专利名称：白地霉发酵牛蒡子超临界萃取法提取挥发油的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于卷烟香料提取技术领域，具体来说是一种将植物药牛蒡子经过白地霉发酵后，采用超临界萃取法从中提取挥发油的方法，及所提取挥发油作为烟用添加剂的应用。
背景技术：
现有技术中，牛蒡子，《中华人民共和国药典(一部)》(2005年版)收录，为菊科 植物牛蒡Arctium lappa L.的干燥成熟果实。秋季果实成熟时采收果序，晒干，打下果实。 全国各地都有分布，始载于《名医别录》，列为中品。牛蒡子又名恶实、鼠粘子、黍粘子、大 力子、蝙蝠刺、毛然然子、黑风子、毛锥子、粘苍子、鼠尖子、弯巴钩子、万把钩、大牛子、牛子； 其蒙药名为希伯-乌布斯，藏药名为西松。性状瘦果长倒卵形，略扁，微弯曲，长5-7mm，宽 2-3mm。表面灰褐色，带紫黑色斑点，有数条纵棱，通常中间1_2条较明显。顶端钝圆，稍宽， 顶面有圆环。中间具点状花柱残迹；基部略窄，着生面较浅。果皮硬，子叶两片乳白色，油质。 无臭，味苦后微辛而稍麻舌。性寒，味辛、苦。归肺、胃经。功能主治疏散风热，宣肺透疹， 解毒利咽。现代药理研究发现牛蒡子有以下几方面的功能抗菌、抗病毒作用；钙拮抗剂样 作用；增强免疫功能及降血糖作用；抗肾病变；抗肿瘤、突变作用；利尿及泻下作用等。现有技术中牛蒡子的研究和应用范围主要在医药行业，如中国专利文献 CN101134031公开了牛蒡子苷元在制备治疗或预防慢性肾功能衰竭及肾纤维化的药物中的 用途，其提取物主要为牛蒡子苷元，用于肾病。中国专利文献CN1560265公开了一种制备抗 病毒与抗肿瘤天然药物牛蒡子苷元的方法；提取物是牛蒡子苷元的纯品，用于抗病毒、抗肿 瘤。中国专利文献CN1569138公开了一种具有降血糖作用的牛蒡子提取物的制备方法，提 取物主要是牛蒡子苷、牛蒡子苷元和罗汉松脂素，用于降血糖。中国专利文献CN1879644公 开了牛蒡子苷在制备抗炎药物方面的用途，提取物为牛蒡子苷，用于消炎。从现有技术中， 我们知道牛蒡子药材中所含有的牛蒡子苷和牛蒡子苷元约为药材总量的5-10%，牛蒡子药 材中尚有大量的其它物质未被应用，如挥发油类、糖类、氨基酸类、生物碱类等物质均未被 有效利用。而牛蒡子在卷烟中的应用还未见相关报道，也未见有制备烟用牛蒡子提取物的 方法的相关报道。牛蒡子的化学成分主要有挥发油类，油脂类，牛蒡苷(Arctiin)、牛蒡苷元 (Arctigenin)、牛蒡酚类，多糖类、氨基酸类，生物碱类，留醇类，维生素类等。牛蒡子中挥发 油含量一般在0. 1 左右。在挥发油成分中，胡薄荷酮含量最高，约占挥发油成分总量 的25 %，其它还包括一些萜烯类、小分子的醛酮类和酚类物质，这些物质具有浓郁的香气， 是卷烟调香中经常使用的增加烟香的物质，因此，利用牛蒡子中的挥发油类物质，用于卷烟 香料，增加卷烟香气是一种可行的技术发展方向，而且，尚未有人在此领域进行大量的工 作。现有技术中，医药行业采用的提取牛蒡子油的最常用方法是水蒸气蒸馏和超临界 二氧化碳萃取。但是，牛蒡子中含有约26 30%的油脂类成分，含量非常高，包括十六酸、十八酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等。现有技术直接提取挥发油的方法使提取物中含有较多的 上述油脂类物质。而这些油脂类成分添加到卷烟中，会带来比较严重的杂气、刺激和口腔残 留，影响卷烟品质。文献[罗永明，朱英，李斌等，牛蒡子挥发油成分的GC-MS分析，中药材，1997， 20(12) :621-623]将牛蒡子药材粗粉采用水蒸气蒸馏的方法得到牛蒡子挥发油。但水蒸气 蒸馏的方法有以下缺陷1、水蒸气蒸馏由于是高温蒸馏，容易使一些热敏性物质的结构发 生改变或者组分相互之间发生反应，从而改变了天然组分的结构和组成。2、水蒸气蒸馏耗 时较长，能耗较大。3、水蒸气蒸馏方式牛蒡子挥发油得率较低，约为0. 2%。超临界二氧化碳流体做溶剂进行萃取，具有低温萃取和惰性保护的特点，防止了 “敏感性”物质的氧化和逸散以及不同组分之间可能发生的相互反应，使萃取和分离很容易 合二为一，有效地提高了生产效率和节约能耗，在生产过程中可以完全免除任何有毒有害 的有机溶剂，萃取物不含有机溶剂残留，保持了萃取物的全天然性。整个过程不产生“三 废”，不会对环境造成污染。但文献[柳仁民，张坤，崔庆新。牛蒡籽油的超临界二氧化碳流 体萃取研究，聊城师院学报(自然科学版)，2002，15(4) 32-35]证明，采用超临界二氧化碳 流体直接萃取牛蒡子药材粗粉得到牛蒡子油，萃取出的主要是油脂类成分。如上所述，这些 成分都不适合直接应用于卷烟。白地霉(Geotrichum candidum)，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，地霉属， 真菌的一种。菌丝为有横隔的真菌丝，有的为二叉分枝。菌丝宽3 7μπι。菌丝成熟后 断裂成单个或成链、长筒形、末端钝圆的节孢子。节孢子大小为(4. 9 7.6 μ m) X (5. 4 16. 6 μ m)。菌落呈平面扩散，生长快，扁平，乳白色，短绒状或近于粉状，有同心圈可放射线， 有的呈中心突起。能有效分解油脂类物质。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是提供一种白地霉发酵牛 蒡子超临界萃取法提取挥发油的方法，它能既去除对卷烟感官质量不利的油脂类物质，又 能保留对卷烟感官质量有利的挥发油物质，充分地利用了天然药物牛蒡子中的各种有益成 分。所提取的挥发油应用于烟草，可以起到提高烟草产品质量的作用。本发明的技术方案是白地霉发酵牛蒡子超临界萃取法提取挥发油的方法按以下 步骤及条件进行[1]、将中药材牛蒡子粉碎成过100目筛的粗粉，与营养液按20 50 1的质量 比混合均勻后，于115°C下灭菌15 20min ；[2]、将真菌白地霉菌种的活化种子液按照1 10 50的质量比接种到无菌的牛 蒡子粗粉中，搅拌，使粗粉固体与种子液充分混合均勻，将接种好真菌白地霉菌种的牛蒡子 粗粉放置于25 30°C的培养箱中发酵2 7天；[3]、将发酵后的牛蒡子粗粉加入超临界萃取釜中进行超临界萃取，萃取条件为 二氧化碳流体的萃取温度为45 55°C，压力为25 40MPa，二氧化碳的流量30 90kg/h， 副泵中夹带剂流量30 60kg/h ；分离釜的分离温度为35 50°C，压力为8 IOMPa ；萃取 时间为60 120min ；所得浅黄色油状萃取物为牛蒡子挥发油。所述的夹带剂是95%食用乙醇，夹带剂的量为牛蒡子粗粉重量的3-6倍。
所述的分离釜是一个或多个。所述的真菌白地霉菌种的活化种子液按以下步骤及条件进行处理取实验室保 存的真菌白地霉菌种，接种到斜面培养基上，放置于25 30°C的恒温培养箱中培养24 48h，再接种于添加糖源的液体培养基中，于25 30°C恒温培养24 48h，将种子液离心， 弃上清液，沉淀菌体用生理盐水稀释震荡均勻，得到活化的种子液。所述的添加糖源的液体培养基是以下物质的混合液=K2HPO4 lg, MgSO4 · 7H20 0. 5g，蛋白胨 5g，葡萄糖 10g,7jC IOOOmL0所述的营养液是以下物质的混合液蛋白胨lg，葡萄糖2g，NaCl 0. 05g, K2HPO4 0. Olg, MgSO4 · 7H20 0. 05g,/jc 1000mL。一种白地霉发酵牛蒡子超临界萃取法提取挥发油的应用将牛蒡子挥发油用 95%的乙醇稀释成1%，然后按照烟丝重量的0.01 0. 05%添加到烟丝中。本发明的优点采用白地霉发酵能有效降解对卷烟感官质量不利的油脂类成分，生成对卷烟感官 质量有利的具有增加卷烟陈化酸香和降低刺激作用的小分子有机酸类成分，将不利成分转 化为有利成分，提升了牛蒡子挥发油作为卷烟添加剂的品质。发酵后再进行超临界二氧化 碳萃取得到的牛蒡子挥发油在卷烟中的应用效果大大好于不发酵直接进行超临界二氧化 碳萃取得到的牛蒡子挥发油。采用超临界二氧化碳萃取方式，具有低温萃取和惰性保护的特点，防止了 “敏感 性”物质的氧化和逸散以及不同组分之间可能发生的相互反应，使萃取和分离很容易合二 为一，有效地提高了生产效率和节约能耗，在生产过程中可以完全免除任何有毒有害的有 机溶剂，萃取物不含有机溶剂残留，保持了萃取物的全天然性。整个过程不产生“三废”，不 会对环境造成污染。采用超临界二氧化碳萃取发酵后的牛蒡子，挥发油的得率为2. 95%，水蒸气蒸馏 得率为0. 20%，本发明的方法大大优于现有技术的方法。本发明得到的牛蒡子挥发油中有很多与烟草本身含有的香味成分相同或类似的 香味成分，添加到烟丝中能够与烟草本香协调，具有丰富和协调烟香，提升烟草香气质，降 低刺激的效果。尤其是油脂类成分降解后生成的小分子有机酸，能有效的增加烟香和降低 刺激。
具体实施例方式下面结合本发明的实施例对有关技术问题作进一步详细的描述。实施例1取实验室保存的真菌白地霉菌种，接种到斜面培养基上，放置于30°C的 恒温培养箱中培养24h，再接种于添加糖源的液体培养基(K2HPO4Ig, MgSO4 · 7H20 0. 5g，蛋 白胨5g，葡萄糖IOgjK IOOOmL)中，于30°C恒温培养24h，将种子液离心弃上清液，沉淀菌 体用生理盐水稀释震荡均勻，得到活化的种子液。将中药材牛蒡子粉碎成过100目筛的粗粉，与营养液(蛋白胨lg，葡萄糖2g，NaCl 0. 05g,K2HPO4O. OlgjMgSO4 ·7Η20 0. 05g，水 IOOOmL)按20 1 的质量比混合均勻后，于 115°C 下灭菌15min。将处理好的种子液按照1 10的质量比接种到无菌的牛蒡子粗粉中，搅拌，使粗粉固体与种子液充分混合均勻，将接种好的牛蒡子粗粉放置于30°C的培养箱中发酵2天。将发酵后的牛蒡子粗粉加入超临界萃取釜中进行超临界萃取，萃取条件为二氧化 碳流体的萃取温度为45°C，压力为25MPa，二氧化碳的流量30kg/h，副泵中夹带剂95%食用 乙醇流量30kg/h ；分离釜的分离温度为35°C，压力为SMPa ；萃取时间为60min。所得浅黄色 油状萃取物为牛蒡子挥发油。将牛蒡子挥发油用95%的乙醇稀释成1 %的溶液，然后按照烟丝重量的0. 01 %添 加到高档卷烟烟丝中，制作卷烟后按照国标方法评吸。评吸结果为增加卷烟的陈化酸香， 烟香的丰富性明显增加，并具有明显的降低刺激的作用。实施例2取实验室保存的真菌白地霉菌种，接种到斜面培养基上，放置于28°C的 恒温培养箱中培养36h，再接种于添加糖源的液体培养基(K2HPO4Ig, MgSO4 · 7H20 0. 5g，蛋 白胨5g，葡萄糖IOgjK IOOOmL)中，于28°C恒温培养36h，将种子液离心弃上清液，沉淀菌 体用生理盐水稀释震荡均勻，得到活化的种子液。将中药材牛蒡子粉碎成过100目筛的粗粉，与营养液(蛋白胨lg，葡萄糖2g，NaCl 0. 05g,K2HPO4O. OlgjMgSO4 ·7Η20 0. 05g，水 IOOOmL)按30 1 的质量比混合均勻后，于 115°C 下灭菌20min。将处理好的种子液按照1 25的质量比接种到无菌的牛蒡子粗粉中，搅拌，使粗 粉固体与种子液充分混合均勻，将接种好的牛蒡子粗粉放置于28°C的培养箱中发酵5天。将发酵后的牛蒡子粗粉加入超临界萃取釜中进行超临界萃取，萃取条件为二氧化 碳流体的萃取温度为50°C，压力为35MPa，二氧化碳的流量60kg/h，副泵中夹带剂95%食用 乙醇流量45kg/h ；分离釜的分离温度为45°C，压力为8MPa ；萃取时间为60min。所得浅黄色 油状萃取物为牛蒡子挥发油。将牛蒡子挥发油用95%的乙醇稀释成1 %的溶液，然后按照烟丝重量的0. 02%添 加到中档档卷烟烟丝中，制作卷烟后按照国标方法评吸。评吸结果为增加卷烟的陈化酸 香，增加烟气浓度，并具有明显的降低刺激的作用。实施例3取实验室保存的真菌白地霉菌种，接种到斜面培养基上，放置于25°C的 恒温培养箱中培养48h，再接种于添加糖源的液体培养基(K2HPO4Ig, MgSO4 · 7H20 0. 5g，蛋 白胨5g，葡萄糖IOgjK IOOOmL)中，于25°C恒温培养48h，将种子液离心弃上清液，沉淀菌 体用生理盐水稀释震荡均勻，得到活化的种子液。将中药材牛蒡子粉碎成过100目筛的粗粉，与营养液(蛋白胨lg，葡萄糖2g，NaCl 0. 05g，K2HPO4 0. Olg, MgSO4 · 7H20 0. 05g，水 IOOOmL)按 50 1 的质量比混合均勻后，于 115°C下灭菌 20min。将处理好的种子液按照1 50的质量比接种到无菌的牛蒡子粗粉中，搅拌，使粗 粉固体与种子液充分混合均勻，将接种好的牛蒡子粗粉放置于25°C的培养箱中发酵7天。 将发酵后的牛蒡子粗粉加入超临界萃取釜中进行超临界萃取，萃取条件为二氧化碳流体的 萃取温度为55°C，压力为40MPa，二氧化碳的流量90kg/h，副泵中夹带剂95%食用乙醇流量 60kg/h ；分离釜的分离温度为50°C，压力为IOMPa ；萃取时间为120min。所得浅黄色油状萃 取物为牛蒡子挥发油。将牛蒡子挥发油用95%的乙醇稀释成1 %的溶液，然后按照烟丝重量的0. 05%添 加到低档卷烟烟丝中，制作卷烟后按照国标方法评吸。评吸结果为增加卷烟的陈化酸香，掩盖低档卷烟的杂气，并具有明显的降低刺激的作用。经申请人研究，认识到牛蒡子药材中未被利用的这些成分对烟草的感官质量均 具有较好的作用其中，挥发油类物质其中胡薄荷酮含量最高，约占挥发油成分总量的 25%，其它还包括一些萜烯类、小分子的醛酮类和酚类物质，这些物质具有浓郁的香气，是 卷烟调香中经常使用的增加烟香的物质。申请人:认识到白地霉具有的有效分解油脂类物质的性质，因此，考虑采用白地霉 对牛蒡子进行预先发酵，有效降解对卷烟感官不利的油脂类成分，生成对卷烟感官有利的 具有增加卷烟陈化酸香和降低刺激作用的小分子有机酸类成分，将不利成分转化为有利成 分。发明人用气相色谱/质谱联用仪对牛蒡子挥发油进行了成分鉴定，测定条件如 下仪器为Thermo TRACE GC Ultra-DSQ II气质连用仪。气相色谱条件色谱柱 DB-5ms 30X0. 25mmX0. 25μπι ；起始柱温50°C，保持lmin，然后以10°C /min程序升温至 250°C，保持温度IOmin ；进样口温度250°C ；载气He，流速1. Oml/min ；进样量0. 5 μ 1，分流 比100 1。MS条件EI离子源，电子能量70eV，扫描范围35 650amu，离子源温度220°C， 倍增器电压1500V，GC/MS接口 250°C，谱库NIST98。面积归一化方法定量。申请人:对水蒸气蒸馏得到的牛蒡子挥发油、直接超临界萃取得到的挥发油和本发 明的牛蒡子挥发油进行了 GC/MS成分分析对比，结果见表1。表1牛蒡子挥发油成分及相对含量对照表成分名称水蒸气蒸馏得到的挥直接超临界萃取得到本发明得到的挥发油发油各成分相对含量的挥发油各成分相对各成分相对含量(％)
权利要求
1.一种白地霉发酵牛蒡子超临界萃取法提取挥发油的方法，其特征在于所述的方法按 以下步骤及条件进行[1]、将中药材牛蒡子粉碎成过100目筛的粗粉，与营养液按20 50 1的质量比混 合均勻后，于115°C下灭菌15 20min ；[2]、将真菌白地霉菌种的活化种子液按照1 10 50的质量比接种到无菌的牛蒡子 粗粉中，搅拌，使粗粉固体与种子液充分混合均勻，将接种好真菌白地霉菌种的牛蒡子粗粉 放置于25 30°C的培养箱中发酵2 7天；[3]、将发酵后的牛蒡子粗粉加入超临界萃取釜中进行超临界萃取，萃取条件为二氧 化碳流体的萃取温度为45 55°C，压力为25 40MPa，二氧化碳的流量30 90k/h，副泵 中夹带剂流量30 60kg/h ；分离釜的分离温度为35 50°C，压力为8 IOMPa ；萃取时间 为60 120min ；所得浅黄色油状萃取物为牛蒡子挥发油。
2.根据权利要求1所述的白地霉发酵牛蒡子超临界萃取法提取挥发油的方法，其特征 在于所述的夹带剂是95%食用乙醇，夹带剂的量为牛蒡子粗粉重量的3-6倍。
3.根据权利要求1所述的白地霉发酵牛蒡子超临界萃取法提取挥发油的方法，其特征 在于所述的分离釜是一个或多个。
4.根据权利要求1所述的白地霉发酵牛蒡子超临界萃取法提取挥发油的方法，其特征 在于所述的真菌白地霉菌种的活化种子液按以下步骤及条件进行处理取实验室保存的 真菌白地霉菌种，接种到斜面培养基上，放置于25 30°C的恒温培养箱中培养24 48h， 再接种于添加糖源的液体培养基中，于25 30°C恒温培养24 48h，将种子液离心，弃上 清液，沉淀菌体用生理盐水稀释震荡均勻，所得即活化的种子液。
5.根据权利要求4所述的白地霉发酵牛蒡子超临界萃取法提取挥发油的方法，其特征 在于所述的添加糖源的液体培养基是以下物质的混合液K2HP04lg，MgSO4 · 7H20 0. 5g，蛋 白胨 5g，葡萄糖 10g, 7jC IOOOmL0
6.根据权利要求1所述的白地霉发酵牛蒡子超临界萃取法提取挥发油的方法，其特征 在于所述的营养液是以下物质的混合液蛋白胨lg，葡萄糖2g，NaCl 0. 05g, K2HPO4O. Olg, MgSO4 · 7H20 0. 05g，水 IOOOmL0
7.一种白地霉发酵牛蒡子超临界萃取法提取挥发油的应用，其特征在于将牛蒡子挥 发油用95%的乙醇稀释成1%，然后按照烟丝重量的0. 01 0. 05%添加到烟丝中。
全文摘要
本发明公开了一种白地霉发酵牛蒡子超临界萃取法提取挥发油的方法及应用，属于卷烟香料提取技术领域。本发明的方法采用白地霉发酵降解对卷烟感官质量不利的油脂类成分，发酵后再进行超临界二氧化碳萃取得到的牛蒡子挥发油，本发明方法的措施得力，操作简单，容易实施，技术效果显著，提取的挥发油得率高且质量好。本发明得到的牛蒡子挥发油中有很多与烟草相同或类似的香气成分，添加到烟丝中能够与烟草本香协调，具有丰富协调烟香，提升烟草香气质，降低刺激的效果。尤其是油脂类成分降解后生成的小分子有机酸，能有效的增加烟香和降低刺激。
文档编号A24B15/30GK102002428SQ200910063799
公开日2011年4月6日 申请日期2009年9月2日 优先权日2009年9月2日
发明者吴昭, 肜霖, 黄龙 申请人:武汉市黄鹤楼科技园有限公司, 湖北中烟工业有限责任公司