一种利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物饲料加工技术领域，特别涉及一种利用碱性蛋白酶/角蛋白酶 制备羽毛蛋白粉的方法。
【背景技术】
[0002] 羽毛是我国重要的资源之一，产量非常丰富，年产量百万吨以上，是由一种双键结 构十分牢固的角蛋白构成，化学成分与一般蛋白质一样，但分子形状与纤维相似，结构紧密 坚实，密度大，其本身难以被动物消化吸收，需经过物理或化学方法加工处理后，变为动物 可消化吸收的蛋白质。
[0003] 采用气爆酶解方法制备羽毛蛋白粉，该方法工序复杂，存在安全隐患，另一方面对 羽毛粉中的氨基酸的破坏大，制备出的羽毛蛋白粉中的粗蛋白含量达到90%，且只能用作饲 料蛋白。本专利申请人在申请号为2014104846137的专利中公开了一种羽毛蛋白粉的制 备方法，利用角蛋白酶/中性蛋白酶对羽毛进行复合酶解，其最实用的温度为40度，对实 际生产来说能耗偏高；由于角蛋白酶的PH作用范围为7~10,中性蛋白酶的pH作用范围 为5. 5~8. 5,两种酶复合后研宄发现最适作用pH为8。两者重叠的作用区域较小，生产中 会投入过多的费用用于调节PH，且最适应的酶的添加量为角蛋白酶0. 0375/中性蛋白酶 0. 125g，用量较高，这些都会增加生产者的生产成本，降低经济效益。除此以外，由于不同 的蛋白酶的酶解作用位点有差异，采用角蛋白酶/中性蛋白酶对羽毛进行复合酶解释，并 未在酶解液中检测到氨基酸，大大降低了其应用范围。
【发明内容】
[0004] 本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种工艺简单、生产成本低、酶解率高的 利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法。
[0005] 本发明是通过如下技术方案实现的： 一种利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法，其特征在于：以家禽羽毛为 原料，采用以下步骤： (1) 羽毛粉的制备：将家禽羽毛经清洗、除杂、剪碎、晾干装入烧杯，置入高压蒸汽灭菌 锅内120°C灭菌40min，然后经处理、沥干，于恒温干燥箱中80°C干燥12h，最后经粉碎、研 磨、过100目筛后得到羽毛粉，干燥保存待用； (2) 酶解：将羽毛粉置于容器中，Ig羽毛粉加入100mL蒸馏水、角蛋白酶 0? 015-0. 0525g/碱性蛋白酶0? 0075-0. 02652g，其中酶解液的pH为4-12,酶解温度 25-50°C，酶解时间4-36h，置于恒温摇床中进行酶解； (3) 过滤烘干：将酶解反应液过滤，测定过滤液可溶性蛋白及氨基酸含量，滤过残渣经 烘干后称量待用。
[0006] 步骤（1)中所述的家禽羽毛为鸡羽毛或鸭羽毛。
[0007] 优选的，步骤（2)所述的酶解过程，每Ig羽毛粉的酶添加量为角蛋白，0. 0375g/碱 性蛋白酶〇.〇15g，酶解温度为35°C，酶解液pH为12,酶解时间36h。
[0008] 优选的，步骤（3)中所述的可溶性蛋白的含量的测定采用考马斯亮蓝法测定，以 牛血清蛋白为标准蛋白，测定波长为595nm，计算可溶性蛋白含量（yg/g)及羽毛分解率 (%)，绘制曲线。
[0009] 进一步的，步骤（3)中测定体外消化率，测定方法为滤出残渣中添加胃蛋白酶和预 制至45°C的酸性水，将其混合物置于45°C恒温摇床中消化16h，将反应液过滤、烘干、称重， 其中，每Ig滤出残渣添加3000单位的胃蛋白酶，酸性水的添加量为100ml。
[0010] 本发明的有益效果是：本发明工艺简单，且拓宽了工艺适用领域，酶解温度低，pH 作用范围广，酶解成本低，酶解效率高，且酶解上清液可溶性蛋白含量较高，同时含有11种 含量较高的氨基酸成分，其中苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸为人体必需氨基酸，可以 加工为氨基酸产品和饲料添加蛋白，降低了生产成本，提高了综合经济效益。
【附图说明】
[0011] 下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0012] 附图1为本发明的蛋白质含量标准曲线图； 附图2为本发明的酶解温度试验曲线图； 附图3为本发明的酶解液初始pH试验曲线图； 附图4为本发明的复酶添加量试验曲线图； 附图5为本发明的酶解时间试验曲线图。
【具体实施方式】
[0013] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
[0014] 实施例： 一.材料及方法 材料 鸡及鸭的羽毛(从家禽屠宰厂获得)，角蛋白酶：100000U/g(济南诺能生物工程有限公 司），碱性蛋白酶：200000U/g(济南诺能生物工程有限公司），lmol/LNaOH溶液，lmol/LHCL 溶液，蒸馏水，考马斯亮蓝试剂(称取IOOmg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95 %乙醇中，加入 100mL85%磷酸，加蒸馏水稀释至1000mL。），蛋白质标准溶液(结晶牛血清蛋白，预先经微量 凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成lOOug/mL的蛋白质标准溶液。），胃蛋白 酶(蛋白酶实际效价为1 :3000)。
[0015] 2.主要仪器设备 主要仪器 250mL三角瓶18只，吸量管（IOmL)，试管及试管架，容量瓶（50mL)，研钵，100目标准 筛，滴管，漏斗，滤纸，量筒，移液器（100-1000yI;5ml)，大小枪头，比色杯，擦镜纸，玻璃 棒，精密pH试纸。
[0016] 主要设备 立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI型）（上海申安医疗器械厂）；恒温培养摇床 (上海智诚分析仪器制造有限公司）;可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司）;恒温干 燥箱；微量电子天平(北京赛多利斯天平有限公司）;Bi〇Chr〇m30+全自动氨基酸分析仪(百 康)。
[0017] 试验方法及内容 羽毛的预处理及羽毛样品的制备 从家禽处理厂获得的羽毛样品一般含有许多的血液泥沙等杂质，所以使用前需要清洗 除杂，否则会影响试验效果和品质。为了酶解反应更均匀需要把羽毛制成粉末。
[0018] 羽毛预处理：羽毛一清洗、除杂一剪碎、晾干一装入烧杯一置入高压蒸汽灭菌锅 (120°C、40min) -处理一沥干一恒温干燥箱（80°C、12h)-粉碎、研磨、过筛（100目）一羽毛 粉一干燥保存待用。
[0019] 复酶(碱性蛋白酶/角蛋白酶）酶解羽毛粉试验 单因子试验确定复酶酶解最佳条件 取18只250ml三角瓶，6个处理组，每组3个重复组，每瓶加100mL蒸馏水和Ig羽毛粉 样品。
[0020] A.酶解温度试验：酶添加量角蛋白酶0. 030g/碱性蛋白酶0. 100g，调节pH为7， 酶解时间24h，酶解温度分别为25、30、35、40、45、50°0，恒温摇床下反应。
[0021] B.酶解液初始pH试验：酶解温度以上次试验为参考，酶添加量角蛋白酶0. 030g/ 碱性蛋白酶〇. 〇15g，酶解时间24h，酶解液pH分别为4、6、7、8、10、12恒温摇床下反应。
[0022] C.酶添加量试验：酶解温度和pH以上次试验为参考，酶添加量分别为角0. 015/ 中 0? 0075g、角 0? 0225/0. 01125g、角 0? 030/ 中 0? 015g、角 0? 0375/ 中 0? 01875g、角 0? 045/ 中0. 0225g、角0. 0525/中0. 02625g，恒温摇床下反应。
[0023] D.酶解时间试验：酶解温度、pH、酶添加量以上次试验为参考，酶解时间分别为4、 6、10、12、24、36h，恒温摇床下反应。
[0024] 每组试验结束后，将酶解反应液过滤，取过滤液测定可溶性蛋白含量，滤过残渣经 烘干后称重待用。
[0025] 可溶性蛋白含量测定 采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，以牛血清蛋白为标准蛋白，测定波长为595nm，计 算可溶性蛋白含量（Ug/g)及羽毛分解率（％)，绘制曲线，如附图1所示。蛋白质含量的计 算方法如下：
【主权项】
1. 一种利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法，其特征在于：以家禽羽毛 为原料，采用以下步骤： (1) 羽毛粉的制备：将家禽羽毛经清洗、除杂、剪碎、晾干装入烧杯，置入高压蒸汽灭菌 锅内120°C灭菌40min，然后经处理、沥干，于恒温干燥箱中80°C干燥12h，最后经粉碎、研 磨、过100目筛后得到羽毛粉，干燥保存待用； (2) 酶解：将羽毛粉置于容器中，Ig羽毛粉加入100mL蒸馏水、角蛋白酶 0? 015-0. 0525g/碱性蛋白酶0? 0075-0. 02652g，其中酶解液的pH为4-12,酶解温度 25-50°C，酶解时间4-36h，置于恒温摇床中进行酶解； (3) 过滤烘干：将酶解反应液过滤，测定过滤液可溶性蛋白及氨基酸含量，滤过残渣经 烘干后称量待用。
2. 根据权利要求1所述的一种利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法，其 特征是：步骤（1)中所述的家禽羽毛为鸡羽毛或鸭羽毛。
3. 根据权利要求1所述的一种利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法，其 特征是：步骤（2)所述的酶解过程，每Ig羽毛粉的酶添加量为角蛋白，0. 0375g/碱性蛋白 酶0. 015g，酶解温度为35°C，酶解液pH为12,酶解时间36h。
4. 根据权利要求1所述的利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法，其特征 是：步骤（3)中所述的可溶性蛋白的含量的测定采用考马斯亮蓝法测定，以牛血清蛋白为 标准蛋白，测定波长为595nm。
5. 根据权利要求1所述的利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法，其特 征是：步骤（3)中测定体外消化率，测定方法为滤出残渣中添加胃蛋白酶和预制至45°C的 酸性水，将其混合物置于45°C恒温摇床中消化16h，将反应液过滤、烘干、称重，其中，每Ig 滤出残渣添加3000单位的胃蛋白酶，酸性水的添加量为100ml。
【专利摘要】本发明涉及动物饲料加工技术领域，特别涉及一种利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法。该利用碱性蛋白酶/角蛋白酶制备羽毛蛋白粉的方法，以家禽羽毛为原料，其特征在于，采用以下步骤：（1）羽毛粉的制备；（2）酶解；（3）过滤烘干。本发明工艺简单，且拓宽了工艺适用领域，酶解温度低，pH作用范围广，酶解成本低，酶解效率高，且酶解上清液可溶性蛋白含量较高，同时含有11种含量较高的氨基酸成分，其中苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸为人体必需氨基酸，可以加工为氨基酸产品和饲料添加蛋白，降低了生产成本，提高了综合经济效益。
【IPC分类】A23J3-34, A23J1-10
【公开号】CN104798981
【申请号】CN201510115874
【发明人】郝鲁江, 许艳蕊, 冯昱畅, 张涛, 卢晓平, 范秋苹
【申请人】齐鲁工业大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年3月17日