RNA部分的酶。RNA:DNA双螺旋因其特定的二级结构而成为RNase H的底物。所以，RNase H沿RNA:DNA双螺旋的长度发挥活性而无位置限制，所以并不局限于两个末端。RNase H将从双螺旋上切割单核糖核苷酸或小核糖寡核苷酸片段，使之不稳定，以致于它们从较大的互补聚核苷酸(DNA)上脱离。这样，切割作用不依赖于5’末端的特性。这一特性为设计合适的探针提供了更大的灵活性。
在单用和与PCR联用时，本发明利用了RNase H的核糖核酸酶活性。本发明不同于以往所述的PCR扩增反应，以往是对PCR扩增后的靶核酸序列进行检测(例如通过探针在严谨杂交和洗涤条件下与靶序列杂交形成稳定双螺旋体)。与已知的PCR扩增后所用的检测方法不同，本发明允许在靶核酸序列的扩增过程中检测靶核酸序列。本发明中，在PCR开始时，标记探针与PCR引物和RNase H同时加入。所用的反应条件使标记探针与靶核酸序列杂交，这就允许RNase H发挥活性在PCR引物退火和DNA聚合酶延伸作用之前切割和解离标记的探针片段。探针的标记核糖核苷酸片段被水解(切割)和释放而产生信号，提供了在扩增过程中检测靶核酸序列的手段。
本发明的方法也易于适应其它核酸系统。例如，自身持续序列复制(3SR)同质试验和连接酶链反应(LCR)系统都属于本发明范围之内。
在本发明中，探针上连有标记，使得因RNase H核酸酶活性切割下的单核糖核苷酸或小核糖寡核苷酸能够被检测到。可用数种方法来将未切割的标记核糖(-或嵌)合寡核苷酸探针与切割下的标记探针片段区分开来。本发明的这一特征使得能够鉴定出含有与核糖(-或嵌合)寡核苷酸探针互补序列的含核酸样品或标本。
在本发明中，提供怀疑含有特定的所研究的“靶核酸序列”的样品或标本。样品中的靶核酸如果被分离成单链RNA，可以先逆转录(RT)成cDNA，或者可以分离成双链基因组DNA。该cDNA或基因组DNA然后采用本领域技术人员熟知的合适的变性方法(包括物理、化学和酶方法)变性。链分离的物理方法包括加热核酸直至变性完全。典型的热变性涉及使用介于80℃至100℃之间的温度3至10分钟。靶核酸可能以单链形式存在于样品中，例如，单链RNA或DNA病毒，而且，可能只需适度加热以减少二级结构折叠的恢复。
变性核酸链然后在杂交或反应条件下，与预选的寡核苷酸引物和探针一起孵育，所述条件可令引物和探针与单链核酸结合。对引物的选择使其沿双螺旋序列的相对位置令一个引物产生的延伸产物成为另一引物延伸的模板，由此，当延伸产物在随后的变性条件下与其(互补)模板分离时得到长度确定的复制链。
因为合成的互补核酸链比探针或引物都长，所以它们具有更多的接触点，因而有更大机会在给定时间内彼此寻找配对。为了防止较长模板的重退火，使用了高摩尔数过量的探针和引物来帮助杂交动力学偏向引物和探针的退火而不是模板的退火。
引物的长度必须足以在反应条件下引发延伸产物的合成。引物的长度和组成取决于诸多因素，包括反应温度、引物的组成、探针退火位点相对引物退火位点的位置、以及引物与探针的浓度比。根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物一般包含15至30个核苷酸，虽然也可以含有更多或更少的核苷酸。引物必须具有足够的互补性，可与其对应链选择性地退火形成稳定的双螺旋。所用的引物要选择与待扩增各具体序列不同链完全互补的。本领域的熟练技术人员可能选用或设计5’端具有非互补序列(例如限制性酶切序列)的引物，但是3’端必须保持其互补性以确保由DNA聚合酶物进行的适当延伸和扩增。
在实施本发明时，标记探针必须先于引物退火之前与其互补的靶核酸链退火。RNase H的活性必须超过DNA聚合酶的活性，从而使得切割的探针片段从靶核酸上解离下来，不至于干扰引物延伸和核酸靶区域的扩增。
为了确保标记探针在引物延伸聚合反应到达该双螺旋区域之前与其互补的核酸退火，可以使用多种方法。与过去仅限于DNA寡核苷酸探针的原有技术相对比，本发明在这一特性上作了明显优化。已知，RNA:DNA杂交体比碱基组成相同的DNA:DNA或嵌合DNA杂交体具有更高的熔点，这就使得它们可具有更高的特异性。还已知，互补核酸的长度也影响着杂交速度和双螺旋的相对稳定性。核酸分子越短，与靶核酸形成足够稳定的杂交复合物通常需要的温度越低。所以，可将探针设计得比引物长，这样，在高于引物退火温度的温度下，标记探针优先与靶序列退火。而且，与DNA:DNA杂交体相比，加入甲酰胺之类变性溶液可以优化RNA:DNA杂交体的结合温度。
也可以改变引物和探针的碱基组成来影响热稳定性。例如，可以选用核苷组成上G/C含量较高的探针，结果，其热稳定性强于引物。本领域技术人员由此可以用热循环参数来利用标记探针和引物的不同热稳定性。在热循环中的变性步骤之后，可以使用一中间温度允许探针退火和RNase H的切割，但是不允许引物的结合，然后降低温度允许引物退火和DNA聚合酶的延伸反应。
在某些实施方案中，可能需要提供与不同靶序列互补的第二探针。这样的探针应具有产生独自可测信号的标记。根据以上技术，可以将探针设计成具有不同但相容的熔点。
为了确保标记寡核苷酸先于引物结合，还可以使用比引物摩尔浓度高而且过量的标记核糖-或嵌合寡核苷酸探针。所述的探针浓度约高于相应的引物浓度5至25倍，一般为0.5-5×177M。
寡核苷酸引物和标记探针可利用多种方法制得。制备特定序列的寡核苷酸(脱氧的、核糖的和嵌合的)的方法是本领域众所周知的，包括例如，克隆和序列适当的限制性酶切、定向自动化化学合成法和酶法。这些技术包括例如磷酸三酯法、磷酸二酯法、氨基磷酸二乙酯法和固相载体法。
可设计探针的组成来抑制核酸酶活性。化学合成时在标记探针中掺入修饰的磷酸二酯键(即硫代磷酸甲酯或磷酸甲酯)可用来防止在选定位点的切割。根据探针的长度、其5’互补区的组成和标记的位置，可以设计出用于实施本发明的优先产生或短或长的标记探针片段的探针。只要获得4至6碱基对的RNA:DNA序列作为RNase H的底物，本发明在探针修饰上就可能具有极大的灵活性。
如下所述，通过掺入可被比色、光化学、生物化学、免疫化学、酶法和化学方法测得的部分对探针作标记。当然，将标记与探针连接或交联的方法取决于所用标记的种类和在探针上的标记位置，但是总的说来，包括本领域已知的各种合适的连接方法。而且，可以考虑将标记与特定核苷酸连接，即使这样的连接可能包括一个或多个插入核苷酸。
许多适用于本发明的可检测标记及其掺入探针的方法是本领域众所周知的，包括但不限于，酶(例如碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶)和酶的底物、放射性原子、荧光染料、生色团、化学发光或生物发光标记、电化学发光标记、标记的受体与配体结合物、标记的抗体与抗原偶合物，或者能够相互反应以加强、改变或消除某实时可测信号的任何其它标记。如果用热循环仪进行PCR，则标记必须能够承受此自动化过程中所需的循环温度。
较好的是，可以在同一探针上使用两种相互作用的标记，但是需保持它们在探针上具有合适的间隔以允许在RNase H切割过程中两标记可被分离。有时，可能需要使用具有两个不同标记的单个探针。
在较好的实施方案中，相互反应性标记包括报道剂(例如荧光素)和猝灭剂(例如罗丹明)荧光染料对。各染料分别与探针连接，彼此间隔至少4至6碱基以为RNase H提供充分的底物。在单链状态下，探针具有足够的柔韧性使罗丹明以足够的频度接近荧光素以猝灭报道剂。但是，当探针与靶核酸序列退火并被RNase H消化后，荧光素与罗丹明分离，从而提高了可检测报道剂的荧光。可以用合适的方法来测定荧光，包括Taq-Man LS-50B系统(Perkin-Elmer)。
为了在杂交和释放前尽可能强地猝灭，可以对探针进行多种修饰。例如，报道剂和猝灭剂可以隔开大约10个核苷酸或略少，这样，不依赖于单链探针的柔性也可以发生猝灭。总之，为了优化检测特性，染料可以接在末端也可以接在中间。或者，可以将探针设计成具有(例如)发卡状的二级结构，从而在脱离杂交时使报道剂与猝灭剂靠近。在此实施方案中，使用核糖寡核苷酸可能具有很大的优点。RNA所成的二级结构天然地比DNA或嵌合寡核苷酸稳定。所以，可设计出在杂交前以很高的效率猝灭报道剂荧光的探针，从而使试验系统的背景噪音很低。此外，该技术不可能使用常规的同质试验系统，因为DNA:DNA发卡可能是核酸酶的底物，因而造成错误的标记释放。
同样，利用荧光极化作用，可以实现检测切割下的标记探针的实施方案。根据分子翻滚，该技术能够区别大的和小的分子。大分子(例如完整的标记探针)在溶液中比小分子翻滚慢得多。将荧光部分与所研究的分子连接，可根据分子翻转来检测(和区分)该荧光部分，这样就可以区分出完整的和被消化的探针。可以用ABI Prism7700序列检测仪(Perkin-Elmer)在PCR进行时来衡量此检测作用。
在另一实施方案中使用了两个标记的核糖-或嵌合寡核苷酸探针，它们各自与某双链靶区段的分开的区域互补，但彼此并不互补。例如，两个探针可能使得一个标记产生的信号强度加倍，并进一步起到降低PCR扩增中经常发生的产物链重退火的作用。
在另一实施方案中，可能宜用(例如)32P的放射性原子来标记和检测。将32P引入核酸的酶学方法是本领域众所周知的，包括例如用聚核苷酸激酶标记5’末端，或者用切口翻译和Klenow片段进行随机插入。位于3’末端的标记可采用聚核苷酸末端转移酶来加上所需的部分，例如3-脱氧腺苷35S-ATP和生物素酰化的dUTP。标记可用各种技术与核糖-或嵌合寡核苷酸探针直接或间接连接。根据所用标记的确切种类，标记可以位于探针的5’或3’端，也可以位于探针的核酸序列的中间，或者与各种大小和组成的碳链空间臂连接，以利于信号的反应。使用商品化的氨基磷酸酯(phosphoramidite)试剂，可以通过受适当保护的氨基磷酸酯生成两个末端之一含有功能基团(例如硫醇或伯胺)的寡聚物。可以利用它们对第二底物的活性来检测酶。
美国专利4,914,210说明了引入寡核苷酸功能化试剂将一个或多个巯基、氨基或羟基部分引入寡核苷酸探针序列(通常是5’末端)的方法。可以利用聚核苷酸激酶和γ-32P-ATP引入一个5’磷酸基团作为放射性同位素，提供报道基团。通过合成过程中引入氨基胸腺嘧啶残基与生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，可在5’端加上生物素。
寡核苷酸(DNA和RNA)衍生物也是可用标记。例如，桥亚乙基-dA和桥亚乙基-A已知是荧光腺苷酸，它可以被掺入核糖-或嵌合寡核苷酸探针中。同样，桥亚乙基-dC是可以用于探针合成的另一类似物。含有这种核苷酸衍生物的探针可以在PCR过程中释放出强得多的荧光单核苷酸。
寡核苷酸引物依赖于模板的延伸，在足量的4种三磷酸脱氧核糖核苷(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)或上述的类似物存在下，在由合适的盐、金属离子和pH缓冲液组成的反应介质中，受聚合剂的催化。合适的聚合剂是已知催化引物和模板依赖性DNA合成并具有5’向3’核酸酶活性的酶。已知的DNA聚合酶包括大肠杆菌DNA聚合酶I，嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶，嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶，滨水热球菌(Thermococcus littoralis)DNA聚合酶和栖热水生菌(Tag)DNA聚合酶。用这些DNA聚合酶催化DNA合成的反应条件是本领域众所周知的。为了适用于本发明，RNase H必须高效切割核糖-或嵌合寡核苷酸探针并释放出标记片段，由此直接或间接产生信号。
合成产物是由模板链和引物延伸链构成的双螺旋分子，其中包括靶序列。该合成反应的副产物是由单体、二体或较大核苷酸片段混合物构成的受标记寡核苷酸片段。重复多轮变性、标记探针和引物的退火，和引物延伸以及标记探针的切割，导致由引物界定的靶区段的指数积累，和标记片段的指数生成。进行足够次数的循环以获取可测种类的标记，它们通常比背景信号强几个数量级。
在较好的方法中，PCR采用热稳定酶以自动化方式进行。在该过程中，反应混合物通过变性步骤、探针和引物退火步骤和合成步骤进行循环，切割和置换由此与引物依赖性模板延伸反应同时发生。可以使用为使用热稳定性酶而特别设计的DNA热循环仪，例如购自Perkin-Elmer/ABI Instruments的设备。
在此自动化过程中以温度稳定性聚合酶为佳，因为，在PCR循环中，令双链延伸产物变性的较好方法是令它们经受高温(约95℃)。例如，美国专利4,889,818揭示了一种自栖热水生菌分离的代表性热稳定酶。其它代表性热稳定酶包括，例如从Thermus flavus,Thermus ruber，嗜热栖热菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(其最适温度略低于所列的其它种类)，Thermus lacteus,Thermus rubens,Thermatoga maritima，滨水嗜热球菌和Methanothermus fervidus提取的聚合酶。
可用多种方法来完成对标记寡核苷酸片段的检测和验证，而且可能根据所用标记的来源不同而不同。本发明一个方便的实施方案是对包括切下所标记片段等反应产物进行大小分析。测定标记核酸片段大小的方法是本领域众所周知的，其中包括例如凝胶电泳、重力沉降、凝胶排阻层析和同质层析。
扩增期间或之后，可以通过(例如)令PCR混合物与固相萃取剂(SPE)接触从PCR混合物中分离出标记片段。例如，可以在已标记尚未切割的寡核苷酸被结合而标记片段没结合的条件下，向PCR混合物中加入根据大小、电荷或与寡核苷酸碱基反应而能够结合寡核苷酸的物质。这样的SPE物质包括交换树脂或微珠、例如市售的结合颗粒NensorbTM(DuPont Chemical Co.),NucleogenTM(The NestGroup)和羟基磷灰石。在一具体实施方案中，如果使用包含与5’标记相隔一个核酸酶易切位点的3’生物素标记的双标记探针，作为信号手段，则可将PCR扩增混合物与含有特定结合伴侣(例如亲和素或链霉亲和素，或抗生物素的抗体或单克隆抗体)的物质接触。这样的物质包括包被有特定结合伴侣的微珠或颗粒，还包括磁性颗粒。
在PCR混合物与SPE接触步骤后，可以通过过滤、沉降或磁性引力作用来去除SPE物质，留下不含未切割的标记寡核苷酸的标记片段，可供检测。
可将本发明方法中使用的试剂装诊断试剂盒。诊断试剂盒包括分装在不同容器内的标记寡核苷酸和引物。如果寡核苷酸是非标记的，则试剂盒中还可以包括特定的标记试剂。试剂盒还可以包括扩增所需的其它合适包装的试剂和材料，例如缓冲液、dTNP和/或聚合用物，检测分析所需的试剂和物质，例如酶和固相萃取剂，以及进行试验的说明书。
实施例表1列出了本实施例所用的PCR引物和核糖-寡核苷酸探针的寡核苷酸序列。所选的引物是用来扩增BETA-肌动蛋白基因一个片段的。探针的5’端用6-羧基荧光素(6-FAM)标记，而3’端则用6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)标记。引物和探针是购自Perkin-Elmer的合成商品。
表1．引物和探针的序列SEQ ID NO.1正向引物5’CAC ACT GTC CCC ATC TA3’SEQ ID NO.2反向引物5’GGA ACC GCT CAT TG3’SEQ ID NO.3探针序列5’AUG CCC CCC CCA UGC CAU CCU GCG U3’用GeneAmp PCR系统(Perkin-Elmer)进行PCR扩增，使用50μl反应液，其中包含1X Bicine缓冲液(Perkin-Elmer)、2.5mM Mn(OAc)2、200μMdNTP(Perkin-Elmer)、0-16单位的热稳定性RNase H(Epicentre Technologies)、1.25单位ΔTth DNA聚合酶(Clonetech)、人雄性DNA(Perkin-Elmer)、400nM的各引物和50nM标记探针。热循环方案为95℃2分钟，然后40轮的60℃20秒、45℃1分钟和95℃15秒。用Taq-Man LS-50B系统(Perkin-Elmer)测定FAM荧光。
图1显示PCR循环过程中实时测得的FAM荧光。曲线1代表没有向反应中加RNase H因而没有标记释放时获得的基线荧光。曲线2至5代表向反应中分别加入1、2、4和16单位RNase H。BETA-肌动蛋白基因片段的扩增通过荧光的实时增加反映出来，直接取决于用于切割探针和释放标记的RNase H用量。
根据以上优先实施方案对本发明进行了具体的说明。但是，显而易见的是，本领域熟练技术人员可以在本发明的范围内进行某些改变和修饰。(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度14(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:
GGA ACC GCT CAT TG 14(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度26(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型RNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:
AUG CCC CCC CCA YGC CAU CCU GCGTU 26(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度14(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:
GGA ACC GCT CAT TG 14(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度26(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型RNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:AUG CCC CCC CCA YGC CAU CCU GCGT U2权利要求
1．一种检测样品中靶DNA的方法，它包括以下步骤a)将探针与样品接触并退火，所述探针包含与第一标记连接的核糖寡核苷酸，所述样品含有靶单链DNA序列，所述序列具有与探针互补的区段；b)用核糖核酸酶切割退火探针的至少一条核糖核苷酸，释放出已标记的核糖寡核苷酸片段，所述核糖核酸酶能够水解双链RNA:DNA双螺旋中的核糖寡核苷酸；和c)连续测定标记片段的释放，从而对靶DNA序列进行动力学特性分析；所述的步骤a)至c)在单一反应混合系中进行。
2．根据权利要求1所述的方法，其中提供探针的步骤包括提供嵌合寡核苷酸。
3．根据权利要求2所述的方法，其中提供探针的步骤包括提供RNA:DNA:RNA寡核苷酸。
4．根据权利要求1所述的方法，它还包括与第二标记连接的核糖寡核苷酸，其中所述的第一和第二标记含有可相互反应的信号产生部分，从而使得标记的连接造成第二标记抑制对第一标记的检测。
5．根据权利要求4所述的方法，其中的第一标记包含报道剂荧光染料，而第二标记包括猝灭荧光染料，其中测定标记核糖寡核苷酸片段释放的步骤包括检测报道剂荧光。
6．根据权利要求5所述的方法，其中的报道剂和猝灭剂相隔至少约10个核苷酸。
7．根据权利要求5所述的方法，其中探针具有二级结构，该结构在探针与靶DNA序列退火前使报道剂和猝灭剂靠得很近。
8．一种检测靶DNA序列的方法，所述序列包含与第二链互补的第一链，而且该链正经历扩增反应，所述方法包括以下步骤a)提供第一引物和第二引物，所述第一引物具有与靶DNA序列第一链中某区段互补的序列，并能够引发互补寡核苷酸的合成，所述的第二引物含有与靶DNA序列第二链中某区段互补的序列，并能够引发互补寡核苷酸的合成，从而使得由第一引物引发合成的互补寡核苷酸能够作为由第二引物引发合成互补寡核苷酸的模板；b)提供含有与标记连接的核糖寡核苷酸的第一探针，其中的核糖寡核苷酸具有与靶DNA序列一部分互补的序列，所述部分位于第一和第二引物的下游；c)在温度循环步骤许可的条件下采用聚合剂扩增靶DNA序列(ⅰ)将标记探针与靶DNA序列接触并退火，(ⅱ)将第一和第二引物退火，(ⅲ)用模板依赖性核糖核酸酶切下退火探针的RNA，释放出标记核糖寡核苷酸片段，(ⅳ)用聚合剂延伸引物，和(ⅴ)将延伸引物和靶DNA序列变性；和d)连续测定标记片段的释放，对靶DNA序列的扩增进行动力学特性分析。其中步骤c)和d)在单一反应混合系中进行。
9．根据权利要求8所述的方法，其中靶DNA序列的扩增包括聚合酶链反应。
10．根据权利要求9所述的方法，其中的连续测定步骤包括在连续的聚合酶链反应循环期间检测标记片段的释放。
11．根据权利要求8所述的方法，它还包括与第二标记连接的核糖寡核苷酸，其中的第一标记包含报道荧光染料而第二标记包含猝灭荧光染料，从而使得标记的连接造成第二标记抑制对第一标记的检测。
12．根据权利要求11所述的方法，其中连续测定步骤包括检测报道荧光。
13．根据权利要求8所述的方法，其中将探针与靶DNA序列退火的步骤包括降低温度，而将延伸片段与靶DNA序列退火的步骤则包括升高温度。
14．根据权利要求8所述的方法，它还包括提供第二探针的步骤，所述第二探针能够释放出可被单独测得的标记片段。
15．一种检测靶DNA序列的方法，所述序列包含与第二链互补的第一链，而且该链正经历扩增反应，所述方法包括以下步骤a)提供引物，该引物含有与靶DNA序列第一链中某区段互补的序列并能够引发互补寡核苷酸的合成；b)提供含有与标记连接的核糖寡核苷酸的第一探针，其中的核糖寡核苷酸具有与靶DNA序列一部分互补的序列，所述部分位于第一和第二引物的下游；c)在温度循环步骤许可的条件下采用聚合剂扩增靶DNA序列(ⅰ)将经标记的探针与靶DNA序列接触并退火，(ⅱ)将引物退火，(ⅲ)用模板依赖性核糖核酸酶切下退火探针的RNA，释放出标记核糖寡核苷酸片段，(ⅳ)用聚合剂延伸引物，和(ⅴ)将延伸引物和靶DNA序列变性；和d)连续测定标记片段的释放，对靶DNA序列的扩增进行动力学特性分析。其中步骤c)和d)在单一反应混合系中进行。
全文摘要
一种对靶核酸进行实时同质性试验的方法,它包括将一条已标记的核糖寡核苷酸探针与目标DNA序列退火,并用RNAseH降解探针的一部分以释放出标记片段。然后通过对被释放片段的测定来对目标序列的存在进行动力学特性分析。较好的是,将该试验与聚合酶链反应相结合,从而可以实时检测靶序列的扩增。
文档编号C12Q1/68GK1236395SQ97197568
公开日1999年11月24日 申请日期1997年7月24日 优先权日1996年7月26日
发明者D·J·凯斯勒, D·E·哈格罗夫斯 申请人:爱德华·E·维因格